專利名稱：穩(wěn)定的固定化酶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定化技術，涉及一種對諸如環(huán)糊精糖基轉移酶(CGTase)、葡糖淀粉酶(GA)、β-淀粉酶、β-葡糖苷酶(GD)和β-半乳糖苷酶對碳水化合物的作用而能增加至一定程度穩(wěn)定性的固定化酶。
如今對碳水化合物作用的酶廣泛地用于化學工業(yè)上。例如CGTase是一般用于商業(yè)規(guī)模上從淀粉中生產環(huán)糊精的酶。環(huán)糊精是生產籠形包含的化合物所必需的物質。以改善藥物的穩(wěn)定性或掩蓋發(fā)出氣味的物質。因此，將CGTase穩(wěn)定化的技術是具有極高的工業(yè)意義。
GA和β-淀粉酶系日常使用的用于從淀粉中生產葡萄糖或麥芽糖，因此，使GA和β-淀粉酶穩(wěn)定化也有極大的意義。
此外，β-葡糖苷酶是一種在木材糖化中起重要作用的酶并已試圖得到穩(wěn)定的產物等級。
最近在酶反應技術中已取得了顯著的進展，得到了“載然相反”的感覺，特別與較早的包括酶解反應在溶液相內進行的常規(guī)方法相比較，固化酶技術已成為可能且可帶來較好的效果，使酶反應有效地進行且酶用量可以減少。
許多專利申請已公開了關于在固定酶方法中使用聚氨基葡糖珠。例如，日本公開專利Kokai Tokkyo Koho第63-196290號揭示了包括在多孔聚氨基葡糖珠上固定環(huán)糊精糖基轉移酶，然后再用交聯(lián)劑處理珠的技術。
人們對上述酶的有效使用已作了大量的研究。但是，就酶本身穩(wěn)定性而言，研究總是不能令人滿意。在酶被使用時它們逐漸失去了它們的活性。例如，在普通條件下CGTase在幾天后失去了其一半的最初活性，在相當于幾個二十天后幾乎變得無活性了。
甚至對固定化酶而言，一旦它們失去了活性就沒有辦法只得補充新鮮部分。同時，本發(fā)明者以前已發(fā)現在相當少量能穩(wěn)定酶的特定物質(下面稱為“穩(wěn)定劑”)存在下進行酶反應時，該技術問題可得到較好的解決(日本專利申請第033481/1989)。
上述技術確實認識到了酶的穩(wěn)定性，但由于在酶反應中穩(wěn)定劑必須以能與酶呈接觸的狀態(tài)進量，故要求這類穩(wěn)定劑的進料量相當大。此外，在反應完全后必須從反應混合物中回收穩(wěn)定劑。
本發(fā)明的目的是解決上述的技術問題。
本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定的固化酶，它包括一種載體，對碳水化合物作用且可固定于所述載體上的酶，以及一種能與所述酶一起固定在所述載體上的酶穩(wěn)定劑。
本發(fā)明者首次制備了有上述構成的固定化酶。
下面詳細闡述本發(fā)明的構成。
在本發(fā)明中使用的載體可以是任何適合于使對碳水化合物作用的酶固定的載體，在這之中包括聚氨基葡糖珠(它一般是當今用來生產固定化酶)、瓊脂糖樹脂和多孔的剛性合成樹脂。所述的樹脂可呈珠或扁平膜狀組成的形式。
作為可用于本發(fā)明的聚氨基糖珠的典型品位，可提及的是Chitopeael BCW-1000系列的聚氨基糖珠(從Fuji Spinning Co.買到)。
本發(fā)明中使用的瓊脂糖樹脂，可提及的是瓊脂糖凝膠6B(Pharmacia)。
能用于本發(fā)明的剛性合成的多孔樹脂的例子可提及從日本Organo Co.中買到的稱為EF-4611和EF-4612的親水性多孔聚合物。
在本發(fā)明的實際使用中，首先使載體與交聯(lián)劑反應使在載體表面形成活性連接位點，然后使這里特定的酶固定在所述載體的所述位點上，即在交聯(lián)劑的末端上。
根據本發(fā)明的一個方面，穩(wěn)定劑和酶可同時被固定在載體的交聯(lián)劑末端上。
根據本發(fā)明的另一方面，也可以首先使酶固定在載體的交聯(lián)劑末端，然后再使穩(wěn)定劑固定在載體的交聯(lián)劑末端，反過來也可以。
所采用的交聯(lián)劑是環(huán)氧乙烷和其它含有環(huán)氧化物的碳鏈以及其它一般用來制備固定酶的交聯(lián)劑，例如戊二醛等。
當CGTase作為酶的例子時，例如，通過在適當溫度下(例如室溫)將適當載體(例如聚氨基糖珠)加至適當的堿性溶液內(例如0.6N氫氧化鈉)，然后使適當交聯(lián)劑(例如環(huán)氧乙烷)加至適當濃度(例如與堿等當量)，在適當溫度(例如8-50℃)下使所得混合物輕搖適當的時間(例如1-4小時)，過濾混合物，用水洗滌載體，在水中或適當的緩沖液內(例如0.025M乙酸鹽緩沖液，pH6.0)的載體中加入有適當濃度(例如1-500mg/ml)的CGTase溶液和同時加入適當的穩(wěn)定劑(例如葡糖基脫二氧亞胺基葡糖醇)加至適當濃度(例如0.9-1g/ml)，使所得混合物輕搖一段適當時間(例如1-48小時)，然后使混合物過濾，固相用水洗滌，這樣可產生本發(fā)明的穩(wěn)定的固定化酶。
本發(fā)明者首先建立了上述方法。
作為特別適用于本發(fā)明中的穩(wěn)定劑例子，可提及下式化合物及其葡萄糖低聚物衍生物
其中R是氫、低級烷基、羥基烷基、苯烷基、苯鏈烯基、苯炔基、苯氧基烷基、苯氧基鏈烯基或苯氧基炔基，這里每個苯基部分可以是取代苯基或未取代的苯基，X是氫或為軸向或平展的羥基。
例如用日本專利公開第56-099195、60-2038、61-2076和62-242691號揭示的方法可制備現有技術已知的式[Ⅰ]化合物。
上述的葡萄糖低聚物衍生物可由下列代表
其中R的定義同上，n是0-24的整數，式[Ⅰ]和式[Ⅱ]中R表示的低級烷基是，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基。
羥烷基中的烷基部分可含有1-5個碳原子。
苯烷基的烷基部分可含有1-5個碳原子，其苯基部分可以是取代苯基或未取代苯基，苯鏈烯基的鏈基部分可含有2-5個碳原子，其苯基部分可是取代苯基或未取代苯基。
苯炔基的炔基部分可含有2-5個碳子，其苯基部分可是取代苯基或未取代苯基。
苯氧烷基的烷基部分可含有1-5個碳原子，其苯基部分可以是取代苯基或未取代苯基。
苯氧鏈烯基的鏈烯基部分可含有2-5個碳原子，其苯基部分是取代苯基或未取代苯基。
苯氧基炔基的炔基部分可含有2-5個碳原子，其苯基部分是取代苯基或未取代苯基。
除了上述的α-環(huán)糊精外，本發(fā)明所使用的穩(wěn)定劑也可包括半乳糖氧化酶試劑(galactostatin)及其衍生物等。
根據本發(fā)明為了酶的穩(wěn)定化，可以提出的固定化可這樣進行，例如使每克載體吸附1-50mg酶，且相對于每克載體，穩(wěn)定劑的存在量是10μg。穩(wěn)定劑的適當用量視預期的目的而定。
作為下面給出的實施例中，本發(fā)明中穩(wěn)定劑的用量比常規(guī)方法中的用量要少得多，這是本發(fā)明的一個特征。


圖1表示試驗實施例1中所得的穩(wěn)定性試驗結果[●，本發(fā)明實施例1中所得物質的數據;○，是用相同的方法但未加入脫二氧亞胺基葡糖醇制備的物質的數據(作為比較);縱軸，溶液的光密度;橫軸，時間(小時)]。
圖2表示試驗實施例2所得的結果。[●，本發(fā)明實施例1中所得物質的數據;○，用相同方法但未加入脫二氧亞胺基葡糖醇制備所得物質的數據;縱軸，殘留活性百分率;橫軸，溫度(℃)]。
圖3表示試驗實施例3中所得的結果。[●，本發(fā)明實施例2中所得物質的數據;○，用相同的方法但未入N-甲基脫二氧亞胺基葡糖醇比制備所得物質的數據;(作用比較);縱軸，溶液的光密度;橫軸，時間(小時)]。
圖4表示試驗實施例4中所得的結果。[●，本發(fā)明實施例2中所得物質的數據;○，用相同的方法但未加入N-甲基脫二氧亞胺基葡糖醇而制備所得物質的數據，縱軸，殘留活性百分率;橫軸，溫度(℃)]。
圖5表示試驗實施例5所得的結果。[●，本發(fā)明實施例3中所得物質的數據;○，用相同方法但不加入脫二氧亞胺基葡糖醇制備所得的物質的數據;縱軸，溶液的光密度;橫軸，時間(小時)]。
圖6表示試驗實施例6所得的結果。[●，本發(fā)明實施例4所得物質的數據;○，用相同方法但不加入脫二氧亞胺基葡糖醇制備所得物質的數據;縱軸，溶液的光密度;橫軸，時間(小時)]。
圖7表示試驗實施例7的所得的結果[●，本發(fā)明實施例5所得的物質的數據，○，用相同方法但未加入N-(2-羥乙基)脫二氧亞胺基葡糖醇所制得物質的數據;縱軸，溶液的光密度;橫軸，時間(小時)]。
圖8表示試驗實施例8所得的結果。[●，本發(fā)明實施例6所得物質的數據;○，用相同方法但不加入α-環(huán)糊精所制得物質的數據;縱軸，溶液的光密度;橫軸，時間(小時)]。
圖9表示試驗實施例9所得的結果。[●，本發(fā)明實施例6所得物質的數據;○，用相同方法但不加入α-環(huán)糊精所制得物質的數據;縱軸，殘留活性百分率;橫軸，溫度(℃)]。
圖10表示試驗實施例10所得的結果。[●，根據本發(fā)明實施例7所得物質的數據;○，用相同方法但不加入葡糖基脫二氧亞胺基葡糖醇所制得物質的數據;縱軸，殘留活性百分率;橫軸，溫度(℃)]。
圖11表示試驗實施例11所得的結果。[●，根據本發(fā)明實施例8所得物質的數據;○，用相同方法但不加入葡糖基脫二氧亞胺基葡糖醇所制得物質的數據;縱軸，殘留活性百分率;橫軸，溫度(℃)]。
圖12表示試驗實施例12所得的結果。[●，根據本發(fā)明實施例9所得物質的數據;○，用相同的方法但不加入1-脫氧半乳糖氧化酶試劑(1-deoxggalactostatin)所制得物質的數據;縱軸，溶液的光密度;橫軸，時間(小時)]。
圖13表示試驗實施例13所得的結果。[●，根據本發(fā)明實施例9所得物質的數據;○，用相同的方法但不加入1-脫氧半乳糖氧化酶試劑所制得物質的數據;縱軸，殘留活性的百分率;橫軸，溫度(℃)]。
圖14表示試驗實施例14所得的結果。[●，根據本發(fā)明實施例10所得的物質的數據;○，用相似的方法但不加入1，4-dideoxy galaetosatin 1，4-二脫氧半乳糖氧化酶試劑所制得物質的數據;縱軸，溶液的光密度;橫軸，時間(小時)]。
圖15表示試驗實施例15所得的結果。[●，根據本發(fā)明實施例10所得物質的數據;○，用相同方法但不加入1，4-二脫氧半乳糖氧化酶試劑所制得物質的數據;縱軸，殘留活性的百分率;橫軸，溫度(℃)]。
圖16表示試驗實施例16所得的結果。[●，根據本發(fā)明實施例11所得物質的數據;○，用相似方法但不加入葡糖基脫二氧亞胺基葡糖醇所制得物質的數據;縱軸，溶液的光密度;橫縱，時間(小時)]。
圖17表示試驗實施例17所得的結果。[●，根據本發(fā)明實施例11所得物質的數據;○，用相同方法但不加入葡糖基脫二氧亞胺基葡糖醇所制得物質的數據;縱軸，殘留活性的百分率;橫縱，時間(小時)]。
下列實施例進一步闡述了本發(fā)明的穩(wěn)定化的方法。
參比實施例1環(huán)氧活化的瓊脂糖珠將瓊脂糖6B放在玻璃濾器內并抽吸過濾，使濾器上的物質抽吸干燥。向10克這樣干燥的瓊脂糖內加入10毫升環(huán)氧乙烷(Alolrich)和10ml 0.6N氫氧化鈉。在室溫下使混合物輕輕振搖16小時以進行反應。回收珠并用水充分洗滌。這樣所得的珠可用作環(huán)氧活化的瓊脂糖珠。
參比實施例2環(huán)氧活化的聚氨基糖珠將聚氨基糖珠(ψ1.5mm，10ml)放在玻璃濾器內并用水充分洗滌。將環(huán)氧乙烷(10ml)和10ml 0.6N氫氧化鈉加至珠內，在室溫下使混合物輕輕振搖16小時。用該方法進行反應后，珠用水充分洗滌，它可用作環(huán)氧活化的聚氨基糖珠。
實施例1向3克環(huán)氧活化的瓊脂糖珠中加入15ml 0.1N氫氧化鈉并再加入60mg脫二氧亞胺基葡糖醇。在40℃下使混合物輕輕振搖1小時，然后在玻璃濾器用水充分洗滌珠并使之分散于15ml水中，加入60mg粉末狀β-葡糖苷酶(從杏仁中獲得，δ)，在40℃下使混合物輕輕振搖20小時以進行反應。最后所得的結合有脫二氧亞胺基葡糖醇和β-葡糖苷酶瓊脂糖珠充分用水洗滌。
實施例2將環(huán)氧活化的瓊脂珠(2克)分散于10ml水中，向分散液中加入N-甲基脫二氧亞胺基葡糖醇(2克)和40mg β-葡糖苷酶(δ)，在40℃下使混合物輕輕振搖20小時。用玻璃濾器通過過濾回收珠并用水充分洗滌。
實施例3將環(huán)氧活化的瓊脂糖珠(2克)分散于10ml水中，向分散液中加入N-甲基脫二氧亞胺基葡糖醇(500mg)，和30mg葡糖苷酶(由酒曲菌雪白根霉菌中獲得的;Seikagku Kogyo)，在室溫下使混合物輕搖20小時，然后在玻璃濾器上回收珠并用水充分洗滌。
實施例4
使環(huán)氧活化的聚氨基葡糖珠(15ml)分散于10ml水中。向分散液中加入葡糖淀粉酶(從曲霉菌中獲得;Glncozyme NL-3，Amano Pharmaceutical)(50μl)和500mg脫二氧亞胺基葡糖醇。在室溫下使混合物輕搖20小時。反應后，在玻璃濾器上收集珠并用水充分洗滌。
實施例5使環(huán)氧活化的聚氨基葡糖珠(5ml)分散于5ml 0.1N氫氧化鈉中，將1gN-(2-羥乙基)脫二氧亞胺基葡糖醇加至分散液內，在40℃下使混合物輕輕振搖20小時以進行反應。在玻璃濾器上回收珠并用水充分洗滌。將這些珠分散于5ml水中，向分散液中加入1ml葡糖淀粉酶(Amano Pharmaceutical)，在室溫下使混合物輕輕振搖16小時以進行反應，在玻璃濾器上收集珠并用水徹底洗滌。
實施例6向5克環(huán)氧活化的瓊脂糖珠內加入50ml 0.1N氫氧化鈉以分散珠，使3克α-環(huán)糊精溶于分散液中，在40℃下使所得的分散液輕輕振搖24小時。在玻璃濾器上回收珠并用水充分洗滌，然后分散于10ml水中。將葡糖淀粉酶(30mg;Seikgaku Kogyo)溶于分散液中，在40℃下使混合物再輕輕振搖20小時以進行反應，然后在玻璃濾器上收集并用水充分洗滌。
實施例7將環(huán)氧活化聚氨基葡糖珠(10ml)加至10ml 1N氫氧化鈉中，使10克葡糖基脫二氧亞胺基葡糖醇溶于分散液中，在40℃下使混合物輕輕振搖16小時。珠在玻璃濾器上充分洗滌并分散于氫氧化鈉水溶液調至pH10的10ml水中，加入10ml CGTase(從芽孢桿菌嗜熱脂肪芽孢桿菌中獲得，Hayashibara Biochemical Labs)，在40℃下使混合物輕輕振搖6小時。反應后，在玻璃濾器上回收珠并用水充分洗滌。
實施例8
將環(huán)氧活化的聚氨基葡糖珠(10ml)加入至10ml水中，將2.5克葡糖基-N-甲基脫二氧亞胺基葡糖醇溶于該分散液中，再加入0.3毫升CGTase，在40℃下使所得的混合物輕輕振搖16小時以進行反應。然后在玻璃濾器上回收珠并用水充分洗滌。
實施例9將環(huán)氧活化的聚氨基葡糖珠(3ml)加入5ml水中，使250mg 1-脫氧半乳糖氧化酶試劑(l-deoxygalclostatin)和20mg β-半乳糖苷酶(從酒曲菌中獲得;Toyobo)溶于分散液中。在250℃下使混合物輕輕振搖16小時以進行反應。然后在玻璃濾器上回收珠并用水充分洗滌。
實施例10將環(huán)氧活化的聚氨基葡糖珠(3ml)加入至5ml水中，使500mg1，4-二脫氧半乳糖氧化酶試劑(1，4 dideoxyalaetostatin)和20mgβ-半乳糖苷酶(Toyobo)溶于分散液中。在250℃下使混合物輕輕振搖16小時以進行反應。然后在玻璃濾器上回收珠并用水充分洗滌。
實施例11將環(huán)氧活化的聚氨基葡糖珠(3ml)加入至5ml 0.1N氫氧化鈉中進行分散。使葡糖基脫二氧亞胺基葡糖醇溶于分散液中，在370℃下使所得的混合物輕輕振搖16小時以進行反應。在玻璃濾器上回收珠并用水充分洗滌。向珠內加入β-淀粉酶萃取液[5ml;用70ml水萃取10g β-淀粉酶＃500而制得(Amano Pharmaceutical)]，在室溫下使混合物再輕輕振搖16小時以進行反應。然后在玻璃濾器上回收珠并用水充分洗滌。
用如下的方法來評估本發(fā)明的穩(wěn)定的效果。本發(fā)明的珠和對照珠的各自用量是這樣的，即在一般被推薦用來分析酶活力的樣品在37-40℃溫度下進行測定，兩種珠顯示出基本相同程度的活性，同時再將珠轉移至高溫環(huán)境中后，和相應的珠樣品比較各自活性損失情況。
試驗實施例1將根據本發(fā)明實施例1所得的物質(50mg)和用相同方法但不加入脫二氧亞胺基葡糖醇而制得的200mg物質(對照)各自放在相應的試管中并各自分散在10ml 0.12M水楊苷溶液1在0.1M乙酸鹽緩沖液，pH5.0)。在58℃下培養(yǎng)，間隔一定時間重復取樣，用葡萄糖氧化酶方法分析釋放出來的葡萄糖。所得的結果如圖1所示。它表明本發(fā)明的物質的熱穩(wěn)定性優(yōu)于對照物質的熱穩(wěn)定性。
試驗實施例2將根據本發(fā)明實施例1所得的物質(25mg)和用相同方法但不加入脫二氧亞胺基葡糖醇而制得的40mg物質(對照)各自放在相應的試管中，向每個試管中加入750 μl 0.1M乙酸鹽緩沖液，pH5.0)。使試管加熱到40℃-75℃范圍內幾個特定溫度中的一個溫度并加熱30分鐘。加熱后，讓試管冷卻到室溫，向每個試管中加入250 μl 0.12M水楊苷(在0.1M乙酸鹽緩沖液中，pH5.0)。在30℃下反應30分鐘后，用葡萄糖氧化酶方法分析釋放出來的葡萄糖，以及在40℃下加熱處理后所得顏色強度的百分率稱為“殘留活性的百分率”。這樣所得的數據制成如圖2所示的圖。它表示本發(fā)明的物質對熱是穩(wěn)定的。
試驗實施例3將根據本發(fā)明實施例2所得的物質(20mg)和用相似方法但不加入N-甲基脫二氧亞胺基葡糖醇而制得的120mg物質(對照)各自放在相應的試管中且各自分散于10ml 0.12M水楊苷溶液中(在0.1M乙酸鹽緩沖液中，pH5.0)。在58℃下進行培養(yǎng)，間隔一定時間重復取樣，用葡萄糖氧化酶方法來分析釋放出來的葡萄糖。所得的結果制成如圖3所述的圖。它表明本發(fā)明的物質在熱穩(wěn)定性方面比對照的優(yōu)越。
試驗實施例4將根據本發(fā)明實施例2所得的物質(6mg)和用相同方法但不加入N-甲基脫二氧亞胺基葡糖醇而制得的60mg物質(對照)各自放在相應的試管中，向每個試管中加入750 μl 0.1M乙酸鹽緩沖液(pH5.0)，使每個混合物在40℃-75℃范圍內幾個特定溫度中的一個溫度下加熱30分鐘，然后冷卻到室溫。向每個試管中加入250 μl 0.12M水揚苷溶液(在0.1M乙酸鹽緩沖液中，pH5.0)，讓反應在30℃下進行30分鐘，用葡萄糖氧化酶方法分析釋放出來的葡萄糖，在40℃下熱處理后所得的顏色強度百分率作為“殘留活性的百分率”。所得的數據制成如圖4所示的圖。它表明本發(fā)明物質是熱穩(wěn)定的。
試驗實施例5將根據本發(fā)明實施例3所得的物質(60mg)和用相同方法但不加入脫二氧亞胺基葡糖醇而制備的1mg物質(對照)各自放在相應的試管中，向每個試管中加入200 μl 0.021M對-硝基苯基α-D-吡喃葡萄糖苷和800 μl 0.1M乙酸鹽緩沖液(pH6.0)，在55℃下進行培養(yǎng)。過了一定時間后，向每個試管中加入2ml 0.1M碳酸鈉，將混合物在2，000rpm下離心1分鐘，在400nm下測定上清液的光密度。這樣所得的結果如圖5所示。它表示本發(fā)明物質是熱穩(wěn)定的。
試驗實施例6將本發(fā)明實施例4所得的物質(100格令)和用相同方法但不加入脫二氧亞胺基葡糖醇而制得的物質(對照)(1格令)各自放在相應的試管中，向每個試管中加入200 μl 0.021M對-硝基苯基α-D-吡喃(型)葡萄糖苷和800 μl 0.1M乙酸鹽緩沖液(pH6.0)，在60℃下進行培養(yǎng)。過了一定時間后，向每個試管中加入2ml 0.1M碳酸鈉并在400nm下測量光密度。這樣所得的數據制成如圖6所示的圖。它表明本發(fā)明的物質是熱穩(wěn)定的。
試驗實施例7將根據本發(fā)明實施例5所得的物質(3格令)和用相同方法但不加入N-(羥乙基)脫二氧亞胺基葡糖醇而制得的物質(對照)(2格令)各自放在相應的試管中，向每個試管中加入200 μl 0.021M對-硝基苯基α-D-吡喃葡萄糖苷和800 μl 0.1M乙酸鹽緩沖液(pH5.5)并在63℃下進行培養(yǎng)。過了一定時間后，向每個試管中加入2ml 0.1M碳酸鈉，上清液用水適度稀釋，并在400nm下測量光密度。用該方法所得的數據制成如圖7所示的圖。它表明本發(fā)明的物質是熱穩(wěn)定的。
試驗實施例8將本發(fā)明實施例6所得的物質(1.5mg)和用相同方法但不加入α-環(huán)糊精而制得的3mg物質(對照)各自放在相應試管內，向每個試管中加入200 μl 0.021M-對硝基苯基α-D-吡喃(型)葡萄糖苷和800 μl 0.1M乙酸鹽緩沖液(pH6.0)并在55℃下進行培養(yǎng)。過了一定時間后，向每個試管中加入20ml 0.1M碳酸鈉，所得的混合物在2，000rpm下離心1分鐘。在400nm下測定上清液的光密度。這樣所得的結果制成如圖8所示的圖。它表明本發(fā)明的物質是熱穩(wěn)定的。
試驗實施例9將根據本發(fā)明實施例6所得的物質(10mg)和用相同方法但不加入α-環(huán)糊精而制得的20mg物質(對照)各自放入相應試管內，向每個試管內加入1ml 0.05M乙酸鹽緩沖液(pH4.6)，使每個混合物在40-70℃范圍里幾個特定溫度中一個溫度下加熱30分鐘，然后冷卻到室溫。向每個試管中加入1ml 10%麥芽糖溶液。讓反應在40℃下進行20分鐘，然后加入2ml 0.1氫氧化鈉，從所得溶液中取出100 μl部分，用葡萄糖氧化酶方法分析釋放出來的葡萄糖，在40℃下熱處理后所得的顏色強度的百分率作為“殘留活性百分率”。這樣所得的數據如圖9所示。這表明本發(fā)明物質是熱穩(wěn)定的。
試驗實施例10
將根據本發(fā)明實施例7所得的物質(2格令)和用相同方法但不加入葡糖基脫二氧亞胺基葡糖醇來制得的物質(對照)(10格令)各自放入相應的試管中，向每個試管中加入500 μl 0.05M磷酸鹽緩沖液(pH6.2)。使每個試管在幾個特定溫度(60℃-75℃)的一個溫度下加熱30分鐘，然后冷卻至室溫。向試管中加入250 μl α-環(huán)糊精溶液(20mM)和蔗糖(100mM)在0.2M乙酸鹽緩沖液中的溶液(pH4.5)以及加入250 μl葡萄糖淀粉酶[通過使10mg葡萄糖淀粉酶(Seikagaku Kogyo)溶于1.5ml 0.2M乙酸鹽緩沖液(pH4.5)中而制得]。使反應在40℃下進行30分鐘，用葡萄糖氧化酶方法來分析釋放出來的葡萄糖。在40℃下熱處理后所得的顏色強度的百分率被作為“殘留活性的百分率”。這樣所得的數據被制成如圖10所示的圖。它表明本發(fā)明的物質是熱穩(wěn)定的。
試驗實施例11將根據本發(fā)明實施例8所得的物質(500格令)和用相同方法但不加入葡糖基-N-甲基脫二氧亞胺基葡糖醇所制得的物質(50格令)各自放相應的試管中，向每個試管中加入500 μl 0.05M磷酸鹽緩沖液(pH6.2)，使每個試管在幾個特定溫度(60℃-75℃)下的一個溫度下熱加30分鐘。然后冷至室溫。向每個試管中加入250 μl α-環(huán)糊精(20mM)溶液和蔗糖(100mM)在0.2M乙酸鹽緩鹽液(pH4.5)中的溶液250 μl以及250 μl葡萄糖淀粉酶溶液[通過使10mg葡萄糖淀粉酶(Seikagaku Kogyo)溶于1.5ml 0.2M乙酸鹽緩沖液(pH4.5)中而制得了]。讓反應在40℃下進行30分鐘，用葡萄糖氧化酶方法分析釋放出來的葡萄糖。在40℃下熱處理后所得的顏色強度百分率被稱為“殘留活性百分率”。這樣所得的數據如圖11所示。這表明本發(fā)明的物質是熱穩(wěn)定的。
試驗實施例12
將根據本發(fā)明實施例9所得的物質(1格令)和用相同方法但不加入1-脫氧半乳糖氧化酶試劑，所制得的物質(對照)(1格令)各自放在相應的試管內，向每個試管中加入1.5ml 0.02M鄰-硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷(在0.1M乙酸鹽緩沖液中，pH5.0)使每個混合物在65℃下培養(yǎng)，經過一定時間后，向每個試管中加入2ml 0.2M碳酸鈉。根據所形成的顏色強度，使對照混合物進一步用水稀釋10倍。在420nm處測定光密度。這樣所得的結果如圖12所示。它表明本發(fā)明的物質是熱穩(wěn)定的。
試驗實施例13將根據本發(fā)明實施例9所得的物質(1格令)和用相同方法但不加入1-脫氧基半乳糖氧化酶試劑。所制得的物質(對照)(1格令)各自放入相應的試管中，向每只試管中加入1.5ml 0.1M乙酸鹽緩沖液(pH5.0)，使每只試管在(50-70℃)的幾個特定溫度中的一個溫度下加熱30分鐘，然后冷至室溫。向每個試管中加入500 μl 0.02M鄰-硝基苯基 β-吡喃半乳糖苷溶液(在0.1M乙酸鹽緩沖液中，pH5.0)，讓反應在37℃下進行15分鐘。向每個試管中加入0.2M碳酸鈉(2ml)在420nm處測定其光密度。在50℃下熱處理后所得的顏色強度的百分率作為“殘留活性的百分率”。所得的結果如圖13所示。它表明本發(fā)明的物質是熱穩(wěn)定的。
試驗實施例14將本發(fā)明實施例10所得的物質(8格令)和用相似方法但不加入1，4-二脫氧半乳糖氧化酶試劑所制得的物質(對照)(1格令)各自放入相應的試管內，向每個試管中加入500 μl 0.02M鄰-硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷溶液(在0.1M乙酸鹽緩沖液中，pH5.0)和15ml 0.1M乙酸鹽緩沖液(pH5.0)。使每個試管在65℃下培養(yǎng)，經過一定時間后，向試管內加入2ml 0.2M的碳酸鈉，在420nm處測定其光密度。在光密度測量前根據所產生的顏色深度，用水使對照樣品稀釋10倍。這樣所得的結果如圖14所示。它表明本發(fā)明的物質是熱穩(wěn)定的。
試驗實施例15將本發(fā)明實施例10所得的物質(8格令)和用相似方法但不加入1，4-二脫氧基半乳糖氧化酶試劑所制得的物質(對照)(1格令)各自放入相應的試管中，向每個試管加入1.5ml 0.1M乙酸鹽緩沖液(pH5.0)，使每個試管在(50-70℃)的幾個特定溫度中的一個溫度下加熱30分鐘，然后冷卻至室溫，向每個試管中加入500 μl 0.02M鄰-硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷溶液(在0.1M乙酸鹽緩沖液中，pH5.0)。讓反應在37℃下進行15分鐘后，向試管中加入2 μl 0.M磷酸鈉，在420nm處測量其光密度。在50℃下熱處理后所得的顏色強度的百分率被作為“殘留活性百分率”。所得的結果如圖15所示。它表明本發(fā)明的物質是熱穩(wěn)定的。
試驗實施例16將本發(fā)明實施例11所得的物質(2格令)和用相同的方法但不加入葡糖基二氧亞胺基葡糖醇所制得的物質(10格令)(對照)各自放在相應的試管中，向每個試管中加入2.5ml 0.02M乙酸鹽緩沖液(pH4.8)和2.5ml 10%可溶性淀粉溶液。在65℃下進行培養(yǎng)，每間隔一定時間取出50 μl部分的樣品，向每個樣品中加入3，5-二硝基水楊酸溶液(500 μl)使混合物在沸水浴中加熱5分鐘，用水冷卻，接著再加入5ml水。經充分攪拌后，在535mm處測量所得混合物的光密度。這樣所得的結果如圖16所示。它表明本發(fā)明的物質是熱穩(wěn)定的。
試驗實施例17將本發(fā)明實施例11所得的物質(5格令)和用相似方法但不加入葡糖基脫二氧亞胺基葡糖醇所制得的物質(對照)(10格令)各自放入相應試管內，向每個試管中加入250 μl 0.02M乙酸鹽緩沖液(pH4.8)在(50-75℃)的幾個特定溫度中的一個溫度下加熱30分鐘，然后冷卻至室溫。向每個試管中加入250 μl 1%可溶性淀粉溶液，然后再在30℃下加熱30分鐘以進行反應。然后向混合物中加入1ml 3，5-二硝基水楊酸溶液，使混合物在沸水浴上加熱5分鐘。用水冷卻后，加入4.5ml水，充分攪拌所得的混合物，在53mm處測量光密度。在50℃下顏色強度的百分率是被作為“殘留活性的百分率”。這樣所得的數據制成如圖17所示的圖。它表明本發(fā)明的物質是熱穩(wěn)定的。
權利要求
1.一種穩(wěn)定的固定化酶，其特征在于它包括載體、對碳水化合物作用且固定在所述載體上的酶以及能穩(wěn)定所述的酶的物質，共同地固定在所述載體上。
2.根據權利要求1所述的一種穩(wěn)定的固定化酶，其特征在于其中的穩(wěn)定物質是下式化合物或其葡萄糖低聚物衍生物
其中R是氫、低級烷基、羥烷基、苯烷基、苯烯基、苯炔基、苯氧基烷基、苯氧基烯基或苯氧基炔基，這里每個苯基部分可以是取代的苯基或未取代苯基，X是氫或是軸向的或平展的羥基。
3.根據權利要求1所述的一種穩(wěn)定的固定化酶，其特征在于其中的酶穩(wěn)定物質是α-環(huán)糊精。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定的固定化酶，它包括載體、對碳水化合物作用且固定在所述載體上的酶以及能穩(wěn)定所述酶的物質，共同地固定在所述載體上，其中的穩(wěn)定化合物是下式化合物或其葡萄糖低聚物衍生物。
文檔編號C12N11/00GK1051587SQ9010888
公開日1991年5月22日 申請日期1990年10月31日 優(yōu)先權日1989年11月1日
發(fā)明者丸尾重昭, 宮崎克憲, 山田直義, 江連洋治 申請人:日本新藥株式會社