專利名稱：一種聚合物基材表面固定化酶的方法
CN 102925425 A書明說1/6頁一種聚合物基材表面固定化酶的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于固定化酶制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及可見光引發(fā)的聚合物基材表面固定化酶方法。
背景技術(shù)：
利用酶為催化劑的化學(xué)反應(yīng)具有催化效率高、底物選擇性高、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，是實(shí)現(xiàn)綠色化學(xué)、可持續(xù)發(fā)展的重要技術(shù)手段之一。但是，游離酶也存在易變性的缺點(diǎn)， 在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、紫外線等環(huán)境下易失去催化活性，并且在反應(yīng)后不易分離，不僅污染產(chǎn)物，也因不能重復(fù)利用而使成本提高，不利于其實(shí)際應(yīng)用。為了解決這一難題，可以對游離酶進(jìn)行固定化。酶的固定化使酶易于與產(chǎn)物分離，能夠回收以重復(fù)利用，并可提高酶的穩(wěn)定，因此能較好滿足工業(yè)應(yīng)用需求。目前常用的固定酶方法主要有共價鍵合法，物理吸附法，交聯(lián)法和包埋法。包埋法與物理吸附法相比對酶具有更強(qiáng)的結(jié)合力，與共價鍵合法和交聯(lián)法相比固定條件更加溫和，適用于酶的范圍更廣，在酶固定技術(shù)中具有獨(dú)特的優(yōu)勢。近年來，以聚合物凝膠為載體的酶固定技術(shù)成為熱點(diǎn)，并被用于生物催化、生化檢測等諸多領(lǐng)域。但是，聚合物凝膠普遍存在機(jī)械強(qiáng)度較低的缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中很容易被破壞而喪失其功能。因此，將凝膠接枝在機(jī)械強(qiáng)度較高的基材上，制備具有支撐基質(zhì)的凝膠膜成為一種新型的制備高性能凝膠材料的方法。接枝凝膠膜具有與表面接枝聚合物刷相似的特點(diǎn)，并且與后者相比，前者具有更多的優(yōu)勢。首先，表面三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以通過更多的連結(jié)點(diǎn)與基材鍵接，而接枝聚合物刷每條鏈只有一個與基材相連的共價鍵，因此表面三維網(wǎng)絡(luò)更加穩(wěn)定。 其次，凝膠膜能夠?qū)谋砻孢M(jìn)行改性，以較少的接枝位點(diǎn)達(dá)到聚合物刷密接枝才能產(chǎn)生的改性效果，對基材的覆蓋更加均勻。
目前有多種方法制備以聚合物為基材的凝膠復(fù)合膜。Rubira等用鉻酸氧化法在低密度聚乙烯表面引入了羧基，又通過羧基與乙二胺反應(yīng)引入了氨基，再進(jìn)一步使氨基與聚丙烯酸的羧基發(fā)生縮合反應(yīng)最終形成了凝膠膜，通過控制反應(yīng)條件可以制備出納米到微米厚的凝膠膜(Applied Surface Science, 2009, 255, 6345-6354)。Harmon 等 (Macromolecules, 2002, 35,5999-6004)和 Varvarenko 等(Reactive & Functional Polymers, 2010, 70 647-655)借鑒合成表面聚合物刷所用到的“graft from”方法,提出了類似的接枝凝膠膜的方法即先將引發(fā)劑固定在基材表面，再在適當(dāng)條件(紫外光輻照、 加熱等)下引發(fā)表面的單體和交聯(lián)劑溶液聚合，形成凝膠薄膜。雖然上述方法得到的復(fù)合膜具有凝膠(載體)和基材(機(jī)械強(qiáng)度高)的雙重優(yōu)點(diǎn)，但是卻并不適于酶的包埋，主要是由于上述反應(yīng)條件苛刻，所用到的高溫、高能量的紫外光會導(dǎo)致酶變性而失活。基于光聚合的基本原理，楊萬泰發(fā)現(xiàn)，在聚合物表面引入休眠基，在可見光照射下可以引發(fā)乙烯基單體可控接枝聚合，從而在表面引入聚合物接枝鏈。但是，相關(guān)的專利(楊萬泰等，CN101307122A)和論文(Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry, 47, 6852,2009)并沒有涉及可見光引發(fā)交聯(lián)聚合制備凝膠/基材復(fù)合膜用于酶固定的內(nèi)容。
因此，有必要設(shè)計出一種簡單、條件溫和的方法制備凝膠/基材復(fù)合膜，以實(shí)現(xiàn)對3游離酶的有效包埋。發(fā)明內(nèi)容
為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的是提供一種可見光引發(fā)的聚合物基材表面接枝凝膠層原位固定游離酶的方法。該方法操作簡單，條件溫和，能夠在制備凝膠/基材復(fù)合膜的同時實(shí)現(xiàn)對游離酶的有效包埋。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明按照以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
(I)用光引發(fā)劑的溶液浸潰或涂覆在聚合物基材表面或?qū)⒐庖l(fā)劑的溶液夾在聚合物材料之間形成“三明治”型結(jié)構(gòu)，使聚合物基材吸附光引發(fā)劑或?qū)Ω采w光引發(fā)劑溶液的聚合物表面進(jìn)行紫外光照射引入半頻哪醇休眠基。
(2)在可見光照射下，光引發(fā)劑或休眠基團(tuán)產(chǎn)生自由基，引發(fā)含有游離酶的可聚合溶液進(jìn)行可控交聯(lián)聚合反應(yīng)，最終將酶固定在表面交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中。
所述光弓I發(fā)劑為硫雜蒽酮、氧雜蒽酮或兩者的衍生物。
所述的聚合物基材為聚合物鏈含有碳一氫鍵的能夠進(jìn)行光引發(fā)劑奪氫反應(yīng)的有機(jī)材料。包括低密度聚乙烯LDPE、高密度聚乙烯HDPE、流延聚丙烯CPP、雙向拉伸聚丙烯 Β0ΡΡ、聚對苯二甲酸乙二醇酯PET、聚對苯二甲酸丁二醇酯PBT、聚酰胺PAM、聚氯乙烯PVC、 聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、聚馬來酸酐PMA、聚碳酸酯PC、聚己內(nèi)酯PCL、纖維素、纖維素酯、酚醛樹脂或環(huán)氧樹脂。
所述的聚合物選自聚合物片材、多孔膜，紡織品和非織造織物。
所用可見光或紫外光的設(shè)備，為低壓、中壓、高壓汞燈，碘鎢燈或氙燈。
所述含有游離酶的可聚合溶液組成如下單烯類單體質(zhì)量百分含量為0%_10%，交聯(lián)劑質(zhì)量百分含量為10%-90%，酶質(zhì)量百分含量為O. 05%-5%，余量為溶劑。游離酶可以是單酶，也可以是復(fù)酶。
所述單體包括丙烯酸AA，甲基丙烯酸MAA，丙烯酰胺AM，甲基丙烯酸縮水甘油酯 GMA,甲基丙烯酸羥乙酯HEMA，乙烯基吡啶VP或乙烯基吡咯烷酮NVP ;交聯(lián)劑包括聚乙二醇雙丙烯酸酯PEGDA，聚乙二醇雙甲基丙烯酸酯PEGDMA，亞甲基雙丙烯酰胺MDA，二乙二醇二丙烯酸酯DEGDA，二乙二醇二甲丙烯酸酯DEGDMA或三羥甲基丙烷三丙烯酸酯TMPTA。
可見光照射下具體條件為(波長420nm處光強(qiáng)為1600-5000 μ ff/cm2),照射1-2小時后取樣。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1)酶的固定化在低溫/室溫、可見光下進(jìn)行，反應(yīng)條件溫和， 有利于酶活性的保持。2)接枝交聯(lián)聚合呈可控/活性特征，能夠得到網(wǎng)孔大小均勻和可調(diào)的交聯(lián)結(jié)構(gòu)。并且凝膠網(wǎng)絡(luò)具有三維結(jié)構(gòu)，可以通過增大厚度提高酶的包埋量。3)凝膠/ 基材復(fù)合結(jié)構(gòu)提高了交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的機(jī)械強(qiáng)度，克服了凝膠網(wǎng)絡(luò)易被破壞的缺點(diǎn)，不僅提高了酶的穩(wěn)定性，也實(shí)現(xiàn)了酶的回收再利用。
以下結(jié)合實(shí)例詳述本發(fā)明。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I :
將LDPE膜用丙酮(抽提及洗滌溶液)抽提72小時，室溫晾干。將BOPP膜覆蓋于LDPE膜上方，取50 μ L異丙基硫雜蒽酮的丙酮溶液(濃度為O. 5Μ)注入雙層聚合物之間， 然后用兩片石英片將雙層聚合物壓實(shí)，異丙基硫雜蒽酮丙酮溶液均勻分布在雙層聚合物之間，形成三明治結(jié)構(gòu)，移入高壓汞燈輻照裝置(波長254nm處光強(qiáng)為9000 μ ff/cm2)中室溫下照射180秒。將已引入能夠繼續(xù)引發(fā)自由基聚合休眠基的LDPE膜用丙酮抽提I小時，去除表面吸附的異丙基硫雜蒽酮，在室溫下晾干。將聚乙二醇雙丙烯酸酯(分子量575)和葡萄糖酶共同溶于PH = 7. O的磷酸鹽緩沖溶液中，其中聚乙二醇雙丙烯酸酯的質(zhì)量百分含量為 20%，葡萄糖酶的質(zhì)量百分含量為O. 1%。取20 μ L的上述含酶溶液注入BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之間，其中BOPP膜位于三明治結(jié)構(gòu)上方，然后用兩片石英片壓實(shí)，移入氙燈輻照裝置(波長420nm處光強(qiáng)為2000 μ ff/cm2)室溫下照射I小時后取樣。將得到的載酶復(fù)合膜用去離子水沖洗表面后冷凍干燥，4°C冰箱中保存。
采用滴定法測量酶活，取面積為4X4cm2的載葡萄糖氧化酶復(fù)合膜(或游離酶)于錐形瓶中，加入25mL 2%葡萄糖磷酸緩沖液(pH = 5. 6)，于30°C恒溫振蕩反應(yīng)I小時，立即加入20mL O. IM氫氧化鈉溶液終止反應(yīng)，用滴定法測定葡萄糖酸的含量?？瞻自囼?yàn)加沒有固定酶的凝膠復(fù)合膜。酶活力單位IU定義為每分鐘催化葡萄糖氧化生成I μ mo I葡萄糖酸所需的酶量。固定化酶的活力回收率定義為固定化酶的活力與用于固定化的游離酶的總活力之比。經(jīng)測定固定化酶的活力保持率為80. 3%，固定酶的凝膠復(fù)合膜重復(fù)使用三次酶的活力沒有損失。
對比實(shí)施例I :
其余實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例1，不同之處為接枝包埋時所用氙燈改為功率1000W的高壓汞燈，輻照時間為3分鐘。經(jīng)測定葡萄糖氧化酶的活力保持率為2. 1%，說明紫外輻照對酶的活性有明顯破壞作用
實(shí)施例2
將LDPE膜用丙酮(抽提及洗滌溶液)抽提72小時，室溫晾干。將BOPP膜覆蓋于 LDPE膜上方，取20 μ L異丙基硫雜蒽酮的丙酮溶液(濃度為O. 3Μ)注入雙層聚合物之間， 然后用兩片石英片將雙層聚合物壓實(shí)，異丙基硫雜蒽酮丙酮溶液均勻分布在雙層聚合物之間，形成三明治結(jié)構(gòu)，移入中壓汞燈輻照裝置(波長254nm處光強(qiáng)為5000μ W/cm2)中室溫下照射150秒。將已引入能夠繼續(xù)引發(fā)自由基聚合休眠基的LDPE膜用丙酮抽提I小時，去除表面吸附的異丙基硫雜蒽酮，在室溫下晾干。將聚乙二醇雙丙烯酸酯(分子量575)、丙烯酰胺和葡萄糖酶共同溶于PH = 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液中，其中聚乙二醇雙丙烯酸酯的質(zhì)量百分含量為30%，丙烯酰胺的質(zhì)量百分含量為1%，葡萄糖酶的質(zhì)量百分含量為5%。取20 μ L 的上述含酶溶液注入BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之間，其中BOPP膜位于三明治結(jié)構(gòu)上方，然后用兩片石英片壓實(shí)，移入氙燈輻照裝置(波長420nm處光強(qiáng)為3000 μ W/cm2)，室溫下照射2小時后取樣。將得到的載酶復(fù)合膜用去離子水沖洗表面后冷凍干燥，4°C冰箱中保存。
酶活測定方法同實(shí)施例I。經(jīng)測定固定化酶的活力保持率為75. 6%，固定酶的凝膠復(fù)合膜重復(fù)使用三次酶的活力沒有損失。
實(shí)施例3
將LDPE膜用丙酮(抽提及洗滌溶液)抽提72小時，室溫晾干。將BOPP膜覆蓋于 LDPE膜上方，取30 μ L異丙基硫雜蒽酮的丙酮溶液(濃度為O. 5Μ)注入雙層聚合物之間， 然后用兩片石英片將雙層聚合物壓實(shí)，異丙基硫雜蒽酮丙酮溶液均勻分布在雙層聚合物之間，形成三明治結(jié)構(gòu)，移入中壓汞燈輻照裝置(波長254nm處光強(qiáng)為5000 μ ff/cm2)中室溫下照射200秒。將已引入能夠繼續(xù)引發(fā)自由基聚合休眠基的LDPE膜用丙酮抽提I小時，去除表面吸附的異丙基硫雜蒽酮，在室溫下晾干。將聚乙二醇雙丙烯酸酯(分子量575)、甲基丙烯酸羥乙酯和葡萄糖酶共同溶于pH = 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液中，其中聚乙二醇雙丙烯酸酯的質(zhì)量百分含量為80%，甲基丙烯酸羥乙酯的質(zhì)量百分含量為10%，葡萄糖酶的質(zhì)量百分含量為I. 5%。取25 μ L的上述含酶溶液注入BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之間，其中BOPP 膜位于三明治結(jié)構(gòu)上方，然后用兩片石英片壓實(shí)，移入氙燈輻照裝置(波長420nm處光強(qiáng)為 3000μ W/cm2)，室溫下照射2小時后取樣。將得到的載酶復(fù)合膜用去離子水沖洗表面后冷凍干燥，4°C冰箱中保存。
酶活測定方法同實(shí)施例I。經(jīng)測定固定化酶的活力保持率為73. 1%，固定酶的凝膠復(fù)合膜重復(fù)使用三次酶的活力沒有損失。
實(shí)施例4
將CPP膜用丙酮(抽提及洗滌溶液)抽提72小時，室溫晾干。將BOPP膜覆蓋于CPP 膜上方，取30 μ L異丙基硫雜蒽酮的丙酮溶液(濃度為O. 5Μ)注入雙層聚合物之間，然后用兩片石英片將雙層聚合物壓實(shí)，異丙基硫雜蒽酮丙酮溶液均勻分布在雙層聚合物之間，形成三明治結(jié)構(gòu)，移入低壓汞燈輻照裝置(波長254nm處光強(qiáng)為4000 μ W/cm2)中室溫下照射 240秒。將已引入能夠繼續(xù)引發(fā)自由基聚合休眠基的CPP膜用丙酮抽提I小時，去除表面吸附的異丙基硫雜蒽酮，在室溫下晾干。將聚乙二醇雙丙烯酸酯(分子量1000)、脲酶共同溶于 pH = 6.0，的磷酸鹽緩沖溶液中，其中聚乙二醇雙丙烯酸酯的質(zhì)量百分含量為10%，脲酶的質(zhì)量百分含量為O. 5%。取10 μ L的上述含酶溶液注入BOPP膜和接有休眠基的CPP膜之間， 其中BOPP膜位于三明治結(jié)構(gòu)上方，然后用兩片石英片壓實(shí)，移入氙燈輻照裝置(波長420nm 處光強(qiáng)為5000 μ ff/cm2), IO0C下照射2小時后取樣。將得到的載酶復(fù)合膜用去離子水沖洗表面后冷凍干燥，4°C冰箱中保存。
酶活測定方法取面積為4 X 4cm2的載脲酶復(fù)合膜(或一定量游離酶)，加入過量標(biāo)準(zhǔn)尿素溶液及Tris-鹽酸緩沖液，在pH = 7和30°C下恒溫反應(yīng)30min，用分光光度法測定尿素溶液濃度。每分鐘釋放Iymol的氨所需的酶量I個活力單位(U)。經(jīng)測定固定化脲酶的活力保持率為84. 6%，固定酶的凝膠復(fù)合膜重復(fù)使用三次酶的活力沒有損失。
實(shí)施例5
將PET膜用丙酮(抽提及洗滌溶液)抽提72小時，室溫晾干。將BOPP膜覆蓋于PET 膜上方，取25 μ L的氧雜蒽酮的丙酮溶液(濃度為O. 3Μ)注入雙層聚合物之間，然后用兩片石英片將雙層聚合物壓實(shí)，氧雜蒽酮丙酮溶液均勻分布在雙層聚合物之間，形成三明治結(jié)構(gòu)，移入高壓汞燈輻照裝置(波長254nm處光強(qiáng)為7000 μ ff/cm2)中室溫下照射90秒。將已引入能夠繼續(xù)引發(fā)自由基聚合休眠基的PET膜用丙酮抽提I小時，去除表面吸附的氧雜蒽酮，在室溫下晾干。將聚乙二醇雙甲基丙烯酸酯(分子量700)、脲酶共同溶于pH = 6.8，的磷酸鹽緩沖溶液中，其中聚乙二醇雙甲基丙烯酸酯的質(zhì)量百分含量為30%，脲酶的質(zhì)量百分含量為O. 4%。取30 μ L的上述含酶溶液注入BOPP膜和接有休眠基的PET膜之間，其中BOPP 膜位于三明治結(jié)構(gòu)上方，然后用兩片石英片壓實(shí)，移入碘鎢燈輻照裝置(波長420nm處光強(qiáng)為3000 μ ff/cm2), 5°C下照射2小時后取樣。將得到的載酶復(fù)合膜用去離子水沖洗表面后冷凍干燥，4°C冰箱中保存。
酶活測定方法同實(shí)施例3，經(jīng)測定固定化脲酶的活力保持率為80. 2%，固定酶的凝膠復(fù)合膜重復(fù)使用三次酶的活力沒有損失。
實(shí)施例6
將尼龍微濾膜(平均孔徑400nm)用丙酮(抽提及洗滌溶液)抽提72小時，室溫晾干。取兩片BOPP膜置于尼龍微濾膜上方和下方，另取20 μ L氧雜蒽酮的丙酮溶液(濃度為 O. 4Μ)注入BOPP和尼龍微濾膜之間，然后用兩片石英片將多層聚合物壓實(shí)，氧雜蒽酮丙酮溶液均勻分布在聚合物之間，形成三明治結(jié)構(gòu)，移入低壓汞燈輻照裝置(波長254nm處光強(qiáng)為6000 μ ff/cm2)中室溫下照射300秒。將已引入能夠繼續(xù)引發(fā)自由基聚合休眠基的BOPP 膜用丙酮抽提I小時，去除表面吸附的氧雜蒽酮，在室溫下晾干。將聚乙二醇雙甲基丙烯酸酯(分子量1000)和葡萄糖酶共同溶于pH = 8. O的磷酸鹽緩沖溶液中，其中聚乙二醇雙甲基丙烯酸酯的質(zhì)量百分含量為15%，葡萄糖酶的質(zhì)量百分含量為O. 5%。取40 μ L的上述含酶溶液注入BOPP膜和接有休眠基的尼龍微濾膜之間，其中BOPP膜位于三明治結(jié)構(gòu)上方，然后用兩片石英片壓實(shí)，移入碘鎢燈輻照裝置(波長420nm處光強(qiáng)為5000 μ ff/cm2),室溫下照射I小時后取樣。將得到的載酶復(fù)合膜用去離子水沖洗表面后冷凍干燥，4°C冰箱中保存。
酶活測定方法同實(shí)施例I。經(jīng)測定固定化酶的活力保持率為74. 9%，固定酶的凝膠復(fù)合膜重復(fù)使用三次酶的活力沒有損失。
實(shí)施例7
將棉布完全浸入氧雜蒽酮的丙酮溶液(濃度為O. 4M) 30秒，取出并在室溫下晾干， 得到表面吸附光引發(fā)劑的棉布。將聚乙二醇雙丙烯酸酯(分子量575)和葡萄糖酶共同溶于 pH = 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液中，其中聚乙二醇雙丙烯酸酯的質(zhì)量百分含量為20%，葡萄糖酶的質(zhì)量百分含量為O. 5%。取30 μ L的上述含酶溶液注入BOPP膜和上述表面吸附氧雜蒽酮的棉布之間，其中BOPP膜位于三明治結(jié)構(gòu)上方，然后用兩片石英片壓實(shí)，移入氙燈輻照裝置(波長420nm處光強(qiáng)為1600 μ W/cm2)，室溫下照射3小時后取樣。將得到的載酶復(fù)合材料用去離子水沖洗表面后冷凍干燥，4°C冰箱中保存。
酶活測定方法同實(shí)施例I。經(jīng)測定固定化酶的活力保持率為71. 1%，固定酶的凝膠復(fù)合材料重復(fù)使用三次酶的活力沒有損失。
實(shí)施例8
將LDPE膜用丙酮(抽提及洗滌溶液)抽提72小時，室溫晾干。將BOPP膜覆蓋于 LDPE膜上方，取30 μ L異丙基硫雜蒽酮的丙酮溶液(濃度為O. 5Μ)注入雙層聚合物之間， 然后用兩片石英片將雙層聚合物壓實(shí)，異丙基硫雜蒽酮丙酮溶液均勻分布在雙層聚合物之間，形成三明治結(jié)構(gòu)，移入高壓汞燈輻照裝置(波長254nm處光強(qiáng)為8000 μ ff/cm2)中室溫下照射180秒。將已引入能夠繼續(xù)引發(fā)自由基聚合休眠基的LDPE膜用丙酮抽提I小時，去除表面吸附的異丙基硫雜蒽酮，在室溫下晾干。將聚乙二醇雙丙烯酸酯(分子量575)和脂肪酶(豬胰)共同溶于PH = 7. O的磷酸鹽緩沖溶液中，其中聚乙二醇雙丙烯酸酯的質(zhì)量百分含量為20%，脂肪酶(豬胰)質(zhì)量百分含量為O. 3%。取10 μ L的上述含酶溶液注入BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之間，其中BOPP膜位于三明治結(jié)構(gòu)上方，然后用兩片石英片壓實(shí)， 移入氙燈輻照裝置(波長420nm處光強(qiáng)為2600 μ ff/cm2),室溫下照射I. 5小時后取樣。將得到的載酶復(fù)合膜用去離子水沖洗表面后冷凍干燥，4°C冰箱中保存。
酶活力測定50mL錐形瓶中加入4mL 4%的聚乙烯醇(聚合度1750±50)橄欖油7乳化液和5mL O. 025mol/L pH = 7. O緩沖液，然后加入面積為4 X 4cm2的載脂肪酶復(fù)合膜 (或游離酶)，37°C反應(yīng)15min后，加入15mL 95%乙醇終止反應(yīng)，用O. 05mol/L NaOH溶液滴定，以酚酞為指示劑。每分鐘催化脂肪水解產(chǎn)生Iug分子脂肪酸的酶量定義為一個國際單位(U)。經(jīng)測定固定化酶的活力保持率為65. 2%，固定酶的凝膠復(fù)合膜重復(fù)使用三次酶的活力沒有損失。
實(shí)施例9
將LDPE膜用丙酮(抽提及洗滌溶液)抽提72小時，室溫晾干。將BOPP膜覆蓋于 LDPE膜上方，取20 μ L異丙基硫雜蒽酮的丙酮溶液(濃度為O. 5Μ)注入雙層聚合物之間， 然后用兩片石英片將雙層聚合物壓實(shí)，異丙基硫雜蒽酮丙酮溶液均勻分布在雙層聚合物之間，形成三明治結(jié)構(gòu)，移入高壓汞燈輻照裝置(波長254nm處光強(qiáng)為8000 μ ff/cm2)中室溫下照射180秒。將已引入能夠繼續(xù)引發(fā)自由基聚合休眠基的LDPE膜用丙酮抽提I小時，去除表面吸附的異丙基硫雜蒽酮，在室溫下晾干。將聚乙二醇雙丙烯酸酯(分子量575)、葡萄糖氧化酶、辣根過氧化物酶共同溶于pH = 7. O的磷酸鹽緩沖溶液中，其中聚乙二醇雙丙烯酸酯的質(zhì)量百分含量為30%，葡萄糖氧化酶質(zhì)量百分含量為O. 1%、辣根過氧化物酶質(zhì)量百分含量為O. 2%。取15 μ L的上述含酶溶液注入BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之間，其中 BOPP膜位于三明治結(jié)構(gòu)上方，然后用兩片石英片壓實(shí)，移入氙燈輻照裝置(波長420nm處光強(qiáng)為3500 μ ff/cm2),室溫下照射2小時后取樣。將得到的載酶復(fù)合膜用去離子水沖洗表面后冷凍干燥，4°C冰箱中保存。
取40 μ L —定濃度的葡萄糖溶液加入到4 mL 4_氨基安替吡啉(O. 05mg/mL)和苯酚(O. lmg/mL)溶液中，在37°C的振蕩培養(yǎng)箱中恒溫半小時后將2X2cm2大小的包埋有酶的復(fù)合膜加入其中，監(jiān)測505nm處的吸光度。載酶膜檢測不同濃度葡萄糖時溶液吸光度和葡萄糖濃度可保持非常好的線性關(guān)系，線性相關(guān)度為O. 9996，其最低檢測葡萄糖濃度可到 Immol /I, η
實(shí)施例10
將CPP膜用丙酮(抽提及洗滌溶液)抽提72小時，室溫晾干。將BOPP膜覆蓋于CPP 膜上方，取30 μ L異丙基硫雜蒽酮的丙酮溶液(濃度為O. 3Μ)注入雙層聚合物之間，然后用兩片石英片將雙層聚合物壓實(shí)，異丙基硫雜蒽酮丙酮溶液均勻分布在雙層聚合物之間，形成三明治結(jié)構(gòu)，移入高壓汞燈輻照裝置(波長254nm處光強(qiáng)為9000 μ W/cm2)中室溫下照射 240秒。將已引入能夠繼續(xù)引發(fā)自由基聚合休眠基的CPP膜用丙酮抽提I小時，去除表面吸附的異丙基硫雜蒽酮，在室溫下晾干。將聚乙二醇雙丙烯酸酯(分子量1000)、葡萄糖氧化酶、辣根過氧化物酶共同溶于pH = 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液中，其中聚乙二醇雙丙烯酸酯的質(zhì)量百分含量為30%，葡萄糖氧化酶質(zhì)量百分含量為O. 05%、辣根過氧化物酶質(zhì)量百分含量為O. 09%。取20 μ L的上述含酶溶液注入BOPP膜和接有休眠基的CPP膜之間，其中BOPP 膜位于三明治結(jié)構(gòu)上方，然后用兩片石英片壓實(shí)，移入氙燈輻照裝置(波長420nm處光強(qiáng)為 4000μ W/cm2)，室溫下照射2小時后取樣。將得到的載酶復(fù)合膜用去離子水沖洗表面后冷凍干燥，4°C冰箱中保存。
載酶膜檢測不同濃度葡萄糖時溶液吸光度和葡萄糖濃度可保持非常好的線性關(guān)系，線性相關(guān)度為O. 9994，其最低檢測葡萄糖濃度可到2mmol/L。
權(quán)利要求
1.一種聚合物基材表面固定化酶的方法，特征在于包括以下步驟第一步，聚合物表面吸附光引發(fā)劑或通過紫外光照射共價連接光感應(yīng)休眠基團(tuán)，所述聚合物為聚合物鏈含有碳一氫鍵的能夠進(jìn)行光引發(fā)劑奪氫反應(yīng)的有機(jī)材料；第二步在可見光照射下，光引發(fā)劑或休眠基團(tuán)產(chǎn)生自由基，引發(fā)含有游離酶的可聚合溶液進(jìn)行可控交聯(lián)聚合反應(yīng)，最終將酶固定在表面交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的聚合物基材表面固定化酶的方法，其特征在于光引發(fā)劑為硫雜蒽酮、氧雜蒽酮或兩者的衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的聚合物基材表面固定化酶的方法，其特征在于聚合物包括低密度聚乙烯LDPE、高密度聚乙烯HDPE、流延聚丙烯CPP、雙向拉伸聚丙烯BOPP、聚對苯二甲酸乙二醇酯PET、聚對苯二甲酸丁二醇酯PBT、聚酰胺PAM、聚氯乙烯PVC、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、聚馬來酸酐PMA、聚碳酸酯PC、聚己內(nèi)酯PCL、纖維素、纖維素酯、酚醛樹脂或環(huán)氧樹脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的聚合物基材表面固定化酶的方法，其特征在于聚合物選自聚合物片材、多孔膜，紡織品或非織造織物。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的聚合物基材表面固定化酶的方法，其特征在于所用紫外光或可見光的設(shè)備，為低壓、中壓、高壓汞燈，碘鎢燈或氙燈。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的聚合物基材表面固定化酶的方法，其特征在于所述含有游離酶的可聚合溶液組成如下單烯類單體質(zhì)量百分含量為0%-10%，交聯(lián)劑質(zhì)量百分含量為10%-90%，酶質(zhì)量百分含量為O. 05%-5%，余量為pH范圍為6_8的緩沖溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的聚合物基材表面固定化酶的方法，其特征在于所述單烯類單體包括丙烯酸AA，甲基丙烯酸MAA，丙烯酰胺AM，甲基丙烯酸縮水甘油酯GMA，甲基丙烯酸羥乙酯HEMA，乙烯基吡啶VP或乙烯基吡咯烷酮NVP ;交聯(lián)劑包括聚乙二醇雙丙烯酸酯PEGDA，聚乙二醇雙甲基丙烯酸酯PEGDMA，亞甲基雙丙烯酰胺MDA，二乙二醇二丙烯酸酯DEGDA，二乙二醇二甲丙烯酸酯DEGDMA或三羥甲基丙烷三丙烯酸酯TMPTA。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的聚合物基材表面固定化酶的方法，其特征在于所述酶固定是單酶固定或者是復(fù)酶固定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種聚合物基材表面固定化酶的方法，屬于固定化酶制備技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明分為以下步驟第一步、在聚合物表面吸附光引發(fā)劑或共價連接光感應(yīng)休眠基團(tuán)；第二步、在可見光或紫外光照射下，光引發(fā)劑或休眠基團(tuán)產(chǎn)生自由基，引發(fā)含有游離酶的單體溶液進(jìn)行可控交聯(lián)聚合反應(yīng)，最終將酶固定在表面交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中。酶的固定化在可見光、低溫或室溫下進(jìn)行，反應(yīng)條件溫和，有利于酶活性的保持。凝膠/基材復(fù)合結(jié)構(gòu)提高了交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的機(jī)械強(qiáng)度，克服了凝膠網(wǎng)絡(luò)易被破壞的缺點(diǎn)，不僅提高了酶的穩(wěn)定性，也實(shí)現(xiàn)了酶的回收再利用。該方法既適用于單酶固定，也適用于復(fù)酶固定。
文檔編號D06M14/28GK102925425SQ20121042120
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月29日
發(fā)明者楊萬泰, 趙長穩(wěn), 馬育紅 申請人:北京化工大學(xué)