專利名稱：應(yīng)用于豬鏈球菌2型毒力因子mrp檢測的熒光pcr引物和探針序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對豬鏈球菌2型的毒力因子-溶菌酶釋放蛋白(MRP)基因設(shè)計的用于熒光PCR檢測用的引物和探針序列。
背景技術(shù)：
豬鏈球菌病(Swine Streptococcosis)是由豬鏈球菌(Streptococcus suis)侵害豬的上呼吸道、生殖道、消化道等組織而引起的一種疾病，可引起豬的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、肺炎和突發(fā)性死亡。同時，本病也是一種嚴(yán)重的人獸共患傳染病，可引起相關(guān)從業(yè)人員腦膜炎并致死，對公共衛(wèi)生尤其是相關(guān)從業(yè)人員的生命構(gòu)成威脅，所以引起世界范圍內(nèi)的高度重視。國內(nèi)外均有2型豬鏈球菌引起人、豬死亡的報道。1968年丹麥?zhǔn)状螆蟮懒巳梭w感染豬鏈球菌導(dǎo)致腦膜炎的病例。目前全球已有200余例豬鏈球菌感染病例報告。1990年我國廣東省首次分離到豬鏈球菌2型(黃毓茂等，1991)。1998-1999年，江蘇省部分地區(qū)發(fā)生人—豬鏈球菌感染，導(dǎo)致25人發(fā)病，死亡14人。
2005年7月，我國四川省資陽市部分地區(qū)再次發(fā)生豬鏈球菌2型的人類感染。截至8月6日，全國有四川、重慶、廣東、香港、江西、江蘇等省市和地區(qū)發(fā)生人感染豬鏈球菌病事件，導(dǎo)致43人死亡。僅四川省就累計報告病例214例，其中實驗室確診43例，疫情涉及到11個市，34個縣。常規(guī)的豬鏈球菌血清學(xué)檢測方法不但費時，而且只能鑒定到血清型。而根據(jù)國內(nèi)外研究報道，豬鏈球菌2型不同株之間的致病力差別很大，可分為強致病株、弱致病株和非致病株。非致病的豬鏈球菌2型在健康豬扁桃體的帶菌率還可高達(dá)76％(143/188)(Davies，1991)。故在疫情發(fā)生時，只確定病原是豬鏈球菌2型還遠(yuǎn)不夠，還必須弄清其致病性，以利于有針對性地采取應(yīng)對措施，防止疫情的蔓延。
研究表明，豬鏈球菌2型的致病性與溶菌酶釋放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)、溶血素、莢膜多糖以及44kDa蛋白、IgG結(jié)合蛋白、纖毛粘著素等毒力因子有關(guān)。其中，溶菌酶釋放蛋白(MRP)是豬鏈球菌2型的主要致病因子，國內(nèi)外發(fā)生的危害人和豬健康的豬鏈球菌病的病原均是表達(dá)MRP蛋白的2型豬鏈球菌，這包括1998年發(fā)生在我國江蘇省部分地區(qū)和今年在四川資陽市發(fā)生的嚴(yán)重的人—豬鏈球菌2型感染。
采用常規(guī)的PCR檢測方法，可以對病原菌的MRP基因進(jìn)行擴增以確定分離菌株的致病性。熒光PCR技術(shù)是一種新型擴增待檢基因的方法，采用“閉管”操作，靈敏度比常規(guī)PCR高出100倍以上，而且整個過程只需要0.5-2h，還可避免常規(guī)PCR操作時EB染色的危害及PCR后處理可能帶來的假陽性，是目前為廣大科研工作者所青睞的一種病原的快速鑒定方法。
本發(fā)明選擇MRP設(shè)計引物進(jìn)行PCR，同時在擴增序列中間設(shè)計了熒光探針，采用熒光PCR儀，反應(yīng)結(jié)束即可根據(jù)擴增曲線判定有無目的基因，從而確定待檢菌是否為豬鏈球菌2型致病株。本方法的建立，為疫情發(fā)生后，有針對性地采取緊急防控措施、減少國際貿(mào)易摩擦，從而嚴(yán)把進(jìn)出口關(guān)奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供用于豬鏈球菌2型毒力因子MRP檢測用的熒光PCR引物和探針序列。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)在分析已報道豬鏈球菌2型的毒力因子MRP基因序列(GenBankNo.X64450)的基礎(chǔ)上、采用探針設(shè)計軟件Beacon Designer2.1設(shè)計PCR引物和熒光探針。在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上添加了一條標(biāo)記了兩個熒光染料基團的核苷酸探針，報告熒光染料標(biāo)記在探針的5’端，淬滅熒光染料標(biāo)記在探針的3’端，二者構(gòu)成能量轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)。當(dāng)探針完整時，報告熒光染料所發(fā)射的熒光可被淬滅熒光染料吸收，在熒光PCR反應(yīng)的退火過程中，探針優(yōu)先結(jié)合到DNA模板上，當(dāng)引物延伸到探針結(jié)合位置時，在DNA聚合酶5’端到3’端的外切酶的作用下，探針被水解，從而導(dǎo)致報告熒光基團和淬滅熒光基團距離變遠(yuǎn)，報告熒光信號得以釋放出來而被儀器檢測到，從而實現(xiàn)對豬鏈球菌2型的MRP毒力因子基因的檢測。
一個方面，本發(fā)明提供了用于豬鏈球菌2型毒力因子—溶菌酶釋放蛋白(MRP)檢測的實時熒光PCR的引物對及探針。其中所述的特異性地針對MRP編碼基因的引物對和探針的核苷酸序列為MRP正向引物序列為AGACCGTCCAAAAGTACCTTACC，正向引物的反向互補序列為GGTAAGGTACTTTTGGACGGTCT；MRP反向引物序列為CATTTGTTCCTGGTGTCGTTGG，反向引物的反向互補序列為CCAACGACACCAGGAACAAATG；以及該引物對的上游引物向5’延伸10個堿基、下游引物向3’延伸10個堿基所包括的DNA序列區(qū)域內(nèi)得到的引物序列及互補序列；MRP探針序列為TGACCCAACAGAGCCAGACGAGCC，探針的反向互補序列為GGCTCGTCTGGCTCTGTTGGGTCA，以及該探針向5’延伸10個堿基、向3’延伸10個堿基區(qū)域內(nèi)得到的探針序列及互補序列。
MRP的PCR引物和探針設(shè)計完成后，采用在線BLAST分析其序列特異性。結(jié)果表明MRP引物和探針設(shè)計區(qū)域為豬鏈球菌2型MRP毒力因子所特有，沒有發(fā)現(xiàn)同源或序列一致性生物基因信息，可以保證擴增產(chǎn)物的特異性。
所述探針的5’端用報告熒光染料標(biāo)記，3’端用淬滅熒光染料標(biāo)記。可用于本發(fā)明的報告熒光染料包括但不限于，例如，F(xiàn)AM、JOE和HEX?？捎糜诒景l(fā)明的報告熒光染料包括但不限于，例如，Eclipse和TAMRA。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，引物擴增產(chǎn)物長度為80bp，探針設(shè)計于待擴增序列間的高GC含量區(qū)，5’端標(biāo)記報告熒光染料為JOE，3’端標(biāo)記淬滅熒光染料為Eclipse。
本發(fā)明通過下述操作建立了豬鏈球菌2型毒力因子MRP熒光PCR檢測方法根據(jù)豬鏈球菌2型毒力因子MRP編碼基因的公開序列設(shè)計引物對和探針，采用軟件分析所設(shè)計引物對和探針的特異性，引物對和探針合成后分別進(jìn)行稀釋并確定反應(yīng)需要量，通過調(diào)整反應(yīng)體系中的鎂離子濃度和對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，以培養(yǎng)菌液或者帶菌組織DNA為檢測樣本，確定熒光PCR檢測培養(yǎng)菌液或者帶菌組織中MRP毒力因子最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，采用倍比稀釋的豬鏈球菌2型培養(yǎng)菌液及帶菌組織DNA作為模板進(jìn)行敏感性試驗，采用其它的豬體致病菌為對照進(jìn)行特異性試驗，以確保所建立檢測方法的實際應(yīng)用效果。
另一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測豬鏈球菌2型毒力因子MRP基因的實時熒光PCR檢測方法，該方法包括下列步驟1)使用本發(fā)明所述的特異性地針對MRP引物對及熒光素標(biāo)記探針，與PCR擴增用的dNTP、PCR緩沖液及聚合酶混合，得到檢測預(yù)混液；2)向上述檢測預(yù)混液中加入待檢菌液或以待檢組織提取的基因組DNA作為模板；3)將步驟2)中建立的擴增反應(yīng)體系置于熒光PCR儀上；4)根據(jù)探針標(biāo)記的報告熒光類型，選擇對應(yīng)的熒光通道，按照本發(fā)明確立的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光PCR擴增，反應(yīng)結(jié)束后讀取并記錄各檢測樣本的PCR擴增循環(huán)數(shù)(Ct)；5)根據(jù)各樣本的反應(yīng)Ct值，按照建立的判定標(biāo)準(zhǔn)判定待檢樣本中豬鏈球菌2型是否含有待檢測的MRP基因。
本發(fā)明所述方法可以直接對培養(yǎng)菌液進(jìn)行檢測，也可以對組織中攜帶的豬鏈球菌2型實施檢測。在采用培養(yǎng)菌液作為檢測材料時，菌體分離及培養(yǎng)須在P3實驗室、按照CDC(中國疾病預(yù)防控制中心)推薦的豬鏈球菌分離培養(yǎng)程序進(jìn)行。即采用扁桃體拭子采取待檢豬的病料，實驗室內(nèi)，分別接種綿羊鮮血瓊脂平板。37℃培養(yǎng)24h后，挑取可疑菌落接種于匹克氏增菌液，37℃培養(yǎng)24h后，再接種血清肉湯，37℃搖床培養(yǎng)后，滅活備用。在對帶菌的組織，如豬扁桃體、肌肉等進(jìn)行檢測時，須首先采用商品化的基因組提取試劑盒提取其基因組DNA作為熒光PCR檢測用模板。
在利用本發(fā)明所述方法對待檢樣本實施檢測時，可直接取一定量的本發(fā)明所述檢測試劑，按照確立的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行檢測并判定結(jié)果。
在本發(fā)明中，熒光PCR擴增時優(yōu)選使用的Mg2+濃度為5mMol/l。
一個優(yōu)選實施方案中，所述熒光PCR擴增擴增條件為94℃5s；55℃10s，40個循環(huán)。
在本發(fā)明中，所述的豬鏈球菌2型毒力因子MRP基因是否存在的判定標(biāo)準(zhǔn)為如果待檢測基因的反應(yīng)曲線呈對數(shù)增長而且Ct＜30，判定為陽性；30＜Ct＜40，判定為可疑，可加大模板量重復(fù)擴增，如果得到相同的試驗結(jié)果，則判為陽性，否則為陰性；如果反應(yīng)曲線Ct＞40或者為一條直線，則為陰性。


圖1.豬鏈球菌2型MRP基因的熒光PCR檢測體系最佳Mg2+濃度的確定(單位mMol/l)。其中，曲線1-7依次分別代表體系中含有的Mg2+濃度為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0mmol/l，曲線8為陰性對照。
圖2.檢測豬鏈球菌2型菌株MRP基因的熒光PCR反應(yīng)最佳退火溫度的確定。圖中各曲線代表的不同的退火溫度，其中曲線1-8依次分別為采用46℃、47℃、48℃、50℃、52℃、54℃、55℃和56℃作為退火溫度時的反應(yīng)曲線。
圖3.熒光PCR檢測培養(yǎng)菌液中豬鏈球菌2型MRP基因的特異性試驗結(jié)果圖4.熒光PCR檢測組織中豬鏈球菌2型MRP基因的特異性試驗結(jié)果圖5.熒光PCR檢測培養(yǎng)菌液中的豬鏈球菌2型MRP基因的敏感性試驗結(jié)果。其中，曲線1-8依次分別為PCR擴增時作為模板的菌落數(shù)(CFU)為5000、1000、500、100、50、20、10和5時的擴增曲線，曲線9為陰性對照。
圖6.熒光PCR檢測組織樣品中豬鏈球菌2型MRP基因的敏感性試驗結(jié)果。其中，曲線1表示熒光PCR反應(yīng)體系中對應(yīng)的組織中菌落數(shù)(CFU)為1×104、曲線2代表菌落數(shù)為5×103、曲線3代表PCR擴增時摻入組織中的菌落數(shù)(CFU)為1×103、曲線4代表菌落數(shù)為500、曲線5代表菌落數(shù)為100、曲線6代表菌落數(shù)為50、曲線7為陰性對照。
圖7圖示的是用本發(fā)明所述的豬鏈球菌2型MRP基因熒光PCR檢測方法對所采集扁桃體樣本進(jìn)行檢測的結(jié)果。
本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明的試劑及檢測方法充分利用了PCR技術(shù)的高效擴增性、核酸雜交的良好特異性和熒光檢測技術(shù)的快速敏感性，反應(yīng)結(jié)束即時便可根據(jù)擴增曲線判定是否含有MRP基因。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而絕不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。除另有說明外，本申請中的所有科技術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。本申請中引用的任一專利、專利申請和出版物在此引入作為參考。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常采用常規(guī)條件例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的方法。
實施例實施例1引物和探針的制備1.1引物和探針的設(shè)計和合成根據(jù)豬鏈球菌2型的毒力因子MRP編碼基因的公開序列(GenBank No.X64450)，采用探針設(shè)計軟件Beacon Designer 2.1設(shè)計PCR引物對，引物對的序列為正向引物P15’-AGACCGTCCAAAAGTACCTTACC-3’；反向引物P25’-CATTTGTTCCTGGTGTCGTTGG-3’。針對待擴增序列間的高GC含量區(qū)設(shè)計MRP探針，探針序列為5’-TGACCCAACAGAGCCAGACGAGCC-3’，并且在探針5’端標(biāo)記報告熒光染料JOE，3’端標(biāo)記淬滅熒光染料Eclipse。合成的引物對及熒光標(biāo)記探針用于下面的試驗。
實施例2豬鏈球菌2型熒光PCR檢測體系及檢測條件的建立和優(yōu)化2.1豬鏈球菌2型熒光PCR檢測體系的建立和優(yōu)化由于鎂離子是影響反應(yīng)特異性和擴增效率的主要因素，本實施例著重對反應(yīng)體系中Mg2+濃度進(jìn)行了優(yōu)化，在反應(yīng)體系中其它成分不變的條件下，采用的Mg2+濃度梯度見下表1表1.豬鏈球菌2型熒光PCR檢測體系中Mg2+的梯度

采用的反應(yīng)體系為10×PCR緩沖液(Mg2+Free)2.5μl，25mM MgCl21-7μl，2.5mMdNTP 2μl，20μM上、下游引物各0.5μl，10μM探針0.5μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.25μl，然后加入1μl菌液或從組織中提取的基因組DNA作為模板，加滅菌雙蒸水使體積至25μl。
結(jié)果見圖1。自圖1可以看出，Mg2+濃度對PCR反應(yīng)有明顯的影響，Mg2+濃度越低，反應(yīng)的特異性越強，但是擴增效率則明顯下降；反之，Mg2+濃度升高，雖然擴增效率有所提高，但是特異性卻受到影響。本研究選擇Mg2+濃度5mMol/l作為實際采用的Mg2+濃度，目的是兼顧反應(yīng)的特異性和擴增效率。
2.2熒光PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化為了提高檢測的特異性和敏感性，參照引物設(shè)計軟件推薦的退火溫度(50℃)，本研究設(shè)置如下退火溫度梯度進(jìn)行PCR。
表2.豬鏈球菌2型熒光PCR檢測條件中的最佳退火溫度的選擇

采用的反應(yīng)體系如下10×PCR緩沖液(Mg2+Free)2.5μl，25mM MgCl25.0μl，2.5mM dNTP 2μl，20μM上、下游引物各0.5μl，10μM探針0.5μl，5U/μlrTaq DNA聚合酶0.25μl，然后加入1μl菌液或從組織中提取的基因組DNA作為模板，加滅菌雙蒸水使體積至25μl。
將樣品管放入Bio-Rad公司iCycler IQ Real-time PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng)95℃預(yù)變性3min；然后采用二步法進(jìn)行反應(yīng)94℃，5s；(46-56)℃，10s，45個循環(huán)。每個循環(huán)結(jié)束后采集數(shù)據(jù)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴增曲線確定最佳退火溫度。
將樣品管放入Bio-Rad公司iCycler IQ Real-time PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng)95℃預(yù)變性3min；然后采用二步法進(jìn)行反應(yīng)94℃，5s；55℃，10s；45個循環(huán)。每個循環(huán)結(jié)束后采集數(shù)據(jù)。
結(jié)果見圖2。自圖2可以看出，退火溫度對PCR反應(yīng)有一定的影響，溫度越高，反應(yīng)的特異性越強，但是擴增效率則明顯下降；反之，退火溫度降低，雖然擴增效率有所提高，但是特異性卻受到影響。本研究選擇50℃作為實際采用的退火溫度，目的是兼顧反應(yīng)的特異性和擴增效率。
實施例3待檢測樣品制備3.1菌體分離及培養(yǎng)在P3實驗室，按照CDC(中國疾病預(yù)防控制中心)推薦的豬鏈球菌分離培養(yǎng)程序進(jìn)行。采用扁桃體拭子采取待檢豬的病料，帶回實驗室后，分別接種綿羊鮮血瓊脂平板。37℃培養(yǎng)24h后，挑取可疑菌落接種于匹克氏增菌液，37℃培養(yǎng)24h后，再接種血清肉湯，37℃搖床培養(yǎng)后，革蘭氏染色、顯微鏡檢查后，加熱滅活備用。
3.2組織基因組DNA的提取無菌采取待檢豬及健康豬的扁桃體、肌肉等組織，實驗室內(nèi)，采用QIAGEN基因組提取試劑盒(DNeasy)，按DNeasy Tissue Handbook改進(jìn)后分別提取其基因組DNA，具體步驟如下A.在無菌環(huán)境下(最好是在實驗室生物安全柜中或超凈工作臺上進(jìn)行操作)，將采集的組織樣本(如淋巴結(jié)、扁桃體、肌肉等)除去包膜和其它結(jié)締組織，選取內(nèi)部實質(zhì)部分，置玻璃勻漿器內(nèi)充分磨成糊狀后備用。
B.將研成糊狀的20mg的動物組織放入離心管中，加180μl的buffer ATL。
C.加入20μl的蛋白酶K，利用旋渦混合器混勻，55℃孵育直至組織完全消化(為保證試驗結(jié)果，消化時間應(yīng)保持在1小時以上，如時間允許，過夜消化)，在消化的過程中需每隔一段時間振蕩混合一次。
D.旋渦15s，在樣品中加入200μl的buffer AL，旋渦混勻，70℃孵育30min。
E.在樣品中加入200μl的無水乙醇，旋渦混勻。
F.將試劑盒中的DNeasy Mini Spin Column安置于2ml的收集管上，將上述操作E中的溶液轉(zhuǎn)移至DNeasy Mini Spin Column中，≥6000g(8000rpm)離心1min，棄去濾液和收集管。
G.將DNeasy Mini Spin Column安置于新的2ml的收集管上，加入500μl buffer AW1，≥6000g(8000rpm)離心1min，棄去濾液和收集管。
H.將DNeasy Mini Spin Column安置于新的2ml的收集管上，加入500μl buffer AW2，≥20000g(14000rpm)離心3min使DNeasy膜完全干燥，棄去濾液和收集管。
I.將DNeasy Mini Spin Column安置于新的1.5ml的收集管上，將100μl buffer AE直接加至DNeasy膜上，室溫孵育1min，≥6000g(8000rpm)離心1min洗脫DNA。
實施例4熒光PCR檢測豬鏈球菌2型MRP基因的特異性確定4.1熒光PCR檢測培養(yǎng)菌液中豬鏈球菌2型MRP基因的特異性試驗以馬鏈球菌獸疫亞種、無乳鏈球菌、糞鏈球菌和大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門氏菌等菌株作為陰性對照，以豬鏈球菌2型四川株作為陽性對照，按照本研究建立的方法進(jìn)行熒光PCR擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物的有無判定本方法檢測豬鏈球菌2型感染的特異性。
結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，以馬鏈球菌獸疫亞種、無乳鏈球菌、糞鏈球菌和大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門氏菌等菌株作為陰性對照，以豬鏈球菌2型四川株作為陽性對照，按照本研究建立的方法進(jìn)行豬鏈球菌2型MRP毒力因子的熒光PCR擴增，結(jié)果表明，只有陽性對照有明顯的擴增曲線，而其它幾個對照菌株均沒有擴增；4.2熒光PCR檢測組織中豬鏈球菌2型MRP基因的特異性試驗采用正常組織基因組DNA作為空白對照，以在扁桃體組織中定量加入馬鏈球菌獸疫亞種、無乳鏈球菌、糞鏈球菌和大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門氏菌等菌株后提取的DNA作為陰性對照，以加入豬鏈球菌2型四川株的扁桃體組織DNA作為陽性對照，進(jìn)行熒光PCR，以檢驗本研究所建立方法的特異性。
結(jié)果見圖4。采用正常組織基因組DNA作為空白對照，以在扁桃體組織中定量摻入對照菌株后提取的DNA作為陰性對照，以摻入豬鏈球菌2型四川株的扁桃體組織DNA作為陽性對照，進(jìn)行熒光PCR結(jié)果表明，只有陽性對照有明顯的擴增曲線，而其它幾個對照菌株和陰性對照均沒有擴增說明本研究所建立方法具有高度的特異性，適合應(yīng)用于豬鏈球菌2型MRP毒力因子的檢測。
實施例5熒光PCR檢測豬鏈球菌2型MRP基因的敏感性試驗5.1熒光PCR檢測培養(yǎng)菌液中豬鏈球菌2型MRP基因的敏感性試驗以豬鏈球菌2型四川株培養(yǎng)菌液作為待檢菌液，記數(shù)后，采用血清肉湯培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，見表3。
表3.用于驗證豬鏈球菌2型MRP基因熒光PCR檢測方法的敏感性的培養(yǎng)菌液濃度(CFU/μl)

在確定的熒光PCR反應(yīng)體系中加入1μl梯度稀釋的菌液作為模板進(jìn)行PCR擴增，擴增完成后，以Ct＝40作為檢測低限，確定本方法可以檢測的最少菌數(shù)。結(jié)果見圖5。自圖5中可以看出，第7管的Ct值為38.1，低于預(yù)設(shè)的Ct＝40的檢測限，按照取樣1μl計算，即采用本研究所建立的熒光PCR方法單獨檢測MRP基因的敏感性為10CFU。
5.2熒光PCR檢測組織中豬鏈球菌2型MRP基因的敏感性試驗按照試劑盒組織用量說明，稱取10mg扁桃體組織，在其中加入按照表4梯度稀釋的豬鏈球菌2型培養(yǎng)菌液，按照DNA提取試劑盒操作提取其中的基因組DNA，并取1μl作為模板，按照實施實例1的反應(yīng)體系和程序進(jìn)行熒光PCR，PCR同時設(shè)置陰性對照。擴增后，分析Ct值，以Ct＝40作為檢測低限，確定本方法可以檢測的組織中豬鏈球菌2型菌株的最低數(shù)量。結(jié)果見圖6。
表4.熒光PCR檢測豬鏈球菌2型感染的敏感性實驗的組織中對應(yīng)菌數(shù)(CFU/μl DNA提取液)

自圖6中可以看出，MRP單獨可以檢測組織中量為1×105CFU/10mg組織，按照取樣1μl計算，即采用本研究所建立的熒光PCR方法單獨檢測組織中的MRP基因的敏感性為100CFU。
實施例6北京市某屠宰場扁桃體樣品85份，按照實施例1中所述方法提取組織基因組DNA后用ddH2O溶解。在各檢測管內(nèi)加入10×PCR緩沖液(Mg2+Free)2.5μl，25mM MgCl25.0μl，2.5mM dNTP 2μl，20μM上、下游引物各0.5μl，10μM探針0.5μl，5U/μlrTaq DNA聚合酶0.25μl，加入1μl上述提取的待檢DNA，然后用ddH2O補充反應(yīng)體系至25μl。反應(yīng)同時設(shè)置摻入豬鏈球菌2型(四川株)菌液的扁桃體提取的DNA 1μl作為模板進(jìn)行的陽性對照和以ddH2O作為陰性對照。
將樣品管放入熒光PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng)95℃預(yù)變性3min；然后采用二步法進(jìn)行反應(yīng)94℃5s；55℃10s，40個循環(huán)。每個循環(huán)結(jié)束后采集熒光信號，反應(yīng)結(jié)束后儀器自動給出Ct值。分析Ct值發(fā)現(xiàn)，陽性樣本的MRP擴增曲線的Ct值為21.5(圖7)，陰性對照沒有擴增曲線，表明試驗成立；各樣本均沒有明顯擴增曲線，表明各樣本均沒有檢出豬鏈球菌2型毒力因子MRP，即所采集的所有扁桃體均不攜帶有致病性豬鏈球菌2型菌。
權(quán)利要求
1.用于豬鏈球菌2型毒力因子一溶菌酶釋放蛋白(MRP)檢測的實時熒光PCR的引物對及探針。
2.權(quán)利要求1所述的引物對及探針，其中所述引物對的序列為正向引物P15’-AGACCGTCCAAAAGTACCTTACC-3’反向引物P25’-CATTTGTTCCTGGTGTCGTTGG-3’所述MRP探針的序列為5’-TGACCCAACAGAGCCAGACGAGCC-3’該探針的5’端用報告熒光染料標(biāo)記，3’端用淬滅熒光染料標(biāo)記。
3.權(quán)利要求2所述的引物對及探針，其中所述的報告熒光染料選自FAM、JOE和HEX。
4.權(quán)利要求3所述的引物對及探針，其中所述的報告熒光染料為JOE。
5.權(quán)利要求2所述的引物對及探針，其中所述的淬滅熒光染料選自Eclipse和TAMRA。
6.權(quán)利要求5所述的引物對及探針，其中所述的淬滅熒光染料選自Eclipse。
7.一種用于檢測豬鏈球菌2型毒力因子MRP基因的實時熒光PCR檢測方法，該方法包括下列步驟1)使用權(quán)利要求1-6中任一項所述的引物對及探針，與PCR擴增用的dNTP、PCR緩沖液及聚合酶混合，得到檢測預(yù)混液；2)向上述檢測預(yù)混液中加入待檢菌液或以待檢組織提取的基因組DNA作為模板；3)將步驟2)中建立的擴增反應(yīng)體系置于熒光PCR儀上；4)根據(jù)探針標(biāo)記的報告熒光類型，選擇對應(yīng)的熒光通道，按照本發(fā)明確立的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光PCR擴增，反應(yīng)結(jié)束后讀取并記錄各檢測樣本的PCR擴增循環(huán)數(shù)(Ct)；5)根據(jù)各樣本的反應(yīng)Ct值，按照建立的判定標(biāo)準(zhǔn)判定待檢樣本中豬鏈球菌2型是否含有待檢測的MRP基因。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的判定標(biāo)準(zhǔn)為如果待檢測基因的反應(yīng)曲線呈對數(shù)增長而且Ct＜30，判定為陽性；30＜Ct＜40，判定為可疑，可加大模板量重復(fù)擴增，如果得到相同的試驗結(jié)果，則判為陽性，否則為陰性；如果反應(yīng)曲線Ct＞40或者為一條直線，則為陰性。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對豬鏈球菌2型毒力因子一溶菌酶釋放蛋白(MRP)編碼基因設(shè)計的用于豬鏈球菌2型溶菌酶釋放蛋白(MRP)熒光PCR檢測的引物和探針序列。本發(fā)明針對MRP基因設(shè)計引物進(jìn)行PCR，同時在擴增序列中間設(shè)計了熒光探針，通過對反應(yīng)的退火溫度和鎂離子濃度進(jìn)行優(yōu)化，建立了豬鏈球菌2型溶菌酶釋放蛋白(MRP)多重實時熒光PCR的檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK1944679SQ20061010957
公開日2007年4月11日 申請日期2006年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月10日
發(fā)明者吳紹強, 林祥梅, 韓雪清, 梅琳, 劉建, 賈廣樂, 施宗偉, 陳洪俊 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院動植物檢疫研究所