專利名稱：采用gs115酵母菌合成重組人腸三葉因子的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程的DNA或RNA、載體和質(zhì)粒，或其分離、制備或純化，具體涉及重組人腸三葉因子的表達(dá)和純化。
背景技術(shù)：
腸三葉因子(以下簡(jiǎn)稱ITF)是分布于腸道的特異小分子蛋白，分子量約6～7kD。ITF由59個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，包含一個(gè)由38～39個(gè)氨基酸殘基組成的特定序列，其中的6個(gè)半胱氨酸以1-5，2-4，3-6的順序依次形成3個(gè)二硫鍵，從而產(chǎn)生特異而穩(wěn)定的三葉結(jié)構(gòu)。這種穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)確保其在腸道中發(fā)揮活性，不受消化酶和pH變化的影響。正常情況下，ITF分布于整個(gè)小腸，特別是小腸絨毛環(huán)狀細(xì)胞的基底部。ITF在體內(nèi)以20％單體和80％二聚體的形式存在，但只有二聚體才具有生物活性。ITF不僅能促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖和移行，還能同粘蛋白中的寡聚糖或多糖的側(cè)鏈相連，穩(wěn)定腸粘液層。因此，ITF對(duì)腸道的保護(hù)作用非常強(qiáng)，。它在治療由各種致傷因子引起的胃腸粘膜損傷等方面具有顯著效果。
現(xiàn)有技術(shù)中，在《Biochemistry》，1995，344757-476，有一篇由Thim L，Woldike HF，Nielsen PF，et al.撰寫(xiě)的論文“Characterization of human and rat intestinal trefoil factotproduced in yeast”，報(bào)道有腸三葉因子在酵母中的表達(dá)方法。該方法是利用第一代釀酒酵母發(fā)酵獲得重組腸三葉因子。但它存在的缺陷是它由實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)展到工業(yè)規(guī)模時(shí)，其產(chǎn)量迅速下降，原因是培養(yǎng)基中維特質(zhì)粒高拷貝數(shù)的選擇壓力消失，質(zhì)粒變得不穩(wěn)定，拷貝數(shù)下降，導(dǎo)致了產(chǎn)量的降低，僅為48mg/L；它的純化方法煩瑣，操作復(fù)雜、步驟較多。2002年5月2日公開(kāi)有一件主題名稱為“腸三葉蛋白”的美國(guó)專利文獻(xiàn)US20020052483A1，在關(guān)于腸三葉因子的來(lái)源上，該文獻(xiàn)指出應(yīng)用真核表達(dá)載體(如pMAMneo)，在COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞等真核細(xì)胞中表達(dá)；直接從機(jī)體腸道粘膜中提取腸三葉因子。但按照它所介紹的方法具有以下不足1.利用真核細(xì)胞表達(dá)獲得腸三葉因子，雖然蛋白活性尚好，但成本較高、產(chǎn)量低，難以大規(guī)模生產(chǎn)；2.利用腸粘膜提取腸三葉因子，雖然可以得到天然的腸三葉因子，但其原料(腸粘膜)來(lái)源受限，產(chǎn)量更是極其有限。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種不同于現(xiàn)有技術(shù)的采用GS115酵母菌合成重組人腸三葉因子的工藝，以便提高表達(dá)產(chǎn)量和純度，有利于ITF的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。
采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。
一種采用GS115酵母菌合成重組人腸三葉因子的工藝，由目的基因的獲取、酵母表達(dá)載體的構(gòu)建、酶切及測(cè)序鑒定、轉(zhuǎn)化入GS115酵母菌、誘導(dǎo)表達(dá)和純化六步過(guò)程組成。
1.目的基因的獲取從正常人小腸絨毛中提取總RNA，通過(guò)RT-PCR獲得編碼59個(gè)氨基酸的腸三葉因子的基因序列GAGGAGTACGTGGGCCTGTCTGCAAACCAGTGTGCCGTGCCAGCCAAGGACAGGGTGGACTGCGGCTACCCCCATGTCACCCCCAAGGAGTGCAACAACCGGGGCTGCTGCTTTGACTCCAGGATCCCTGGAGTGCCTTGGTGTTTCAAGCCCCTGCAGGAAGCAGAATGCACCTTCTGA同時(shí)利用上游引物5′-GAGAGAATTCCATCATCATCATCATCATGAGGAGTACGTGGGCCTGTC-3′(引物1)或5′-TTTAGCGGCCGCTCAGAAGGTGCATTCTGCTTC-3′(引物2)引入六個(gè)組氨酸標(biāo)簽6×CAT。
2.酵母表達(dá)載體的構(gòu)建由RT-PCR擴(kuò)增出的人腸三葉因子基因序列，經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切，然后插入用同樣的限制性內(nèi)切酶處理過(guò)的酵母表達(dá)載體pPICZaA，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Top10，以含25μg/ml Zeocin(一種特殊抗生素)的低鹽LB平板篩選重組質(zhì)粒，得到含有重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA-hITF的重組大腸桿菌Top10。
3.酶切及測(cè)序鑒定提取小量重組質(zhì)粒pPICZaA-hITF，用EcoRI和NotI消化，切下預(yù)期大小片段，按設(shè)計(jì)編碼pPICZaA-hITF序列，分別為210bp和3600bp，用重組質(zhì)粒pPICZaA-hITF酶切電泳圖和pPICZaA-hITF測(cè)序圖譜測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果證明所克隆pPICZaA-hITF序列完全正確，而且是按照設(shè)計(jì)準(zhǔn)確進(jìn)入載體。
4.轉(zhuǎn)化入GS115酵母菌將重組質(zhì)粒線性化，然后化學(xué)轉(zhuǎn)化入GS115酵母菌，再進(jìn)行抗性篩選，將篩選出的陽(yáng)性克隆分別轉(zhuǎn)接到MMH(含組氨酸的最小甲醇培養(yǎng)基)、MDH(含組氨酸的最小葡萄糖培養(yǎng)基)平板上，2天后獲得克隆均為Mut+(甲醇利用型陽(yáng)性)表型。提取酵母基因組DNA，作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，做PCR反應(yīng)電泳圖顯示，使擴(kuò)增出的特異條帶與預(yù)期結(jié)果大小一致，證明所獲得克隆均有目的基因的成功整合。
5.誘導(dǎo)表達(dá)選取陽(yáng)性克隆Mut+表型進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)至96小時(shí)后，離心分離胞體和上清，上清蛋白以三氯醋酸沉淀，SDS-PAGE蛋白電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，獲得酵母菌GS115-hITF上清液；將其與陰性對(duì)照相比，在重組克隆的表達(dá)上清中出現(xiàn)與人腸三葉因子(hITF)非糖基化形式分子量一致的新生蛋白條帶；做酵母菌GS115-hITF上清液Western blotting(免疫印跡)分析，顯示重組克隆是以非糖基化形式分泌表達(dá)了hITF。
6.純化將酵母菌GS115-hITF上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(冷凍干燥)從1000ml濃縮至100ml，把濃縮上清移入超濾離心管(截留分子量30KD)，離心約20～30分鐘去除大部分大分子量雜蛋白，再將濾出液通過(guò)鎳離子柱，10～50毫摩爾咪唑漂洗雜蛋白，100～800毫摩爾咪唑洗脫目的蛋白。然后把洗脫液移入超濾離心管(截留分子量3KD)，離心約20～30分鐘去除鹽分、咪唑等小分子物質(zhì)，最后將目的蛋白用孔徑0.2微米的濾器過(guò)濾除菌，冷凍干燥成粉末狀，-80℃長(zhǎng)期保存。重組腸三葉因子N端具有伸展的6個(gè)組氨酸殘基，能和Ni2+離子鰲合柱結(jié)合，進(jìn)行快速親和純化；Ni2+離子是利用金屬和蛋白質(zhì)有親和力的特點(diǎn)，將金屬離子與凝膠載體相連，制成鰲合吸附劑用來(lái)蛋白質(zhì)的親和層析分離。Ni2+離子共有6個(gè)鰲合點(diǎn)，可以和6個(gè)組氨酸相結(jié)合，有利于目的蛋白的插入。純化后的樣品SDS-PAGE電泳后，考馬斯亮蘭R250染色，顯示得到比較純hITF。取所得純化樣品做重組人腸三葉因子純化后Western blotting分析，結(jié)果顯示所表達(dá)蛋白確實(shí)為hITF。
按照本發(fā)明工藝獲得的重組人腸三葉因子，表達(dá)產(chǎn)量可達(dá)100mg/L，提純純度可達(dá)95％或更高，純化的蛋白產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)結(jié)果表明用本發(fā)明工藝獲得的重組人腸三葉因子為高純度、無(wú)熱源、無(wú)內(nèi)毒素，有正確的分子量，與天然的腸三葉因子有相同的等電點(diǎn)、氨基酸序列和紫外光譜，及其完好的生物學(xué)活性的重組蛋白。將其應(yīng)用于治療由各種致傷因子引起的胃腸粘膜損傷療效明顯。
四.


圖1是酵母表達(dá)載體構(gòu)建技術(shù)路線示意2是重組質(zhì)粒PICZaA-hITF酶切電泳3是重組質(zhì)粒pPICZaA-hITF測(cè)序圖譜圖4是酵母GS115-hITF基因PCR反應(yīng)電泳5是酵母GS115-hITF上清液Western blotting6是重組人腸三葉因子純化后Western blotting圖五.具體實(shí)施方式
下面用實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明采用GS115酵母菌合成重組人腸三葉因子的工藝的具體操作方法。
(一)目的基因的獲取從小腸粘膜中提取總RNA，通過(guò)RT-PCR獲得編碼59個(gè)氨基酸的腸三葉因子的基因序列GAGGAGTACGTGGGCCTGTCTGCAAACCAGTGTGCCGTGCCAGCCAAGGACAGGGTGGACTGCGGCTACCCCCATGTCACCCCCAAGGAGTGCAACAACCGGGGCTGCTGCTTTGACTCCAGGATCCCTGGAGTGCCTTGGTGTTTCAAGCCCCTGCAGGAAGCAGAATGCACCTTCTGA同時(shí)利用上游引物5′-GAGAGAATTCCATCATCATCATCATCATGAGGAGTACGTGGGCCTGTC-3′(引物1)或5′-TTTAGCGGCCGCTCAGAAGGTGCATTCTGCTTC-3′(引物2)引入六個(gè)組氨酸標(biāo)簽6×CAT。
(二)酵母表達(dá)載體的構(gòu)建1.酶切產(chǎn)物的純化1)割下含ITF DNA的瓊脂糖塊，放入1.5ml離心管。
2)加入400μl結(jié)合緩沖液，置于55-60℃水浴7分鐘，使瓊脂塊完全熔化，每2分鐘顛倒混勻一次。
3)將熔化的瓊脂糖液移入吸附柱，10000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘，倒掉收集管中液體，再將吸附柱放入同一收集管中。
4)在吸附柱中加入750μl洗脫緩沖液，靜置2分鐘后，離心1分鐘倒掉收集管中液體，將吸附柱放入同一收集管中。
5)同(4)，離心1分鐘。
6)將吸附柱放入一個(gè)干凈的1.5ml的離心管中，在吸附柱中央加入30-50ml去離子水，離心1分鐘，將1.5ml離心管(DNA)貯存于-20℃冰箱。
2.連接取2.5μl目的基因片斷和5μl載體片斷，建立20μl連接體系，4℃連接過(guò)夜。
3.轉(zhuǎn)化1)取10μl連接產(chǎn)物加入到100μl大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)菌輕輕混合，冰上放置30分鐘。
2)42℃熱休克90秒，冰上放置2分鐘。
3)加人900μl LB培養(yǎng)基，37℃水平搖1小時(shí)。
4)取100μl分別涂于低鹽LB瓊脂平板(含Zeocin 25g/ml)，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。
4.觀察結(jié)果第二天LB平板長(zhǎng)出數(shù)十個(gè)陽(yáng)性菌落.
(三)酶切及測(cè)序鑒定從大腸桿菌TOP10中提取小量質(zhì)粒pPICZaA-hITF，用EcoRI和NotI消化，切下預(yù)期大小片段，按設(shè)計(jì)編碼pPICZaA-hITF序列，分別為210bp和3600bp，用重組質(zhì)粒pPICZaA-hITF酶切電泳圖和pPICZaA-hITF測(cè)序圖譜測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果證明，所克隆pPICZaA-hITF序列完全正確，而且是按照設(shè)計(jì)準(zhǔn)確進(jìn)入載體。見(jiàn)圖2和圖3。
酶切體系質(zhì)粒DNA 16μlEcoRI1μlNotI 1μl10X緩沖液2μl共計(jì)20μl反應(yīng)條件37℃4-6小時(shí)(四)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入GS115酵母菌及PCR鑒定目的基因
1.GS115酵母菌感受態(tài)的制備1)接種GS115酵母菌到50ml YPD培養(yǎng)基中，30℃搖菌過(guò)夜(約24～28h)培養(yǎng)到OD值為0.8～1.0(約108Cells/ml)。
2)收獲細(xì)胞，用25ml無(wú)菌水洗滌一次，室溫下1500g離心10分鐘。
3)重懸細(xì)胞于1ml 100mM氯化鋰溶液中，將懸液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管。
4)離心機(jī)最大速度離心15秒沉淀菌體，重懸菌體于400μl 100mM氯化鋰溶液中。
5)按50μl/管分裝，立即進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
2.GS115酵母菌的化學(xué)轉(zhuǎn)化1)煮沸1ml鮭魚(yú)精DNA 5分鐘，迅速冰浴以制備單鏈擔(dān)體DNA。
2)將處于感受態(tài)的GS115酵母菌離心，去除殘余的氯化鋰溶液。
3)對(duì)于每一個(gè)轉(zhuǎn)化，按以下順序加入50％PEG3350 240μl1M LiCl 36μl2mg/ml單鏈Salmon sperm DNA 25μl5～10μg/50μl H20質(zhì)粒DNA 50μl4)劇烈旋渦混勻直至沉淀菌體完全分布均勻(約1min)。
5)30℃水浴孵育30分鐘。
6)42℃水浴熱休克20～25分鐘。
7)6000～8000轉(zhuǎn)/分離心收集酵母菌體(吸出液體)。
8)重懸酵母于1ml YPD培養(yǎng)基，30℃搖床孵育。
9)1～4h后，取25～100μl菌液鋪選擇性培養(yǎng)基平板，于30℃培養(yǎng)2～3天鑒定。
3.基因組PCR鑒定提取GS115酵母菌DNA，以公用引物α-因子及AOX引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖4PCR反應(yīng)體系(50μl)H2O 35.5μl10xbuffer 5μldNTP 2μl上引(20μM)1μl下引(20μM)1μl模板 1μlTag酶 0.5μlMgCl24μl共計(jì)50μl反應(yīng)條件94℃預(yù)變性4分鐘后進(jìn)入循環(huán)；94℃變性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；循環(huán)完成后72℃繼續(xù)延伸7分鐘。
(五)基因型鑒定及誘導(dǎo)表達(dá)1.主要溶液配制1)YPD培養(yǎng)液將10g酵母提取物，20g蛋白胨，20g葡萄糖溶至1000ml去離子水中，高壓消毒。
2)MD平板1L的組成含1.34％YNB，4×10-3％生物素，2％葡萄糖，1.5％瓊脂。
3)BMGY培養(yǎng)液將10g酵母提取物，20g蛋白胨，13.4gYNB，4×10-5g生物素，10g甘油溶至1000ml PH6.00.1M磷酸鉀緩沖溶液中。
4)BMMY培養(yǎng)液BMGY中10g甘油由5ml甲醇代替。
2.基因型鑒定分別挑取含Zeocin的YPD平板上形成的陽(yáng)性克隆接種于MDH、MMH培養(yǎng)板的相應(yīng)位置上，并接種試劑盒中所提供的Mut+、Mut-酵母細(xì)胞分別作為陽(yáng)性陰性對(duì)照，置30℃恒溫箱培養(yǎng)直至克隆形成，參照陽(yáng)性陰性對(duì)照對(duì)比同一位置點(diǎn)隆大小，確定表型。
3.Mut+表型重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)
1)挑選一單菌落，置于裝有25ml MGY、BMG或BMGY培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，于28-30℃，250-300轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)至0D＝2～6(λ＝600，16-18小時(shí))。
2)室溫下1500-3000g離心5分鐘，收集菌體，用MM、BMM或BMMY重懸菌體，使OD600＝1.0左右(約100-200ml)。
3)將步驟2所得的菌液置于1L的搖瓶中，用雙層紗布或粗棉布封口，放置于28-30℃、250-300轉(zhuǎn)/分的搖床上繼續(xù)生長(zhǎng)。
4)每24h向培養(yǎng)基中添加100％甲醇至終濃度為0.5～1.0％。
5)按時(shí)間點(diǎn)分別取菌液樣品，取樣量為1ml，置于1.5ml EP管中，最大轉(zhuǎn)速離心2-3分鐘，分別收集上清和菌體，分析目的蛋白的表達(dá)量和菌液最佳收獲時(shí)間。時(shí)間點(diǎn)一般取0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h。
5)分離樣品的上清液，于-80℃保存?zhèn)溆谩?br> (六)表達(dá)產(chǎn)物的純化1、取上清1000毫升，冷凍干燥濃縮至100毫升。
2、將濃縮上清移入超濾離心管(截留分子量30KD)，離心約20～30分鐘去除大部分大分子量雜蛋白。
3、將濾出液通過(guò)鎳離子柱，10～50毫摩爾咪唑漂洗雜蛋白。
4、100～800毫摩爾咪唑洗脫目的蛋白。
5、將洗脫液移入超濾離心管(截留分子量3KD)，離心約20～30分鐘去除鹽分、咪唑等小分子物質(zhì)。
6、將目的蛋白用孔徑0.2微米的濾器過(guò)濾除菌。
7、冷凍干燥成粉末狀，-80℃長(zhǎng)期保存。
權(quán)利要求
1.一種采用GS115酵母菌合成重組人腸三葉因子的工藝，包括目的基因的獲取、酵母表達(dá)載體的構(gòu)建、酶切及測(cè)序鑒定、誘導(dǎo)表達(dá)和純化過(guò)程，其特征是在酶切及測(cè)序鑒定之后還有一個(gè)轉(zhuǎn)化入GS115酵母菌的過(guò)程將重組質(zhì)粒線性化，然后化學(xué)轉(zhuǎn)化入GS115酵母菌，再進(jìn)行抗性篩選，將篩選出的陽(yáng)性克隆分別轉(zhuǎn)接到MMH、MDH平板上獲得陽(yáng)性克隆Mut+表型。
2.按照權(quán)利要求1所述的采用GS115酵母菌合成重組人腸三葉因子的工藝，其特征在于所說(shuō)的目的基因的獲取是從小腸粘膜中提取總RNA，通過(guò)RT-PCR獲得編碼59個(gè)氨基酸的腸三葉因子的基因序列GAGGAGTACGTGGGCCTGTCTGCAAACCAGTGTGCCGTGCCAGCCAAGGACAGGGTGGACTGCGGCTACCCCCATGTCACCCCCAAGGAGTGCAACAACCGGGGCTGCTGCTTTGACTCCAGGATCCCTGGAGTGCCTTGGTGTTTCAAGCCCCTGCAGGAAGCAGAATGCACCTTCTGA同時(shí)利用上游引物5′-GAGAGAATTCCATCATCATCATCATCATGAGGAGTACGTGGGCCTGTC-3′或5′-TTTAGCGGCCGCTCAGAAGGTGCATTCTGCTTC-3′引入六個(gè)組氨酸標(biāo)簽6×CAT。
3.按照權(quán)利要求1所述的采用GS115酵母菌合成重組人腸三葉因子的工藝，其特征在于所說(shuō)的酵母表達(dá)載體的構(gòu)建是由RT-PCR擴(kuò)增出的人腸三葉因子基因序列，經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切，然后插入用同樣的限制性內(nèi)切酶處理過(guò)的酵母表達(dá)載體pPICZaA，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Top10，以濃度20～30μg/ml Zeocin的低鹽LB平板篩選重組質(zhì)粒，得到含有重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA-hITF的重組大腸桿菌Top10。
4.按照權(quán)利要求1所述的采用GS115酵母菌合成重組人腸三葉因子的工藝，其特征在于所說(shuō)的酶切及測(cè)序鑒定是從大腸桿菌Top10中提取小量質(zhì)粒pPICZaA-hITF，用EcoRI和NotI消化，切下預(yù)期大小片段，按設(shè)計(jì)編碼pPICZaA-hITF序列，分別為210bp和3600bp；再用重組質(zhì)粒pPICZaA-hITF酶切電泳圖和pPICZaA-hITF測(cè)序圖譜測(cè)序鑒定。
5.按照權(quán)利要求1所述的采用GS115酵母菌合成重組人腸三葉因子的工藝，其特征在于所說(shuō)的誘導(dǎo)表達(dá)是選取陽(yáng)性克隆Mut+進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)至96小時(shí)后，離心分離胞體和上清，獲得酵母GS115-hITF上清液。
6.按照權(quán)利要求1所述的采用GS115酵母菌合成重組人腸三葉因子的工藝，其特征在于所說(shuō)的純化是將酵母菌GS115-hITF上清液冷凍干燥，從1000ml濃縮至100ml，把濃縮上清移入超濾離心管，離心20～30分鐘去除大部分大分子量雜蛋白，再將濾出液通過(guò)鎳離子柱，10～50毫摩爾咪唑漂洗雜蛋白，100～g00毫摩爾咪唑洗脫目的蛋白，然后把洗脫液移入超濾離心管，離心20～30分鐘去除鹽分、咪唑等小分子物質(zhì)，最后將目的蛋白用孔徑0.2微米的濾器過(guò)濾除菌，冷凍干燥成粉末狀，-80℃長(zhǎng)期保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程的DNA或RNA、載體和質(zhì)粒，或其分離、制備或純化。是一種采用GS115酵母菌合成重組人腸三葉因子的工藝包括目的基因的獲取、酵母表達(dá)載體的構(gòu)建、酶切及測(cè)序鑒定、轉(zhuǎn)化入GS115酵母菌、誘導(dǎo)表達(dá)和純化六步過(guò)程。按照本發(fā)明表達(dá)方法獲得的重組人腸三葉因子，表達(dá)產(chǎn)量可達(dá)100mg/L，提純純度可達(dá)95％或更高，純化的蛋白產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)結(jié)果表明用本發(fā)明表達(dá)方法獲得的重組人腸三葉因子為高純度、無(wú)熱源、無(wú)內(nèi)毒素，有正確的分子量，與天然的腸三葉因子有相同的等電點(diǎn)、氨基酸序列和紫外光譜，及其完好的生物學(xué)活性的重組蛋白。它在治療由各種致傷因子引起的胃腸粘膜損傷等方面具有顯著效果。
文檔編號(hào)C12N15/81GK1782067SQ20051005729
公開(kāi)日2006年6月7日 申請(qǐng)日期2005年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月27日
發(fā)明者彭曦, 孫勇, 汪仕良, 黃躍生 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院