專利名稱：含嗅鞘細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)組織工程支架的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種組織工程技術(shù)，特指一種含嗅鞘細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)組織工程支架的制作方法。
背景技術(shù)：
組織工程技術(shù)在修復(fù)組織或器官方面具有良好的臨床應(yīng)用前景，組織工程支架的構(gòu)建是該技術(shù)的核心內(nèi)容。但目前組織工程支架材料主要是人工合成的高分子聚合物和動植物源性的天然材料。有中國專利CN02138129.1用家蠶絲為材料構(gòu)建組織工程支架的方法，有中國專利CN02149086.4以殼聚糖、醋酸、氫氧化鈉為原料制備多孔殼聚糖管的方法。國外，Teng等人在《美國科學(xué)院院報(bào)》2002年第99卷3024-3029頁(Proc Natl Acad Sci USA，2002，993024-3029)論文“一種種植有神經(jīng)干細(xì)胞的高聚體支架可促進(jìn)脊髓損傷后的功能恢復(fù)”(Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediatedby a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells)中報(bào)道，組織工程支架可用于治療脊髓損傷，但是目前沒有針對治療脊髓損傷的特殊支架。因?yàn)槿梭w組織是由細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞組成的，在國內(nèi)以上所述的專利中所用支架材料不能完全等同于細(xì)胞外基質(zhì)，僅起支架作用，細(xì)胞外基質(zhì)材料的組織相容性明顯優(yōu)于上述支架材料。一種理想的組織工程支架除應(yīng)選用具有良好的組織相容性的支架材料外，種植于支架的種子細(xì)胞也是決定支架的生物學(xué)功能的關(guān)鍵因素。Teng等人上述報(bào)道的種子細(xì)胞為干細(xì)胞，其成“橋”性和成髓鞘性不如嗅鞘細(xì)胞，加之前者的細(xì)胞來源困難，其臨床應(yīng)用受到限制。國內(nèi)鞠躬實(shí)驗(yàn)室孟曉梅等在《解剖學(xué)報(bào)》2003年第3期246-250頁的論文“纖維蛋白膠包裹嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞促進(jìn)脊髓軸突再生的實(shí)驗(yàn)研究”中報(bào)道，用纖維蛋白原溶液將嗅鞘細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以微玻管多點(diǎn)分次將總量2微升的細(xì)胞懸液注入脊髓橫斷后的間隙內(nèi)，發(fā)現(xiàn)有再生神經(jīng)纖維穿過間隙。國外，Millaruelo等在《腦研究》1988年第466期219-228頁(Brain Res，1988，466219-228)的論文“神經(jīng)生長因子和層粘連蛋白、纖維粘連蛋白共同作用促進(jìn)感覺神經(jīng)元的成活和神經(jīng)生長”(Cooperation between nerve growth factor and Lamininor Fibronectin in promoting sensory neuron survival and neuriteoutgrowth)報(bào)道細(xì)胞外基質(zhì)有利于神經(jīng)細(xì)胞的生長。但是在上述報(bào)道中均未提及將層粘連蛋白、纖維粘連蛋白和纖維蛋白原制作成三維網(wǎng)狀支架用于移植修復(fù)脊髓損傷。

發(fā)明內(nèi)容
針對目前在組織工程技術(shù)治療脊髓損傷方面，現(xiàn)有的組織工程支架大多為人工合成的高分子聚合物，其組織相容性較差，種子細(xì)胞來源困難及成“橋”性不明顯等不足。本發(fā)明利用嗅鞘細(xì)胞取材容易及其其成“橋”性和誘導(dǎo)神經(jīng)再生能力強(qiáng)，層粘連蛋白(Laminin)、纖維粘連蛋白(Fibronectin)和纖維蛋白原的組織相容性好的優(yōu)點(diǎn)，將該四種成分制作成組織相容性好，誘導(dǎo)神經(jīng)再生能力強(qiáng)、具有臨床應(yīng)用前景的“含嗅鞘細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)組織工程支架”。如將本發(fā)明應(yīng)用于臨床治療脊髓損傷，可望提高組織工程支架移植治療脊髓損傷的療效。
實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案為(1)嗅鞘細(xì)胞的體外培養(yǎng)和純化自清潔級成年SD大鼠鼻粘膜嗅區(qū)分離剪取嗅粘膜制成細(xì)胞懸液，用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)上述細(xì)胞，經(jīng)傳代培養(yǎng)純化出嗅鞘細(xì)胞。
(2)組織工程支架的制作及種子細(xì)胞即嗅鞘細(xì)胞的種植用通用的含胎牛血清的F12培養(yǎng)基溶解層粘連蛋白Laminin、纖維粘連蛋白Fibronectin，其終濃度為10-20μg/ml，及終濃度為100-200mg/ml纖維蛋白原凍干粉制成復(fù)方膠狀液，隨后以該膠狀液與新鮮大鼠血漿按體積比10∶1至20∶1的比例加入同種來源的新鮮大鼠血漿，將該膠狀液滴加于所需模具中。上述膠狀液在血漿中的凝血因子作用下即轉(zhuǎn)變?yōu)榘牍腆w的三維網(wǎng)狀支架。用微量注射器將10～50μl純化的、細(xì)胞濃度為1×106/m1～1×107/m1嗅鞘細(xì)胞懸液接種于支架，將支架浸入上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)4～14天后，上述支架即可用于下述鑒定和評價。
(3)嗅鞘細(xì)胞組織工程支架的形態(tài)學(xué)觀察上述含種子細(xì)胞的組織工程支架經(jīng)常規(guī)多聚甲醛固定液固定后，用掃描電子顯微鏡觀察支架的三維結(jié)構(gòu)。將支架制作成冰凍切片和組織壓片，用嗅鞘細(xì)胞標(biāo)志蛋白S-100的抗體進(jìn)行免疫熒光染色，用熒光顯微鏡觀察熒光標(biāo)記的嗅鞘細(xì)胞在支架內(nèi)的增殖、遷移和排列成“橋”情況。
(4)組織工程支架的組織相容性和體內(nèi)降解過程的組織學(xué)觀察將組織工程支架植入大鼠皮下(表面標(biāo)記)，動物繼續(xù)飼養(yǎng)4天～14天后，取出植入支架及周圍組織，經(jīng)上述固定液固定后，對該組織進(jìn)行組織學(xué)切片。切片經(jīng)H-E染色后，顯微鏡觀察周圍組織內(nèi)的細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等)向支架內(nèi)浸潤的程度。切片經(jīng)Laminin抗體免疫組織化學(xué)染色后，觀察支架內(nèi)新生毛細(xì)血管(基底膜為Laminin染色陽性)的密度。
3.有益效果(1)本方法制作的細(xì)胞外基質(zhì)組織工程支架具有很好的三維立體空間，支架內(nèi)部為多孔結(jié)構(gòu)，有利于種子細(xì)胞生長和延伸以及支架內(nèi)外的物質(zhì)交換；(2)該支架具有很好的可塑性，可用不同模具制作成各種所需外形，以利于移植；(3)該支架具有很好的組織相容性，支架植入體內(nèi)可誘導(dǎo)新生血管長入支架；(4)該支架具有可降解性，植入體內(nèi)可逐漸被體內(nèi)組織替代，在體外亦可逐漸被水解；(5)本方法培養(yǎng)的種子細(xì)胞即嗅鞘細(xì)胞具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性和明顯的成“橋”性，在支架體內(nèi)生長良好。


圖1A示剛制作的圓柱狀的組織工程支架(臺盼藍(lán)染色)；B示臺盼藍(lán)染色的組織工程支架浸入雙蒸水中21天后，支架水解，水溶液為藍(lán)色。
圖2組織工程支架的透射電鏡照片，可見支架內(nèi)部為纖維狀多孔結(jié)構(gòu)。
圖3支架植入大鼠皮下4天，可見新生血管(Laminin染色呈棕黃色)長入支架內(nèi)。
圖4支架植入大鼠皮下14天，支架內(nèi)新生血管明顯多于圖3(4天組)。
圖5嗅鞘細(xì)胞種植于柱狀支架內(nèi)體外培養(yǎng)4天后，組織工程支架的組織壓片內(nèi)可見被核熒光標(biāo)記的嗅鞘細(xì)胞密集分布于支架內(nèi)。
圖6嗅鞘細(xì)胞種植于毯狀支架表面，體外培養(yǎng)14天后，可見S-100免疫熒光染色陽性的、具有長突起的嗅鞘細(xì)胞。
圖7嗅鞘細(xì)胞種植于柱狀支架內(nèi)，體外培養(yǎng)14天后經(jīng)透射電鏡觀察，嗅鞘細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)正常。
圖8嗅鞘細(xì)胞種植于毯狀支架表面，體外培養(yǎng)14天后，掃描電鏡觀察支架表面，可見嗅鞘細(xì)胞突起細(xì)長并平行排列。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.
(1)嗅鞘細(xì)胞的體外培養(yǎng)和純化自清潔級成年SD大鼠鼻粘膜嗅區(qū)分離剪取嗅粘膜制成細(xì)胞懸液，用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)上述細(xì)胞，經(jīng)傳代培養(yǎng)純化出嗅鞘細(xì)胞。
(2)組織工程支架的制作及種子細(xì)胞(嗅鞘細(xì)胞)的種植①支架的制作用通用的含胎牛血清的F12培養(yǎng)基溶解層粘連蛋白(終濃度為10μg/ml)、纖維粘連蛋白(終濃度為10μg/ml)和纖維蛋白原(終濃度為100mg/ml)三種細(xì)胞外基質(zhì)材料，制成復(fù)方膠狀液，隨后以該膠狀液與新鮮大鼠血漿的體積比為20∶1的比例加入新鮮大鼠血漿，立即將該膠狀液吸入直徑為3mm的玻璃管中，數(shù)分鐘后上述膠狀液即轉(zhuǎn)變?yōu)榘牍腆w的圓柱狀的組織工程支架。用洗耳球?qū)⒉ＡЧ軆?nèi)成型的組織工程支架吹出，用刀片將柱狀支架切割成直徑為3mm，高7mm的圓柱體。該支架可用于形態(tài)學(xué)觀察和組織相容性試驗(yàn)。
②種子細(xì)胞(嗅鞘細(xì)胞)的種植用微量注射器將10μl的經(jīng)核熒光標(biāo)記的純化的嗅鞘細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為1×105/ml)接種于上述支架，至此，圓柱狀的含嗅鞘細(xì)胞組織的工程支架組織工程支架即制作成功，將支架浸入上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)4天后，上述支架即可用于下述鑒定和評價。
(3)嗅鞘細(xì)胞組織工程支架的形態(tài)學(xué)觀察上述含種子細(xì)胞的組織工程支架經(jīng)常規(guī)多聚甲醛固定液固定后，將支架制作成冰凍切片和組織壓片，用嗅鞘細(xì)胞標(biāo)志蛋白S-100的抗體進(jìn)行免疫熒光染色，用熒光顯微鏡觀察熒光標(biāo)記的嗅鞘細(xì)胞在支架內(nèi)的增殖、遷移和排列成“橋”情況，用透射電鏡觀察支架和嗅鞘細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。
(4)組織工程支架的組織相容性和體內(nèi)降解過程的組織學(xué)觀察將組織工程支架植入大鼠皮下(表面標(biāo)記)，動物繼續(xù)飼養(yǎng)4天后，取出植入支架及周圍組織，經(jīng)上述固定液固定后，對該組織進(jìn)行組織學(xué)切片。切片經(jīng)H-E染色后，顯微鏡觀察周圍組織內(nèi)的細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等)向支架內(nèi)浸潤的程度。切片經(jīng)Laminin抗體免疫組織化學(xué)染色后，觀察支架內(nèi)新生毛細(xì)血管(基底膜為Laminin染色陽性)的密度。
實(shí)施例2(1)嗅鞘細(xì)胞的體外培養(yǎng)和純化自清潔級成年SD大鼠鼻粘膜嗅區(qū)分離剪取嗅粘膜制成細(xì)胞懸液，用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)上述細(xì)胞，經(jīng)傳代培養(yǎng)純化出嗅鞘細(xì)胞。
(2)組織工程支架的制作及種子細(xì)胞(嗅鞘細(xì)胞)的種植①支架的制作用通用的含胎牛血清的F12培養(yǎng)基溶解層粘連蛋白(終濃度為15μg/ml)、纖維粘連蛋白(終濃度為15μg/ml)和纖維蛋白原(終濃度為150mg/ml)三種細(xì)胞外基質(zhì)材料，制成復(fù)方膠狀液，隨后以該膠狀液與新鮮大鼠血漿的體積比為15∶1的比例加入新鮮大鼠血漿，立即將該膠狀液吸入直徑為5mm的玻璃管中，數(shù)分鐘后上述膠狀液即轉(zhuǎn)變?yōu)榘牍腆w的圓柱狀的組織工程支架。用洗耳球?qū)⒉ＡЧ軆?nèi)成型的組織工程支架吹出，用刀片將柱狀支架切割成直徑為5mm，高10mm的圓柱體。該支架可用于形態(tài)學(xué)觀察和組織相容性試驗(yàn)。
②種子細(xì)胞(嗅鞘細(xì)胞)的種植用微量注射器將20μl的經(jīng)核熒光標(biāo)記的純化的嗅鞘細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為1×106/ml)接種于上述支架，至此，圓柱狀的含嗅鞘細(xì)胞組織的工程支架組織工程支架即制作成功，將支架浸入上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后，上述支架即可用于下述鑒定和評價。
(3)嗅鞘細(xì)胞組織工程支架的形態(tài)學(xué)觀察上述含種子細(xì)胞的組織工程支架經(jīng)常規(guī)多聚甲醛固定液固定后，將支架制作成冰凍切片和組織壓片，用嗅鞘細(xì)胞標(biāo)志蛋白S-100的抗體進(jìn)行免疫熒光染色，用熒光顯微鏡觀察熒光標(biāo)記的嗅鞘細(xì)胞在支架內(nèi)的增殖、遷移和排列成“橋”情況，用透射電鏡觀察支架和嗅鞘細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。
(4)組織工程支架的組織相容性和體內(nèi)降解過程的組織學(xué)觀察將組織工程支架植入大鼠皮下(表面標(biāo)記)，動物繼續(xù)飼養(yǎng)14天后，取出植入支架及周圍組織，經(jīng)上述固定液固定后，對該組織進(jìn)行組織學(xué)切片。切片經(jīng)H-E染色后，顯微鏡觀察周圍組織內(nèi)的細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等)向支架內(nèi)浸潤的程度。切片經(jīng)Laminin抗體免疫組織化學(xué)染色后，觀察支架內(nèi)新生毛細(xì)血管(基底膜為Laminin染色陽性)的密度。
實(shí)施例3.
(1)嗅鞘細(xì)胞的體外培養(yǎng)和純化自清潔級成年SD大鼠鼻粘膜嗅區(qū)分離剪取嗅粘膜制成細(xì)胞懸液，用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)上述細(xì)胞，經(jīng)傳代培養(yǎng)純化出嗅鞘細(xì)胞。
(2)組織工程支架的制作及種子細(xì)胞(嗅鞘細(xì)胞)的種植用通用的含胎牛血清的F12培養(yǎng)基溶解層粘連蛋白(終濃度為20μg/ml)、纖維粘連蛋白(終濃度為20μg/ml)和纖維蛋白原(終濃度為200mg/ml)三種細(xì)胞外基質(zhì)材料，制成復(fù)方膠狀液，隨后以該膠狀液與新鮮大鼠血漿的體積比為10∶1的比例加入新鮮大鼠血漿，取該膠狀液200μl滴入24孔培養(yǎng)板的置有圓蓋片的孔內(nèi)，隨后加入新鮮大鼠血漿20μl，數(shù)分鐘后上述膠狀液即轉(zhuǎn)變?yōu)榘牍腆w的毯狀組織工程支架。用微量注射器將50μl純化的嗅鞘細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為1×107/ml)接種于支架，將支架浸入上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)14天后，上述支架即可用于下述鑒定和評價。
(3)嗅鞘細(xì)胞組織工程支架的形態(tài)學(xué)觀察上述含種子細(xì)胞的組織工程支架經(jīng)常規(guī)多聚甲醛固定液固定后，將支架制作成冰凍切片和組織壓片，用嗅鞘細(xì)胞標(biāo)志蛋白S-100的抗體進(jìn)行免疫熒光染色；用熒光顯微鏡觀察熒光標(biāo)記的嗅鞘細(xì)胞在支架表面的增殖、遷移和排列成“橋”情況；用掃描電子顯微鏡觀察表面嗅鞘細(xì)胞的立體結(jié)構(gòu)。
權(quán)利要求
1.含嗅鞘細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)組織工程支架的制作方法，其特征在于采用通用的含胎牛血清的F12培養(yǎng)基，以終濃度為10～20μg/ml的層粘連蛋白、終濃度為10～20μg/ml纖維粘連蛋白及終濃度為100～200mg/ml纖維蛋白原制成該三種細(xì)胞外基質(zhì)材料的復(fù)方膠狀液，隨后按膠狀液與血漿體積比為10∶1～20∶1的比例加入同種來源的新鮮血漿，將該膠狀液滴加于所需模具中固化成三維支架；用微量注射器將10～50μl純化的、細(xì)胞濃度為1×105/ml～1×107/ml的嗅鞘細(xì)胞懸液接種于支架，將支架浸入上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)即可。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備含嗅鞘細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)組織工程支架的方法，屬于組織工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以溶解層粘連蛋白(終濃度為10～20μg/ml)、纖維粘連蛋白(終濃度為10～20μg/ml)和纖維蛋白原(終濃度為100～200mg/ml)為原料，制成細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)方膠狀液，并按10∶1至20∶1的比例加入到同種來源的新鮮血漿中，置入特定的模具中制成三維網(wǎng)狀支架，并將體外培養(yǎng)的嗅鞘細(xì)胞種植于支架。經(jīng)形態(tài)學(xué)和組織相容性鑒定，本發(fā)明制備的支架具有良好的組織相容性，嗅鞘細(xì)胞在支架中生長良好，該支架可用于移植治療脊髓損傷。
文檔編號C12N11/00GK1807600SQ20061003818
公開日2006年7月26日 申請日期2006年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月8日
發(fā)明者張志堅(jiān), 龔愛華, 錢雷敏, 孫湘蘭, 姜平, 王永忠, 任春蘭, 端禮榮 申請人:江蘇大學(xué)