專利名稱：用于制備嗅鞘細(xì)胞的裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 公開了用于制備嗅鞘細(xì)胞的裝置，屬于生物技術(shù)與組織工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
嗅鞘細(xì)胞(olfactoryensheathingcells, OECs)是在功能上介于許旺細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞之間的一種特殊的膠質(zhì)細(xì)胞，具有神經(jīng)營養(yǎng)、抑制膠質(zhì)增生、瘢痕形成、成鞘作用等。為軸突生長提供了適宜的微環(huán)境及較強(qiáng)的遷移的特性。嗅鞘細(xì)胞是目前所發(fā)現(xiàn)的極少數(shù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)可以再生的細(xì)胞之一。其特點為終身具有神經(jīng)再生功能，還能夠釋放多種神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)粘附分子，被認(rèn)為是髓鞘化能力最強(qiáng)的膠質(zhì)細(xì)胞。嗅鞘細(xì)胞與膠質(zhì)細(xì)胞、許旺細(xì)胞在表現(xiàn)型上有共同點，它們都能促進(jìn)軸突的再生，主要區(qū)別在于嗅鞘細(xì)胞不但存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，也存在于外周神經(jīng)中。嗅黏膜中的神經(jīng)元是唯一生后才生長并在成年時繼續(xù)分化的神經(jīng)元，壽命為4 12周，隨著新細(xì)胞的生長，又建立了新的神經(jīng)支配關(guān)系。嗅鞘細(xì)胞存在于嗅神經(jīng)及嗅球的神經(jīng)層上，沿嗅神經(jīng)的全長，從周圍神經(jīng)系統(tǒng)到中樞神經(jīng)分布。嗅鞘細(xì)胞和嗅上皮均來源于嗅基板，而嗅球與其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)均起源于神經(jīng)管，因此在胚胎發(fā)育過程中嗅上皮與嗅球發(fā)育是兩種不同的方向，原始嗅覺神經(jīng)元伴隨大量基板細(xì)胞從嗅上皮傳出軸突向端腦泡方向遷移，其中嗅鞘細(xì)胞引導(dǎo)嗅神經(jīng)軸突到達(dá)端腦泡，這些細(xì)胞形成早期的嗅球，接著嗅球發(fā)生外翻，遷移細(xì)胞覆在其表面形成一薄層，接著它們穿透膠質(zhì)界膜引導(dǎo)形成嗅神經(jīng)層和小球?qū)?，成為覆蓋在嗅球表面新的膠質(zhì)界膜，不同于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和其它組織的是:在成人階段嗅鞘細(xì)胞依然可穿過這種膠質(zhì)界膜。嗅鞘細(xì)胞是一種嗅神經(jīng)的支持細(xì)胞，它包被神經(jīng)軸突遷徙入腦，在顱底它和嗅球的僧帽細(xì)胞相結(jié)合。分布于嗅神經(jīng)的全長，從嗅上皮基底膜一直到嗅球，主要位于嗅神經(jīng)的纖維層。嗅鞘細(xì)胞具有雪旺氏細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的特性，但總的表現(xiàn)更趨于前者，它有兩個獨特的特征。第一，它不僅存在于外周神經(jīng)(雪旺氏細(xì)胞)，而且存在于中樞神經(jīng)(星形膠質(zhì)細(xì)胞)；第二，嗅粘膜具有終生再生能力，包括人類的嗅鞘細(xì)胞，這種再生是嗅鞘細(xì)胞參與高效調(diào)控的過程，盡管現(xiàn)在不清楚具體的機(jī)制。嗅鞘細(xì)胞不同于星形細(xì)胞和雪旺氏細(xì)胞，但同時兼有這兩種細(xì)胞的特性，有象雪旺氏細(xì)胞有助于軸突生長的作用，但比雪旺氏細(xì)胞更能使軸突長距離生長，即具有更強(qiáng)的遷徙性；也有象星形膠質(zhì)細(xì)胞一樣對神經(jīng)元的存活及軸突的生長具有營養(yǎng)作用，但嗅鞘細(xì)胞還能夠包裹神經(jīng)元形成髓鞘，支持神經(jīng)突起的生長。正是這兩種特性使得嗅鞘細(xì)胞成為神經(jīng)修復(fù)的最佳選擇。目前，嗅鞘細(xì)胞的研究大多集中于組織工程領(lǐng)域，細(xì)胞需求量大。因此，結(jié)合生物工程的灌流培養(yǎng)系統(tǒng)，降低制備過程中的污染機(jī)率，提高擴(kuò)增速度具有重要的指導(dǎo)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供用于制備嗅鞘細(xì)胞的裝置。本發(fā)明提供的用于細(xì)胞培養(yǎng)的灌流裝置，包括灌流瓶和廢液瓶，還包括設(shè)置在灌流瓶和廢液瓶之間的灌流反應(yīng)器，所述灌流反應(yīng)器的一端設(shè)有進(jìn)液口，另一端設(shè)有出液口，所述灌流瓶通過管道與所述灌流反應(yīng)器的進(jìn)液口相連通，所述廢液瓶通過管道與所述灌流反應(yīng)器的出液口相連通；所述 灌流反應(yīng)器包括細(xì)胞培養(yǎng)板，所述細(xì)胞培養(yǎng)板包括進(jìn)液口與出液口，所述細(xì)胞培養(yǎng)板的底部是孔徑能阻止待培養(yǎng)細(xì)胞穿過但能實現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)液通過的半透膜。上述灌流瓶與廢液瓶的瓶蓋上均設(shè)有穿過所述瓶蓋的氣體濾頭。這樣可以使得罐流瓶以及廢液瓶內(nèi)的壓強(qiáng)與外界相同，并且可以隔絕外界空其中的細(xì)菌污染。上述管道上設(shè)置有至少一個蠕動泵。這樣控制培養(yǎng)基液體在灌流裝置中的流速以適應(yīng)細(xì)胞的營養(yǎng)需求，可控制液體的流速是0.02-0.45ml/h。具體地講，所述灌流瓶與灌流反應(yīng)器的進(jìn)液口之間的管道上設(shè)置一個蠕動泵；所述灌流反應(yīng)器的出液口和廢液瓶之間的管道上設(shè)置一個蠕動泵。所述灌流反應(yīng)器的進(jìn)液口和與所述管道的連接處設(shè)有管道夾；所述灌流反應(yīng)器的出液口和與所述管道的連接處設(shè)有管道夾，這樣可以加固連接。本發(fā)明的用于制備嗅鞘細(xì)胞的裝置，可以縮減操作步驟，減少污染機(jī)率，防止代謝物累計，提高擴(kuò)增效率。


圖1為本發(fā)明實施例1的結(jié)構(gòu)示意圖。圖號說明:1灌流瓶，2和8氣體濾頭，3輸入管，4和6蠕動泵，5灌流反應(yīng)器，7輸出管，9廢液瓶。
具體實施例方式1、胚胎來源的嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)及擴(kuò)增無菌條件下用眼科鑷和組織剪從小鼠胚胎腦組織內(nèi)分離出嗅神經(jīng)球結(jié)構(gòu)，適當(dāng)保留嗅三角區(qū)，置于培養(yǎng)皿內(nèi)。用DF12培養(yǎng)液充分沖洗，去除血污。然后用顯微鑷將嗅球周圍包膜剝除，如組織內(nèi)有淤血，應(yīng)盡量清除。將剝離好的嗅球組織轉(zhuǎn)移另一新的玻璃皿內(nèi)，用組織剪盡量剪碎。加入少量DF12培養(yǎng)液，用玻璃吸管輕輕吹打。將組織塊懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，離心。根據(jù)組織塊數(shù)量，按10-15個組織塊/cm2密度接種于右旋多聚賴氨酸(Poly-L-1ysine)處理過的灌流反應(yīng)器5內(nèi)。將灌流反應(yīng)器5置于37°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的C02培養(yǎng)箱中的灌流系統(tǒng)中，與輸入管3和輸出管7相連,進(jìn)行培養(yǎng)。2、灌流裝置的運(yùn)行如圖1所示，一種用于制備嗅鞘細(xì)胞的裝置，包括灌流瓶I和廢液瓶9。灌流瓶I的瓶蓋與廢液瓶9的瓶蓋上分別設(shè)有穿過各自瓶蓋的氣體濾頭2和8，這樣可以使得罐流瓶I以及廢液瓶9內(nèi)的壓強(qiáng)與外界相同，并且可以隔絕外界空其中的細(xì)菌污染。如圖1所示，本發(fā)明提供的灌流裝置還包括灌流反應(yīng)器5，該灌流反應(yīng)器5設(shè)置在灌流瓶I和廢液瓶9之間。灌流瓶I通過輸入管3與灌流反應(yīng)器5的進(jìn)液口相連通，廢液瓶9通過輸出管7與所述灌流反應(yīng)器5的出液口相連通。為了控制培養(yǎng)基液體在灌流裝置中的流速以適應(yīng)細(xì)胞的營養(yǎng)需求，可在輸入管3和輸出管7上分別設(shè)置蠕動泵4和6，可控制液體的流速是0.02-0.45ml/h。
如圖1所示，灌流反應(yīng)器5包括可封閉的槽體和設(shè)置在所述槽體內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)孔板。

本發(fā)明裝 置在使用時，先將分離細(xì)胞接種到灌流反應(yīng)器5內(nèi)，加入培養(yǎng)基與特定病毒載體后，放入37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48小時后開啟蠕動閥4和6，并控制液體的流速為0.02-0.45ml/h。普通培養(yǎng)液置于灌流瓶I中，通過蠕動泵4的運(yùn)動將培養(yǎng)液在輸入管3內(nèi)輸送到灌流反應(yīng)器5內(nèi)，流經(jīng)反應(yīng)器5內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)板，由輸出管7輸送到廢液瓶9中收集；在培養(yǎng)基液體流速的控制過程中，液體的流速由輸入管3和輸出管7上的蠕動泵4和6控制，可隨時根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)的需求調(diào)整培養(yǎng)基液體的流速。此灌流系統(tǒng)一方面可以使新鮮培養(yǎng)基不斷泵入，另一方面含有代謝廢產(chǎn)物(乳酸、氨等)的廢液不斷排出，通過調(diào)節(jié)灌注速率，可以使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢產(chǎn)物與細(xì)胞之間的質(zhì)量傳遞，降低有害代謝廢物濃度積累。以上所述之實施方式為本發(fā)明的實施案例之一，并非以此限制本發(fā)明的實施范圍，故凡依本發(fā)明之形狀、構(gòu)造及原理所做的等效變化，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.用于制備嗅鞘細(xì)胞的裝置，包括灌流瓶和廢液瓶，其特征在于:所述灌流裝置還包括設(shè)置在灌流瓶和廢液瓶之間的灌流反應(yīng)器，所述灌流反應(yīng)器的一端設(shè)有進(jìn)液口，另一端設(shè)有出液口，所述灌流瓶通過管道與所述灌流反應(yīng)器的進(jìn)液口相連通，所述廢液瓶通過管道與所述灌流反應(yīng)器的出液口相連通； 所述灌流反應(yīng)器包括可封閉的槽體和設(shè)置在所述槽體內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)板所述培養(yǎng)孔的底部是孔徑能阻止待培養(yǎng)細(xì)胞穿過但能實現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)液通過的半透膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的灌流裝置，其特征在于:所述灌流瓶與廢液瓶的瓶蓋上均設(shè)有穿過所述瓶蓋的氣體濾頭。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一所述的灌流裝置，其特征在于:所述管道上設(shè)置有至少一個螺動栗。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微灌流裝置，其特征在于:所述灌流瓶與灌流反應(yīng)器的進(jìn)液口之間的管道上設(shè)置一個蠕動泵；所述灌流反應(yīng)器的出液口和廢液瓶之間的管道上設(shè)置一個蠕動泵。
本發(fā)明公開了一種用于制備嗅鞘細(xì)胞的裝置。該灌流裝置包括灌流瓶和廢液瓶，還包括設(shè)置在灌流瓶和廢液瓶之間的灌流反應(yīng)器，所述灌流反應(yīng)器的一端設(shè)有進(jìn)液口，另一端設(shè)有出液口，所述灌流瓶通過管道與所述灌流反應(yīng)器的進(jìn)液口相連通，所述廢液瓶通過管道與所述微灌流反應(yīng)器的出液口相連通；所述灌流反應(yīng)器包括可封閉的槽體和設(shè)置在所述槽體內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)板，所述培養(yǎng)孔的底部是孔徑能阻止待培養(yǎng)細(xì)胞穿過但能實現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)液通過的半透膜。采用本發(fā) 明裝置，可通過控制液體流動及時清除細(xì)胞代謝廢物，防止細(xì)胞代謝物堆積導(dǎo)致的細(xì)胞分化，并能有效降低污染機(jī)率。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于制備嗅鞘細(xì)胞的裝置，屬于生物技術(shù)與組織工程領(lǐng)域。其特征是利用灌流培養(yǎng)系統(tǒng)的連續(xù)性與封閉性，通過右旋多聚賴氨酸(Poly-L-lysine)處理過的灌流反應(yīng)器，進(jìn)行髓鞘細(xì)胞的擴(kuò)增。本發(fā)明的效果和益處是及時排除細(xì)胞代謝毒物，防止細(xì)胞代謝物堆積導(dǎo)致的細(xì)胞分化，促進(jìn)嗅鞘細(xì)胞的生長，降低污染率。
文檔編號C12M1/24GK103087917SQ201110330959
公開日2013年5月8日 申請日期2011年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月27日
發(fā)明者田杰 申請人:北京清美聯(lián)創(chuàng)干細(xì)胞科技有限公司