專利名稱：殺菌肽－x的發(fā)酵工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種殺菌肽-X發(fā)酵工藝。
背景技術(shù)：
殺菌肽-X基因的表達(dá)載體已由南京大學(xué)生物醫(yī)藥國家重點實驗室構(gòu)建完成，并實現(xiàn)了在搖瓶中的穩(wěn)定表達(dá)。隨著近年來殺菌肽作用機(jī)理的日漸清晰，殺菌肽對抗生素耐藥菌、病毒和腫瘤細(xì)胞的良好殺傷作用和本身極低的毒副作用，使獲得大量高純度的殺菌肽應(yīng)用于臨床試驗成為迫在眉睫的重要任務(wù)。但到目前為止，國內(nèi)僅有少量關(guān)于發(fā)酵生產(chǎn)殺菌肽的報道，并且多局限于搖瓶或5立升左右的小發(fā)酵罐，如南京農(nóng)業(yè)大學(xué)張素芳等人進(jìn)行的重組magainin抗菌肽表達(dá)條件的優(yōu)化(2004年第24卷第11期中國生物工程雜志)；華東理工大學(xué)周宇荀等人進(jìn)行的抗菌肽Adenoregulin基因工程菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化及分批發(fā)酵研究(2005年第21卷第4期生物工程學(xué)報)等，尚無工業(yè)化規(guī)模的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于建立一個穩(wěn)定、高表達(dá)且適合工業(yè)化規(guī)模的殺菌肽發(fā)酵工藝。
本發(fā)明提供了一種殺菌肽-X的發(fā)酵工藝。
本發(fā)明根據(jù)本工程菌的特性，制備大量殺菌肽-X的前提是首先要獲得大量TNF-b(腫瘤壞死因子b)和殺菌肽-X的融合蛋白，因此本發(fā)酵工藝以高純度的融合蛋白得率為衡量標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明的工藝包括1、用于發(fā)酵罐的種子種齡選擇本發(fā)明揭示了本工程菌發(fā)酵中菌種種齡對菌體生長和融合蛋白表達(dá)影響顯著，當(dāng)內(nèi)含表達(dá)質(zhì)粒PET11a-TNF-b-殺菌肽-X的大腸桿菌BL21(DE3)的菌體OD600在0.48～1.0范圍之內(nèi)，尤其是OD600在0.72左右時，用作發(fā)酵種子接種至罐內(nèi)，菌體生長速度快，pH值變化平緩，融合蛋白表達(dá)量高。
2、培養(yǎng)基配方優(yōu)化通過改變通用型的TB(高濃度肉湯)培養(yǎng)基中K2HPO4·3H2O含量從而改變起始發(fā)酵液pH，最終獲得的包涵體量比使用通用型的TB培養(yǎng)基最高可提高一倍，達(dá)到5.05g每升發(fā)酵液，其中融合蛋白含量＞80％。
本發(fā)明詳述如下1、種子種齡選擇種子種齡選擇過程以通用型TB培養(yǎng)基，即高濃度肉湯為培養(yǎng)基，種子菌體的OD600試驗范圍為0.15～1.18。當(dāng)OD600低于0.48或高于1.0時，菌體生長過慢或過快，最終檢測得出融合蛋白表達(dá)都極低。只有菌體OD600處于0.48～1.0之間時，菌體生長迅速且融合蛋白表達(dá)隨時間逐步升高。尤其在OD600為0.72時，發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液OD600可達(dá)到14.2左右，包涵體得率可達(dá)2.5g/L(通用型TB培養(yǎng)基)。
2、培養(yǎng)基配方優(yōu)化根據(jù)通用型TB培養(yǎng)基，我們試驗了K2HPO4·3H2O含量對發(fā)酵過程的影響。當(dāng)K2HPO4·3H2O含量在1.64g/L～16.4g/L范圍內(nèi)時，都能取得較好的包涵體得率，其中以改良的TB培養(yǎng)基中K2HPO4·3H2O的含量取5.5g/L左右為最佳。當(dāng)使用通用型TB培養(yǎng)基時，起始pH7.56，發(fā)酵過程中pH由7.56降至5.81后回升至6.5，包涵體得率為2.51g/L。當(dāng)改良的TB培養(yǎng)基中K2HPO4·3H2O含量為5.5g/L時，起始pH7.13左右，發(fā)酵過程中pH由7.13降至4.81，包涵體得率為5.05g/L，比通用型TB培養(yǎng)基得率提高一倍。當(dāng)改良的TB培養(yǎng)基中K2HPO4·3H2O含量為1.64g/L時，起始pH6.56左右，發(fā)酵過程中pH由6.56降至5.13，包涵體得率為4.15g/L，比K2HPO4·3H2O含量為5.5g/L時有所下降，但仍比通用型TB培養(yǎng)基得率提高0.65倍。
本發(fā)明工藝在已有技術(shù)的基礎(chǔ)上，找到了影響本工程菌發(fā)酵的關(guān)鍵因素，即合適的種子種齡、發(fā)酵液豐富的營養(yǎng)及其合適的緩沖體系。利用此工藝可實現(xiàn)TNF-b(腫瘤壞死因子b)和殺菌肽-X的融合蛋白的高表達(dá)，達(dá)到包涵體得率5.05g/L；培養(yǎng)基組成簡單，無需添加各類微量元素；無需補(bǔ)料，生產(chǎn)周期短(一般為10h～12h)，充分體現(xiàn)了利用大腸桿菌生產(chǎn)重組蛋白得率高、價格低廉、操作簡單等優(yōu)點。
具體實施例方式實施例采用30L自動控制發(fā)酵罐(由上海高機(jī)實業(yè)公司生產(chǎn))，投料20L(每升培養(yǎng)基中含細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨12g，細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物24g，甘油4ml，K2HPO4·3H2O5.5g，KH2PO42.31g)。按4％，即800ml接種OD600為0.72的搖瓶菌，通氣量160L/h，罐壓0.02～0.04MPa，溫度37℃，攪拌轉(zhuǎn)速150r/min，溶氧和pH自然變化，發(fā)酵時間為12h，從4h開始每隔2h取樣測OD600和pH(具體數(shù)據(jù)見表一)，并留樣進(jìn)行SDS-PAGE。將SDS-PAGE圖譜進(jìn)行灰度掃描可知工程菌在接種4h后開始表達(dá)融合蛋白，5～12h內(nèi)一直保持較高的表達(dá)量，融合蛋白在菌體總蛋白中的含量達(dá)到45％～50％。最終放罐后離心菌體，懸浮于磷酸緩沖液中用均質(zhì)機(jī)(丹麥APV公司生產(chǎn)，型號APV1000)破碎細(xì)胞。10,000r/min離心破碎細(xì)胞15min收集沉淀，依次用2mol/L尿素，0.5％NaCl/2％Triton(曲拉通)，TE溶液(pH8.0)(各2000ml)洗滌沉淀，最終得到101g沉淀，經(jīng)SDS-PAGE檢測得知其中融合蛋白含量大于80％。
表一發(fā)酵過程中OD600和pH變化詳細(xì)記錄

權(quán)利要求
1.一種殺菌肽-X的發(fā)酵工藝，其特征在于該工藝包括下列步驟(1)發(fā)酵種子菌體OD600在0.48～1.0菌種種齡的種子；(2)發(fā)酵培養(yǎng)基改良的TB培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基中含細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨12g，細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物24g，甘油4ml，KH2PO42.31g，K2HPO4·3H2O含量在1.64g/L～16.4g/L；(3)發(fā)酵工藝在發(fā)酵罐中加入培養(yǎng)基，接種OD600在0.48～1.0的菌種，在通氣量160l/h，罐壓0.02～0.04MPa，溫度37℃，攪拌轉(zhuǎn)速150r/min的條件下，發(fā)酵12小時；放罐后，離心收集菌體，懸浮于磷酸緩沖液中，用均質(zhì)機(jī)破碎細(xì)胞，然后于10000r/min離心破碎細(xì)胞，收集沉淀；沉淀依次用尿素，0.5％NaCl/2％Triton，TE溶液pH8.0洗滌后得到殺菌肽-X包涵體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種殺菌肽－X的發(fā)酵工藝。本發(fā)明通過選擇用于發(fā)酵的菌種種齡和優(yōu)化培養(yǎng)基，使融合蛋白得到高表達(dá)，最終每升發(fā)酵液可獲得包涵體5.05g，其中融合蛋白的含量＞80％。本發(fā)明是一種穩(wěn)定、高表達(dá)并適于工業(yè)化生產(chǎn)的殺菌肽－X發(fā)酵工藝。
文檔編號C12P21/02GK1884573SQ200610026829
公開日2006年12月27日 申請日期2006年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月24日
發(fā)明者沈益, 勞學(xué)剛, 張洪祖, 徐賢秀 申請人:浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠, 南京大學(xué)