專利名稱：一種序列特異性寡核苷酸探針及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種序列特異性寡核苷酸探針及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
用于基因序列變化分析的方法是基于與基因特定序列互補的一段序列特異性寡核苷酸探針(Sequence specific oligonucleotide probe，SSOP)對基因序列的特異性識別來實現(xiàn)的。當(dāng)探針和基因完全匹配時所形成的雜合體熱穩(wěn)定性高于含有錯配堿基的雜合體，每百分之一的錯配率將導(dǎo)致雜交體穩(wěn)定的溫度降低1～1.5℃(金冬雁等，分子克隆實驗指南，1992年第二版，P541)，據(jù)此通過控制雜交溫度和其它雜交條件可以使完全匹配的雜交體與含有錯配堿基的雜合體區(qū)分開來，從而達(dá)到基因分析的目的。
盡管理論上可以利用含有錯配堿基的探針和目標(biāo)基因形成的雜合體穩(wěn)定性差的現(xiàn)象對基因序列上的堿基變化進(jìn)行檢測，但是往往由于堿基錯配形式不同、基因序列不同、基因高級結(jié)構(gòu)的差異等因素造成實際情況比理論情況要復(fù)雜的多(Kawase Y.etal.Nucleic Acids Res.，14(19)7727，1986；Ikuta S.et al.，Nucleic Acids Res.，15(2)797，1987.；Zhang Y.et al.Biophysical journal，81(2)1133，2001.；Fang Dong F.et al.NucleicAcids Res.，29(15)3248，2001.)。為了提高對單個堿基變化的檢測準(zhǔn)確率，一般傾向于把探針設(shè)計的較短(＜15bp)，但是為了保持探針對基因識別的特異性和維持相對較高的雜交信號強度又不能使得探針太短，而且即使是相同長度的探針也會由于其GC含量不同、所檢測的可變堿基在探針上的位置和數(shù)量不同等原因?qū)е逻@種基于探針雜交的過程變得非常復(fù)雜(Bhaumik SR，Chary KV.J Biomol Struct Dyn.，20(2)199.2002.；Letowski J，Brousseau R，Masson L.J Microbiol Methods，57(2)269，2004)。其中，探針與靶序列的雜交特異性是最關(guān)鍵的因素，現(xiàn)有一些方法來提高探針檢測基因序列變化、特別是單個堿基變化的特異性，例如對核酸上的戊糖進(jìn)行化學(xué)修飾以提高探針Tm值的方法(也被稱為Locked Nucleic Acid，LNA法)(Jacobsen N.et al.Nucleic Acids Res.，30(19)e100，2002；Mouritzen P.et al.Expert Rev Mol Diagn.，3(1)27，2003.)、用肽核酸代替核酸作為探針的方法(也被稱為Peptide Nucleic Acid，PNA法)(Igloi GL.Proc Natl Acad Sci USA.95(15)8562，1998.)。另外，有人用堿基類似物(如3-硝基吡咯)對寡核酸探針中的某個堿基進(jìn)行替換從而拉大完全匹配和含單堿基突變探針之間Tm的差異(Guo Z，Liu Q，Smith LM.Nat.Biotechno1.，15331，1997.；Zhen G.，Smith LM.，Lloyd M.US Patent，5780233.)。
上述方法中，LNA法由于寡核苷酸探針序列的多變性使得在探針中摻入LNA堿基的個數(shù)和位置都很難把握，因此實際操作難度很大。而且，由于LNA法尚未被廣泛應(yīng)用，所以其探針合成成本和價格都較高，這也在某種程度上限制了其實用性；PNA法則由于其化學(xué)合成難度較大、成本較高(http//www.metabion.com)，使得在過去十多年的時間里該技術(shù)仍沒有得到較好的推廣應(yīng)用；采用堿基類似物代替探針中某個堿基的方法較上述方法有所改進(jìn)，但具體替代哪個堿基能達(dá)到最佳效果尚很難把握，關(guān)于替代的規(guī)律尚需要做很多研究工作，而且該類堿基類似物的使用量較小，探針合成成本較高，從而在某種程度上限制了該技術(shù)的推廣和應(yīng)用。因此，需要建立一種操作方便、價格便宜、實用性強的方法來提高探針雜交的特異性，使SSOP(Sequence specificoligonucleotide probe，序列特異性寡核苷酸探針)方法在基因序列分析中發(fā)揮更大的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是序列特異性寡核苷酸探針及其應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的序列特異性寡核苷酸探針，含有與靶基因互補的序列，其中，所述寡核苷酸探針上包括至少一個堿基突變。
在該寡核苷酸探針中，堿基突變可以是一個，也可以是一個以上，其是否能和靶序列很好雜交取決于突變的位置和堿基形式，優(yōu)選的是一個堿基突變。
這里，堿基突變的方式包括堿基的替換、堿基的缺失或堿基的插入等。堿基突變的位置為所述寡核苷酸探針的近末端。寡核苷酸探針的近末端是指3’或5’末端；突變的位置優(yōu)選是靠近3’或5’末端。寡核苷酸探針的長度為11-70個堿基，優(yōu)選為15-25個堿基。
本發(fā)明中，可以用于進(jìn)行堿基突變的堿基是A、T、C、G、U五種堿基中的一種或幾種，或者是稀有堿基(次黃嘌呤、黃嘌呤、次黃苷)等，也可以是除1-(2′-Deoxy-beta-D-ribofuranosyl)-3-nitropyrrole以外的堿基類似物或衍生物中的一種或幾種。
發(fā)明的發(fā)明人通過實驗證實，本發(fā)明的序列特異的寡核苷酸探針對單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測特異性大大提高，可以應(yīng)用于基因分型檢測中，特別是用于HLA基因分型檢測中。
本發(fā)明在與靶基因具有互補序列的探針的基礎(chǔ)上，利用堿基替換、堿基缺失或堿基插入等堿基突變的方式對其進(jìn)行改造，使得探針中產(chǎn)生一個或幾個新的人工引入的堿基突變，這種探針只與靶基因能雜交結(jié)合，與其他基因因結(jié)合穩(wěn)定性差而難于雜交，明顯提高寡核苷酸探針雜交的特異性，使得通常雜交反應(yīng)中遇到的假陽性和假陰性的問題基本得以解決。本分明的序列特異的寡核苷酸探針，合成原料來源充分，價格低廉，合成工藝成熟，雜交特異性高，具有廣泛的應(yīng)用價值。


圖1為探針上各個位點的標(biāo)號定義；圖2為實施例1芯片點樣模式圖；圖3為實施例1探針與芯片雜交的理論模式圖；圖4為實施例1普通探針與芯片的雜交結(jié)果圖；圖5為實施例1突變探針與芯片的雜交結(jié)果圖；圖6為實施例2芯片點樣模式圖；圖7為實施例2探針與芯片雜交的理論模式圖；圖8為實施例2普通探針與芯片的雜交結(jié)果圖；圖9為實施例2突變探針與芯片的雜交結(jié)果圖。
具體實施例方式
針對每個具體的SNP位點靶基因和與該位點相關(guān)的寡核苷酸探針上的堿基變化形式各有四種(A、T、C、G)，其中一種組合是匹配的情況，其他十二種形式均為錯配(A/A，A/C，A/G；T/T，T/C，T/G；C/C，C/A，C/T；G/G，G/A，G/T)。探針上各個位點的標(biāo)號如圖1所示，0號為該靶基因的SNP位點，這些位點都可以作為堿基突變的位置，可以采用的突變形式有插入、刪除、替換等。
實施例1、+5位插入堿基的探針檢測三種HLA基因序列實驗方法按Tm值從高到低的形式選擇三段長69bp的HLA基因序列序列15′-GGCATCAGGCCGCCCCAGCTCCGTCACCGCCCGGa/t/c/gACTCCCCCACGTCGCTGTCGAAGCGCACGGACTC-3’；序列25′-TAGGTGTCCACCGCGGCCCGCCTCTGCTCCAGGAa/t/c/gGTCCTTCTGGCTGTTCCAGTACTCGGCATCAGGC-3’
序列35′-AGTATCTGTCCAGGAACCGCACCCGCTCCGTCCCa/t/c/gTTGAAGAAATGACACTCCCTCTTAGGCTGCCACA-3’。
其中斜體小寫堿基代表各個序列的SNP位點。
合成得到SNP堿基分別為A、T、C、G四種形式的序列(Oligo)，其中Tm值從高到底的順序為序列1＞序列2＞序列3。將這些長69mer的Oligo固定在芯片上制備成如圖2所示的芯片點陣，圖2中A1、T1、C1、G1分別代表序列1中SNP位點堿基分別為A、T、C、G的四條靶序列；A2、T2、C2、G2分別代表序列2中SNP位點堿基分別為A、T、C、G的四條靶序列；A3、T3、C3、G3分別代表序列3中SNP位點堿基分別為A、T、C、G的四條靶序列，這十二條序列代表純合型的靶基因；A1C1代表由A1、C1兩條靶序列兩兩組合構(gòu)成的雜合型序列，其他如A1G1等的表示與此類似，代表雜合型的靶序列；其他，如Hex(QC)、PC、NC、BC分別代表芯片質(zhì)控對照、陽性對照、陰性對照、空白對照等質(zhì)控探針。
以一條普通探針(5′-TAMRA-TGGGGGAGTtCCGGGCGGT)和一條在+5位進(jìn)行了堿基插入型的堿基突變探針(5′-TAMRA-TGGGGGAGTtCCGGcGCGGT)對上述芯片按常規(guī)方法進(jìn)行雜交，探針與芯片的理論雜交結(jié)果如圖3所示，由于所選取的探針序列的SNP位點的堿基為T，因此理論上只有含有A1的靶序列能夠和探針雜交，其他均為SNP錯配形示。普通探針與芯片的實際雜交結(jié)果如圖4所示，堿基突變探針與芯片的實際雜交結(jié)果如圖5所示。雜交結(jié)果顯示，普通探針和10條靶序列都產(chǎn)生了較強的雜交，而堿基突變探針只與含有A1的靶序列產(chǎn)生了雜交，非常清晰的把含有單堿基變化的靶序列檢測出來，進(jìn)行堿基突變的寡核苷酸探針的雜交特異性得到了明顯提高。
實施例2、堿基替換的探針用于HLA樣品分型檢測已知HLA基因型的DNA樣品購于國際組織相容性協(xié)作組(InternationalHistocompatibility Working Group，IHWG)，這些樣品共52個，其信息見http//www.ihwg.org/shared/cbankservices.htm#ssopref，將這些樣品制備PCR產(chǎn)物后點在氨基修飾的玻片上制成HLA分型芯片，芯片的點樣模式如圖6所示，圖中，1-52表示所用的樣品，QC、PC、BC、NC分別表示芯片質(zhì)控對照、陽性對照、陰性對照、空白對照等質(zhì)控探針。
然后用熒光標(biāo)記的普通探針(K835515’-TAMRA-GGAACACACGGAAAGTGAA-3’)和在-7位進(jìn)行堿基替換的堿基突變探針(5’-TAMRA-GGcACACACGGAAAGTGAA-3’)按常規(guī)方法與上述芯片進(jìn)行雜交，探針與芯片的理論雜交結(jié)果如圖7所示，理論上只有52號樣品能夠和探針雜交，其他樣品都和探針存在至少一個堿基的差異。普通探針與芯片的實際雜交結(jié)果如圖8所示，堿基突變探針與芯片的實際雜交結(jié)果如圖9所示。雜交結(jié)果顯示，普通探針不能有效地將完全匹配序列和不匹配序列分開，而人工改造后的堿基突變探針可以非常好的把各種形式的不匹配序列和完全匹配序列區(qū)分開，從而達(dá)到HLA基因分型檢測的目的。
權(quán)利要求
1.一種序列特異性寡核苷酸探針，含有與靶基因互補的序列，其特征在于所述寡核苷酸探針上包括至少一個堿基突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的寡核苷酸探針，其特征在于所述寡核苷酸探針上包括一個堿基突變。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的寡核苷酸探針，其特征在于所述堿基突變的方式為堿基的替換、堿基的缺失或堿基的插入。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的寡核苷酸探針，其特征在于所述堿基突變的位置為所述寡核苷酸探針的近末端。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的寡核苷酸探針，其特征在于所述寡核苷酸探針的長度為11-70個堿基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的寡核苷酸探針，其特征在于所述寡核苷酸探針的長度為15-25個堿基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的寡核苷酸探針，其特征在于堿基突變的堿基是A、T、C、G、U五種堿基中的一種或幾種，或者次黃嘌呤、黃嘌呤、次黃苷。
8.權(quán)利要求1-7任一所述的寡核苷酸探針在基因分型檢測中應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述基因為HLA基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種序列特異的寡核苷酸探針及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的序列特異的寡核苷酸探針，含有與靶基因互補的序列，其中，所述寡核苷酸探針上包括至少一個堿基突變。本發(fā)明的發(fā)明人通過實驗證實，本發(fā)明的序列特異的寡核苷酸探針對單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測特異性大大提高，可以應(yīng)用于基因分型檢測中。本分明的序列特異的寡核苷酸探針，合成原料來源充分，價格低廉，合成工藝成熟，雜交特異性高，具有廣泛的應(yīng)用價值。
文檔編號C12Q1/68GK1840695SQ20061000286
公開日2006年10月4日 申請日期2006年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月8日
發(fā)明者高華方, 李澤, 王棟, 劉彥華, 劉湘, 江揚洲, 李麗, 趙傳贊, 蘭更欣, 過濤, 蔡斌, 程京 申請人:北京博奧生物芯片有限責(zé)任公司, 清華大學(xué)