專利名稱：多譜系祖細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來自于人血的多譜系祖細(xì)胞(MLPC)，更具體涉及具有分化成多種組織譜系潛能的MLPC及其在再生治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
已在多種來源中鑒定出能在清髓治療后進(jìn)行造血重建的祖細(xì)胞，其中包括骨髓、臍帶血和胎盤血、以及用干細(xì)胞動(dòng)員劑量的粒細(xì)胞集落刺激因子處理的受試者的外周血。這些細(xì)胞通常被稱為造血干細(xì)胞(HSC)，因其表面存在細(xì)胞表面糖蛋白如CD34和CD133而被鑒定。HSC作為“骨髓移植”的一部分只占總細(xì)胞群的很小比例，被認(rèn)為是這種治療的救命部分，負(fù)責(zé)恢復(fù)經(jīng)清髓劑量的化療或放療患者的血液形成能力。通過骨髓移植進(jìn)行干細(xì)胞治療已經(jīng)成為許多難治的白血病和遺傳性血液疾病的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。
最近的研究表明，在骨髓中存在一個(gè)較原始的細(xì)胞群，該群細(xì)胞能自我更新，并且能夠分化成多種不同類型的組織，而不僅僅是血液細(xì)胞。這些多潛能細(xì)胞是在成人骨髓的CD34塑料粘附細(xì)胞群中作為次要成分而被發(fā)現(xiàn)的，曾被賦予各種名稱，如間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)(Pittenger等，Science284143-147(1999))或多潛能成年祖細(xì)胞(MAPC)(Furcht，L.T.等，美國(guó)專利公開20040107453 A1)。MSC細(xì)胞沒有單一的特異性鑒別標(biāo)記，但是研究發(fā)現(xiàn)有許多標(biāo)記是陽(yáng)性的，其中包括CD29、CD90、CD105和CD73，而另外一些標(biāo)記是陰性的，其中包括CD14、CD3和CD4。不同的研究小組報(bào)道，MSC可分化成肌細(xì)胞、神經(jīng)元、胰腺β細(xì)胞、肝細(xì)胞、骨細(xì)胞和結(jié)締組織。另外一個(gè)研究小組(Wernet等，美國(guó)專利公開20020164794 A1)描述了一種具有多潛能的非限定性體細(xì)胞干細(xì)胞(USSC)，這種細(xì)胞來源于臍帶血內(nèi)的CD45-/CD34-細(xì)胞群。
發(fā)明概述本發(fā)明的基礎(chǔ)在于從人胎兒血中鑒定稀有的未分化細(xì)胞群，該細(xì)胞群可自我更新，具有分化成分別代表三個(gè)胚層的細(xì)胞的潛能。這些胎兒血來源的細(xì)胞被稱為多譜系祖細(xì)胞(MLPC)。如本文所描述，胎兒血MLPC與骨髓來源的MSC、HSC和USSC不同，其區(qū)別在于免疫表型特征、形態(tài)和不同的生長(zhǎng)模式。本發(fā)明提供了從單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)單型克隆細(xì)胞系的方法。本發(fā)明還提供了深低溫保存MLPC的方法(如，為了建立臍帶血庫(kù))以及利用MLPC進(jìn)行再生治療的方法。
在一個(gè)方面，本發(fā)明的特征是人胎兒血(如臍帶血)MLPC的純化群，其中的MLPC是CD9和CD45陽(yáng)性的。MLPC具有白細(xì)胞的形態(tài)。MLPC還可以是SSEA-4或CD34陽(yáng)性的，以及CD133、CD41、CD44、CD105、CD29、CD73、CD90、干細(xì)胞因子、SSEA-3和CD13陽(yáng)性的。MLPC可以是CD15、CD38、血型糖蛋白-A、CD2、CD3、CD8、CD19、CD20、CD22、CD5、CD7、CD10、CD14、CD4、HLA-DR、CD16、CD33和CD61陰性的。MLPC在培養(yǎng)一段時(shí)間后可獲得成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。MLPC在培養(yǎng)時(shí)還可以粘附到塑料表面。MLPC能夠分化成所有三個(gè)胚層來源的細(xì)胞，其中包括，例如，具有骨細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有脂肪細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有神經(jīng)干細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有肌細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有內(nèi)皮細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有肝細(xì)胞表型的細(xì)胞以及具有胰腺細(xì)胞表型的細(xì)胞。MLPC可包含外源核酸(如編碼多肽的外源核酸)。
在另一方面，本發(fā)明的特征是人胎兒血(如臍帶血)MLPC的純化群，其中的MLPC是CD9陽(yáng)性、CD45陰性、CD34陰性和SSEA-4陰性的。MLPC具有成纖維細(xì)胞的形態(tài)。MLPC還可以是CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105陽(yáng)性的，還可以是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD41、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋白-A、干細(xì)胞因子、SSEA-3和HLA-DR陰性的。MLPC在培養(yǎng)時(shí)可以粘附到塑料表面。MLPC能夠分化成所有三個(gè)胚層來源的細(xì)胞，其中包括，例如，具有骨細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有脂肪細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有神經(jīng)干細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有肌細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有內(nèi)皮細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有肝細(xì)胞表型的細(xì)胞以及具有胰腺細(xì)胞表型的細(xì)胞。MLPC可包含外源核酸(如編碼多肽的外源核酸)。
本發(fā)明的另一個(gè)特征是人胎兒血(如臍帶血)MLPC的克隆系，其中的MLPC是CD9陽(yáng)性、CD45陰性、CD34陰性和SSEA-4陰性的。MLPC具有成纖維細(xì)胞的形態(tài)。MLPC還可以是CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105陽(yáng)性的，還可以是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD41、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋白-A、干細(xì)胞因子、SSEA-3和HLA-DR陰性的。MLPC在培養(yǎng)時(shí)可以粘附到塑料表面。MLPC能夠分化成所有三個(gè)胚層來源的細(xì)胞，其中包括，例如，具有骨細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有脂肪細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有神經(jīng)干細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有肌細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有內(nèi)皮細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有肝細(xì)胞表型的細(xì)胞以及具有胰腺細(xì)胞表型的細(xì)胞。MLPC可包含外源核酸(如編碼多肽的外源核酸)。在某些實(shí)施方式中，MLPC在培養(yǎng)時(shí)至少可以經(jīng)歷5次倍增(如至少8、10、15或25次倍增)。
在另一方面，本發(fā)明的特征是包含MLPC純化群或MLPC克隆系以及培養(yǎng)基的組合物。該組合物還可以包含冷凍保存液。在一個(gè)實(shí)施方式中，冷凍保存液是二甲亞砜(DMSO)(如1％到10％的DMSO)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，冷凍保存液是胎牛血清、人血清或人血清白蛋白加上下列物質(zhì)中的一種或幾種DMSO、海藻糖和葡聚糖。例如，冷凍保存液可以是DMSO和海藻糖，或者是胎牛血清和DMSO。
在另一方面，本發(fā)明的特征是制品，其中包含MLPC純化群或MLPC的克隆系。MLPC的純化群或克隆系可儲(chǔ)存在容器內(nèi)(如玻璃瓶或袋子)。容器內(nèi)還可以包含冷凍保存液。
本發(fā)明的另一個(gè)特征是從人胎兒血內(nèi)純化MLPC細(xì)胞群的方法。該方法包括使人胎兒血樣品(如臍帶血)與含葡聚糖、抗血型糖蛋白-A抗體、抗CD15抗體和抗CD9抗體的組合物接觸；使樣品分成凝集物相和上清相；從上清相中收取細(xì)胞；以及通過粘附到固體基質(zhì)(如塑料基質(zhì))上從收獲的細(xì)胞中純化MPLC，其中的MPLC是CD9和CD45陽(yáng)性的。MLPC還可以是CD34、CD133、CD41、CD44、CD105、CD29、CD73、CD90、干細(xì)胞因子、SSEA-3、SSEA-4和CD13陽(yáng)性的。MLPC還可以是CD15、CD38、血型糖蛋白-A、CD2、CD3、CD8、CD19、CD20、CD22、CD5、CD7、CD10、CD14、CD4、HLA-DR、CD16、CD33和CD61陰性的。該方法還包括檢測(cè)MLPC是否存在CD9或者是否存在CD9、CD29、CD45、CD73和CD90。
該方法還包括培養(yǎng)MLPC使其獲得成纖維細(xì)胞形態(tài)，其中的MLPC在獲得成纖維細(xì)胞形態(tài)后是CD9陽(yáng)性、CD45陰性、CD34陰性和SSEA-4陰性的。MLPC在獲得成纖維細(xì)胞形態(tài)后還可以是CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105陽(yáng)性的。MLPC在獲得成纖維細(xì)胞形態(tài)后還可以是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD41、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋白-A、干細(xì)胞因子、SSEA-3和HLA-DR陰性的。該方法還包括檢測(cè)MLPC是否存在CD9或者是否存在CD9、CD29、CD45、CD73和CD90。
在另一方面，本發(fā)明的特征是冷凍保存MLPC的方法。該方法包括使MLPC的純化群或克隆系與冷凍保存液接觸；以及冷凍MLPC的純化群或克隆系。在一個(gè)實(shí)施方式中，冷凍保存液是DMSO(如1％到10％的DMSO)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，冷凍保存液是胎牛血清、人血清或人血清白蛋白加上下列物質(zhì)中的一種或幾種DMSO、海藻糖和葡聚糖。例如，冷凍保存液可以是DMSO和海藻糖，或者是胎牛血清和DMSO。MLPC的純化群或克隆系以1×105和5×107細(xì)胞/毫升的濃度懸浮在冷凍保存液中。純化群或克隆系可以可控速度冷凍(如冷凍速度是電控制的)，或者通過將細(xì)胞放置在液氮儲(chǔ)存罐的蒸汽層進(jìn)行乙醇浴來冷凍。
在另一方面，本發(fā)明的特征是制備分化細(xì)胞群的方法。該方法包括用能夠有效誘導(dǎo)MLPC分化的試劑培養(yǎng)MLPC的純化群或克隆系。所述試劑包括胰島素、谷氨酰胺、地塞米松、吲哚美辛和3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤；地塞米松、谷氨酰胺、抗壞血酸和β-磷酸甘油；上皮生長(zhǎng)因子、胰島素、胎球蛋白、地塞米松和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、NSF-1和視黃酸；肝素、牛腦提取物、上皮生長(zhǎng)因子和氫化可的松；或者抗壞血酸、氫化可的松、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、表皮生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-4和干細(xì)胞因子。
除非特別說明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所常理解的意思相同。雖然與本文所描述的那些方法和材料相似或等價(jià)的方法和材料也可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，但是下面所描述的都是合適的方法和材料。本文所提到的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其他參考文獻(xiàn)都已完整納入本文作為參考。在發(fā)生矛盾時(shí)以本說明書包括定義為準(zhǔn)。另外，材料、方法和實(shí)施例只是為了說明，并不意味著限制。
本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)通過閱讀下面的詳細(xì)描述和權(quán)利要求就會(huì)清楚。


圖1是從胎兒血中純化MLPC的細(xì)胞分離過程示意圖。
圖2A-2D是描述正在發(fā)育的MLPC形態(tài)的顯微照片。圖2A顯示的是從臍帶血分離的MLPC的早期培養(yǎng)情況，說明細(xì)胞處于白細(xì)胞形態(tài)期。圖2B顯示的是MLPC培養(yǎng)物開始從白細(xì)胞形態(tài)向成纖維細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變。圖2C顯示的是處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MLPC晚期培養(yǎng)物。圖2D顯示的是MLPC生長(zhǎng)完全匯合的培養(yǎng)物。
詳細(xì)描述總的來說，本發(fā)明提供了人胎兒血(如臍帶血(“臍血”)、胎盤血或胎兒血)來源的MLPC純化群以及MLPC來源的MLPC克隆系。胎兒血提供了比成人骨髓更幼稚的細(xì)胞來源，所含有的攜帶不成熟細(xì)胞表面標(biāo)記的細(xì)胞百分比更高。因此，胎兒血來源的祖細(xì)胞可能具有更高的擴(kuò)增和分化能力。如本文所描述，MLPC具有與骨髓來源的MSC、骨髓來源的HSC以及臍帶血來源的HSC和USSC不同的免疫表型特征。本文所描述的細(xì)胞具有自我更新的能力以及分化成不同類型組織的能力，這與骨髓來源的MSC和MAPC細(xì)胞相似。MLPC可用于開展細(xì)胞治療和建立冷凍細(xì)胞庫(kù)以便于以后進(jìn)行再生治療。MLPC還可以被改造使其能表達(dá)一種或多種我們感興趣的多肽或其他治療性化合物。
細(xì)胞分離組合物MLPC可利用美國(guó)專利公開No.2003-0027233-A1所描述的負(fù)篩選過程和細(xì)胞分離組合物從胎兒血(如臍帶血)中分離。這種組合物包含葡聚糖和一種或多種抗細(xì)胞表面抗原的抗體(即與抗原具有結(jié)合親和力的抗體)。
葡聚糖是由葡萄糖單位組成的多糖，各單位之間主要以α(1到6)鍵相連。葡聚糖可導(dǎo)致紅細(xì)胞堆積(即形成紅細(xì)胞錢串)，因而便于從溶液中去除紅細(xì)胞。抗細(xì)胞表面抗原的抗體有利于通過同型凝集(即相同類型的細(xì)胞凝集在一起)和/或異型凝集(即不同類型的細(xì)胞凝集在一起)從溶液中去除血細(xì)胞。
例如，細(xì)胞分離組合物可包含葡聚糖和抗血型糖蛋白-A、CD15以及CD9的抗體。細(xì)胞分離組合物還可以包含抗其他血細(xì)胞表面抗原的抗體，其中包括CD2、CD3、CD4、CD8、CD72、CD16、CD41a、HLA I類分子、HLA-DR、CD29、CD11a、CD11b、CD11c、CD19、CD20、CD23、CD39、CD40、CD43、CD44、CDw49d、CD53、CD54、CD62L、CD63、CD66、CD67、CD81、CD82、CD99、CD100、Leu-13、TPA-1、表面Ig及其組合。因此，細(xì)胞分離組合物可制備成能選擇性凝集特定類型血細(xì)胞的組合物。
一般來說，細(xì)胞分離組合物中抗血型糖蛋白-A抗體的濃度為0.1到15mg/L(如0.1～10mg/L，1～5mg/L或1mg/L)?？寡吞堑鞍?A抗體至少可通過兩種機(jī)制來促進(jìn)從溶液中去除紅細(xì)胞。第一，抗血型糖蛋白抗體可引起紅細(xì)胞發(fā)生同型凝集，因?yàn)檠吞堑鞍?A是紅細(xì)胞的主要表面糖蛋白。另外，抗血型糖蛋白-A抗體可穩(wěn)定葡聚糖介導(dǎo)形成的紅細(xì)胞錢串。典型的抗血型糖蛋白-A單克隆抗體包括而不限于107FMN(鼠IgG1同種型)、YTH89.1(兔IgG2b同種型)、2.2.2.E7(鼠IgM同種型；BioE，St.Paul，MN)以及E4(鼠IgM同種型)。參見Vanderlaan等，Molecular Immunology201353(1983)；Telen M.J.和Bolk，T.A.，Transfusion27309(1987)；以及Outram S.等，Leukocyte Research.12651(1988)。
細(xì)胞分離組合物中抗CD15抗體的濃度為0.1到15mg/L(如0.1～10mg/L，1～5mg/L或1mg/L)?？笴D15抗體可通過交聯(lián)粒細(xì)胞表面存在的CD15分子而導(dǎo)致粒細(xì)胞發(fā)生同型凝集。抗CD1抗體還可以導(dǎo)致粒細(xì)胞與單核細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞發(fā)生同型或異型凝集，其機(jī)制為刺激粒細(xì)胞表面表達(dá)能與單核細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞的粘附分子發(fā)生相互作用的粘附分子(如L-選擇素和β-2整合素)。這些細(xì)胞發(fā)生的異型凝集可促使這些細(xì)胞和紅細(xì)胞組分一起從溶液中去除。典型的抗CD1單克隆抗體包括而不限于AHN1.1(鼠IgM同種型)、FMC-10(鼠IgM同種型)、BU-28(鼠IgM同種型)、MEM-157(鼠IgM同種型)、MEM-158(鼠IgM同種型)、324.3.B9(鼠IgM同種型；BioE，St.Paul，MN)以及MEM-167(鼠IgM同種型)。參見Leukocyte typingIV(1989)；Leukocyte typing II(1984)；Leukocyte typing VI(1995)；Solter D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA755565(1978)；Kannagi R.等，J.Biol.Chem.25714865(1982)；Magnani，J.L.等，Arch.Biochem.Biophys233501(1984)；Eggens I.等，J.Biol.Chem.2649476(1989)。
細(xì)胞分離組合物中抗CD9抗體的濃度為0.1到15mg/L、0.1到10mg/L、1到5mg/L或1mg/L?？笴D9抗體可促使血小板發(fā)生同型凝集。抗CD9抗體還可以通過粘附到粒細(xì)胞和單核細(xì)胞表面的血小板引起粒細(xì)胞和單核細(xì)胞發(fā)生異型凝集。CD9抗體可加速血小板p-選擇素(CD62P)、CD41/61、CD31和CD36的表達(dá)。這些分子可促使血小板結(jié)合到白細(xì)胞表面。因此，抗CD9抗體可加速多種細(xì)胞-細(xì)胞結(jié)合，從而有利于這些細(xì)胞的凝集并從溶液中去除。典型的抗CD9單克隆抗體包括而不限于MEM-61(鼠IgG1同種型)、MEM-62(鼠IgG1同種型)、MEM-192(鼠IgM同種型)、FMC-8(鼠IgG2a同種型)、SN4(鼠IgG1同種型)、8.10.E7(鼠IgM同種型；BioE，St.Paul，MN)以及BU-16(鼠IgG2a同種型)。參見Leukocyte typing VI(1995)；Leukocytetyping II(1984)；Von dem Bourne A.E.G.Kr.和Moderman P.N.(1989)，引自Leukocytetyping IV(W.Knapp等編)，pp.989-92，Oxford University Press，Oxford；Jennings，L.K.等，引自Leukocyte typing V，S.F.Schlossmann等編，pp.1249-51，OxfordUniversity Press，Oxford(1995)；Lanza F.等，J.Biol.Chem.26610638(1991)；Wright等，Immunology Today15588(1994)；Rubinstein E.等，Seminars in Thrombosis andHemostasis2110(1995)。
在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞分離組合物含有抗CD41抗體，該抗體可選擇性凝集血小板。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞分離組合物含有抗CD3抗體，該抗體可選擇性凝集T細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞分離組合物含有抗CD2抗體，該抗體可選擇性凝集T細(xì)胞和NK細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞分離組合物含有抗CD72抗體，該抗體可選擇性凝集B細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞分離組合物含有抗CD16抗體，該抗體可選擇性凝集NK細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。其中每種抗體的濃度為0.01到15mg/L。典型的抗CD41抗體包括而不限于PLT-1(鼠IgM同種型)、CN19(鼠IgG1同種型)和8.7.C3(鼠IgG1同種型)。抗CD3抗體的非限定性例子包括OKT3(鼠IgG1)、HIT3a(鼠IgG2a同種型)、SK7(鼠IgG1)和BC3(鼠IgG2a)。抗CD2抗體的非限定性例子包括7A9(鼠IgM同種型)、T11(鼠IgG1同種型)以及Leu5b(鼠IgG2a同種型)?？笴D72抗體的非限定性例子包括BU-40(鼠IgG1同種型)和BU-41(鼠IgG1同種型)。抗CD16抗體的非限定性例子包括3G8(鼠IgG)。
如上所述，細(xì)胞分離組合物可被制備成能夠選擇性凝集特定血細(xì)胞的制劑。細(xì)胞分離組合物的一個(gè)例子包含抗血型糖蛋白-A、CD15和CD9抗體，該組合物可加速紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞和血小板的凝集。然后從溶液中回收T細(xì)胞、NK細(xì)胞和稀有的前體細(xì)胞如MPLC。如果制劑中還包含抗CD3的抗體，那么T細(xì)胞也可以被凝集，因而可以從溶液中回收NK細(xì)胞和稀有前體細(xì)胞如MLPC。
細(xì)胞分離組合物可以包含抗其他類型細(xì)胞表面抗原的抗體(如腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞表面蛋白)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可利用常規(guī)方法制備抗細(xì)胞表面抗原的抗體，這些抗原來源于人和其他哺乳動(dòng)物如非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物(如小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、兔和荷蘭豬)、豬、牛和馬的血細(xì)胞和其他細(xì)胞。
一般來說，組合物中所用的抗體為單克隆抗體，單克隆抗體是針對(duì)抗原內(nèi)特定表位的同源抗體群。適宜的單克隆抗體可從公司購(gòu)買，或者利用標(biāo)準(zhǔn)的雜交瘤技術(shù)制備。更具體地說，單克隆抗體可利用通過培養(yǎng)傳代細(xì)胞系制備抗體分子的技術(shù)制備，其中包括Kohler，G.等，Nature，1975，256495所描述的技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等，Immunology Today472(1983)；Cole等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA802026(1983))，以及EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等，“Monoclonal Antibodies and CancerTherapy”(單克隆抗體和腫瘤治療)，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96(1983))。
抗體可以是任何類的免疫球蛋白，其中包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其亞類。IgG和IgM的同種型抗體在本發(fā)明的細(xì)胞分離組合物中是特別有用的。五聚體IgM抗體比IgG抗體含有更多的抗原結(jié)合位點(diǎn)，在某些情況下(如抗血型糖蛋白-A和CD15抗體)特別適于作為細(xì)胞分離試劑。在另外一些情況下(如抗CD9抗體)，IgG同種型抗體特別適于刺激同型和/或異型凝集。
抗細(xì)胞表面抗原的抗體可以存在于液相中(如可溶性的)。液相抗體在細(xì)胞分離組合物中存在的濃度一般在約0.1到約15mg/l之間(如，0.25-10、0.25-1、0.5-2、1-2、4-8、5-10mg/l之間)。
抗細(xì)胞表面抗原的抗體還可以連接到固相(即底物結(jié)合)上。抗不同細(xì)胞表面抗原的抗體可以共價(jià)連接到固相支持物上以促進(jìn)細(xì)胞表面分子的交聯(lián)以及細(xì)胞表面粘附分子的活化。使用底物結(jié)合的抗體可加速細(xì)胞的分離(如，利用粒子有利于凝集細(xì)胞的特性，或者利用有益于純化的特性)。
在某些實(shí)施方式中，結(jié)合有底物結(jié)合抗體的固相支持物是粒子。在某些實(shí)施方式中，抗體被結(jié)合到乳膠微粒(如，通過生物素-親和素連接子共價(jià)連接到聚苯乙烯小珠的COO基團(tuán)上，或者共價(jià)連接到修飾小珠的NH2基團(tuán)上)。在某些實(shí)施方式中，抗體被連接到酸腐蝕的玻璃粒子上(如，通過生物素-親和素連接子)。在某些實(shí)施方式中，抗體被連接到凝集多肽如凝集的牛血清白蛋白上(如通過生物素-親和素連接子，或者共價(jià)連接到多肽的COO基團(tuán)或NH2基團(tuán)上)。在某些實(shí)施方式中，抗體被共價(jià)連接到多糖如高分子量(如＞1,000,000Mr)的硫酸葡聚糖上。在某些實(shí)施方式中，生物素化的抗體被連接親和素粒子上，形成四聚體復(fù)合物，每個(gè)親和素分子結(jié)合四個(gè)抗體分子。在某些實(shí)施方式中，抗體通過生物素-親和素-生物素化的抗體連接子被結(jié)合到生物素化的瓊脂糖凝膠顆粒上(One Cell Systems(單細(xì)胞系統(tǒng))，Cambridge，MA，U.S.A.)。這種粒子的直徑一般約為300-500微米，可在超聲水浴或快速混合水浴中制備。
細(xì)胞-底物粒子(即，包含細(xì)胞和底物結(jié)合抗體的粒子)可作為凝集物從溶液中沉淀出來。當(dāng)粒子是順磁磁珠時(shí)，還可以通過應(yīng)用磁場(chǎng)從溶液中去除細(xì)胞-底物粒子。底物結(jié)合抗體在細(xì)胞分離組合物中的濃度通常為約0.1到約50.0×109個(gè)粒子/升(如，0.25～10.0×109、1～20.0×109、2～10.0×109、0.5～2×109、2～5×109、5～10×109以及10～30×109個(gè)粒子/升)，其中的粒子是指結(jié)合有抗體的固相粒子。
細(xì)胞分離組合物還可以含有二價(jià)陽(yáng)離子(如Ca+2和Mg+2)。二價(jià)陽(yáng)離子可通過平衡鹽溶液(如Hank’s平衡鹽溶液)的方式提供。據(jù)報(bào)道，Ca+2離子對(duì)于選擇素介導(dǎo)的和整合素介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞粘附來說是重要的。
細(xì)胞分離組合物還可以包含抗凝血?jiǎng)┤绺嗡?。肝素可防止凝固以及在高鈣環(huán)境下由凝固導(dǎo)致的非特異性細(xì)胞丟失。肝素還可以促使血小板凝集。凝集的血小板可粘附到粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上，因而比單個(gè)的血小板更容易促使異型凝集。肝素可以肝素鹽(如肝素鈉、肝素鋰或肝素鉀)的形式提供。
MLPC群和克隆系MLPC可用上述細(xì)胞分離組合物從人胎兒血中純化。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“純化的”是指細(xì)胞群內(nèi)至少有90％(如91、92、93、94、95、96、97、98或99％)的細(xì)胞是MLPC。本文所用的術(shù)語(yǔ)“MLPC”是指CD9陽(yáng)性的、以及常常顯示其他標(biāo)記如CD13、CD73和CD105群體(constellation)的胎兒血細(xì)胞?！癕LPC群”是指從人胎兒血中獲得的原始培養(yǎng)物及其未克隆的后代?！翱寺∠怠笔侵竼蝹€(gè)細(xì)胞來源的細(xì)胞系。本文所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞系”是指在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下、在適當(dāng)?shù)囊欢螘r(shí)間內(nèi)能自我更新的一群細(xì)胞。但是，術(shù)語(yǔ)“系”并不代表那些進(jìn)行不確定繁殖的細(xì)胞。本文所描述的克隆系在衰老前一般都能經(jīng)歷75到100次倍增。
一般來說，MLPC群可通過使胎兒血樣本與上述細(xì)胞分離組合物接觸并使樣本分成凝集相和上清相來獲得。例如，通過重力作用或通過離心使樣本沉降。優(yōu)選的MLPC純化自小于48小時(shí)的臍帶血樣本(如，產(chǎn)后24、12、8或4小時(shí)之內(nèi))凝集以后，從上清相中回收未凝集的細(xì)胞。例如，通過如下過程回收上清相中的細(xì)胞離心，用鹽溶液洗滌并接種到固相底物上(如，塑料培養(yǎng)裝置如帶槽的玻片或培養(yǎng)板)，使用含10％血清的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(如含10％血清的DMEM；含10％血清的RPMI-1640；或者含10％血清的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號(hào)為#PT-3001，Cambrex，Walkersville，MD))培養(yǎng)。MLPC可粘附到固相底物表面，而其他細(xì)胞如T細(xì)胞、NK細(xì)胞和CD34+HSC卻不能粘附，因而通過洗滌可以去除。在開始培養(yǎng)后3天到2周內(nèi)MLPC從白細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞形態(tài)，然后細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，只要培養(yǎng)物內(nèi)的細(xì)胞濃度維持在約1.5×105細(xì)胞/cm2以下，細(xì)胞就可以繼續(xù)維持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)。
克隆系的建立可通過如下過程完成收獲MLPC，然后稀釋并重新接種到多孔培養(yǎng)板上，這樣就可以在孔內(nèi)找到單個(gè)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到1到5×105細(xì)胞/75cm2時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到較大的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。細(xì)胞濃度維持在1×105到5×105細(xì)胞/75cm2之間以使其維持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)。
可利用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)來分析MLPC的存活力、增殖能力和壽命。例如，存活力可通過臺(tái)盼藍(lán)排出試驗(yàn)、醋酸熒光素?cái)z取試驗(yàn)或碘化丙啶攝取試驗(yàn)來測(cè)定。增殖能力可通過胸苷攝取試驗(yàn)或MTT細(xì)胞增殖試驗(yàn)來測(cè)定。壽命可通過確定培養(yǎng)物細(xì)胞群倍增的最大數(shù)目來分析。
利用已知的技術(shù)可確定MLPC的免疫表型。例如，從組織培養(yǎng)裝置中去掉細(xì)胞培養(yǎng)基，然后用平衡鹽溶液(如Hank’s平衡鹽溶液)和牛血清白蛋白(如2％ BSA)洗滌粘附的細(xì)胞。細(xì)胞與抗體共孵育，這些抗體與細(xì)胞表面抗原如CD9、CD45、CD13、CD73、CD105或其他任何細(xì)胞表面抗原有結(jié)合親和力。抗體可連接上可檢測(cè)標(biāo)記(如熒光標(biāo)記或酶催化標(biāo)記)或者利用帶有可檢測(cè)標(biāo)記的二抗來檢測(cè)。另外，MLPC上的細(xì)胞表面抗原可利用流式細(xì)胞儀和熒光標(biāo)記抗體來檢測(cè)。
如本文所描述，MLPC上存在的細(xì)胞表面抗原是可以改變的，這些抗原因培養(yǎng)階段的不同而不同。在培養(yǎng)早期MLPC展示白細(xì)胞樣形態(tài)時(shí)，MLPC是CD9和CD45、SSEA-4(階段特異性胚胎抗原-4)、CD34以及CD13、CD29、CD41、CD44、CD73、CD90、CD105、干細(xì)胞因子、STRO-1(骨髓體細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞表面抗原)、SSEA-3(半乳糖苷葡糖)和CD133陽(yáng)性的，并且是CD15、CD38、血型糖蛋白-A(CD235a)和系標(biāo)記CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD33、CD36、CD41、CD61、CD62E、CD72、HLA-DR以及CD102陰性的。當(dāng)轉(zhuǎn)變成成纖維細(xì)胞形態(tài)后，MLPC依然是CD9、CD13、CD29、CD73、CD90和CD105陽(yáng)性的，但是卻變成CD34、CD41、CD45、干細(xì)胞因子、STRO-1、SSEA-3、SSEA-4和CD133陰性的。在體外培養(yǎng)的整個(gè)過程中，未分化的MLPC是CD15、CD38、血型糖蛋白-A(CD235a)、系標(biāo)記CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD33、CD36、CD41、CD61、CD62E、CD72、HLA-DR和CD102陰性的。
骨髓來源的MSC和MAPC以及臍帶血來源的USSC被認(rèn)為是來源于CD45-/CD34-細(xì)胞群。MLPC與這些類型的細(xì)胞的區(qū)別在于MLPC是CD45+/CD34+來源的細(xì)胞。另外，在整個(gè)成熟過程中胎兒血來源的MLPC是否存在CD9以及存在的持續(xù)時(shí)間也可以將MLPC與MSC和MAPC區(qū)分開，后者沒有CD9標(biāo)記。MLPC在其白細(xì)胞形態(tài)相中擁有造血標(biāo)記CD45、CD133、CD90和CD34，與HSC的區(qū)別在于HSC具有強(qiáng)制性的塑料粘附特性以及存在間充質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記CD105、CD29、CD73、CD13和胚胎相關(guān)標(biāo)記SSEA-3和SSEA-4。另外，利用現(xiàn)有的技術(shù)無法在體外培養(yǎng)HSC而不使其進(jìn)一步分化，而MLPC保持不分化狀態(tài)可擴(kuò)增許多代。MLPC與MSC和USSC的區(qū)別還在于MSC和USSC在體外培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)較差，具有絲狀胞漿突起以及達(dá)到最佳生長(zhǎng)偏愛低密度培養(yǎng)條件。
可通過將細(xì)胞(5×106到2×107細(xì)胞/毫升)懸浮于冷凍保存液中冷凍保存MLPC，所述冷凍保存液如二甲亞砜(DMSO，一般為1-10％)，或者胎牛血清、人血清或人血清白蛋白加上DMSO、海藻糖和葡聚糖中的一種或幾種。例如，(1)含10％ DMSO的胎牛血清；(2)含10％ DMSO和1％葡聚糖的人血清；(3)含1％ DMSO和5％海藻糖的人血清；或者(4)20％人血清白蛋白、1％ DMSO和5％海藻糖，這些都可用于冷凍保存MLPC。加入冷凍保存液后將細(xì)胞冷凍起來(如到-90℃)。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞以可控速度冷凍(如冷凍速度是電控制的)，或者通過將細(xì)胞放置在70％乙醇浴和液氮儲(chǔ)存罐的蒸汽層進(jìn)行冷凍。當(dāng)細(xì)胞冷凍到-90℃時(shí)放置到液氮儲(chǔ)存罐的液體相中以便于長(zhǎng)期儲(chǔ)存。冷凍保存液可用于長(zhǎng)期儲(chǔ)存這些細(xì)胞作為治療的應(yīng)用。
MLPC的分化MLPC能夠分化成各種細(xì)胞，包括三個(gè)胚層(即內(nèi)胚層、外胚層和中胚層)的細(xì)胞。本文所用的術(shù)語(yǔ)“能夠分化成”是指一個(gè)給定的細(xì)胞或其后代能夠在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下呈現(xiàn)分化表型。例如，MLPC可分化成具有骨細(xì)胞表型的細(xì)胞、脂肪細(xì)胞表型的細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞表型的細(xì)胞、肌細(xì)胞表型的細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞表型的細(xì)胞、肝細(xì)胞/胰腺細(xì)胞前體細(xì)胞表型的細(xì)胞(也被稱為橢圓形細(xì)胞)以及其他類型的細(xì)胞。利用一種或幾種分化試劑可誘導(dǎo)分化，其中包括而不限于Ca2+、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF)、角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)、細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素、干擾素或腫瘤壞死因子、視黃酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、激素(如雄激素、雌激素、胰島素、催乳素、三碘甲狀腺氨酸、氫化可的松或地塞米松)、丁酸鈉、TPA、DMSO、NMF(N-甲基甲酰胺)、DMF(二甲基甲酰胺)或基質(zhì)如膠原、層粘連蛋白、硫酸乙酰肝素。
確定MLPC是否已經(jīng)分化成特定類型的細(xì)胞可以利用已知的方法來分析，其中包括檢測(cè)形態(tài)學(xué)和細(xì)胞表面標(biāo)記的改變(如，通過流式細(xì)胞術(shù)或免疫組化方法)、通過光學(xué)顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)、或者利用一些方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或基因表達(dá)譜分析來檢測(cè)基因表達(dá)的變化。
例如，利用含地塞米松、L-谷氨酰胺、抗壞血酸和β-磷酸甘油的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(如成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基，產(chǎn)品編號(hào)為#PT-3002，Cambrex)誘導(dǎo)MLPC使其分化成具有骨細(xì)胞表型的細(xì)胞(Jaiswal等，J.Biol.Chem.64(2)295-312(1997))。具有骨細(xì)胞表型的細(xì)胞含有鈣結(jié)晶沉淀，通過茜素紅染色可以看到。
利用含胰島素、L-谷氨酰胺、地塞米松、吲哚美辛和3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(如脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基，產(chǎn)品編號(hào)為#PT-3004，Cambrex)誘導(dǎo)MLPC使其分化成具有脂肪細(xì)胞表型的細(xì)胞。具有脂肪細(xì)胞表型的細(xì)胞包含充滿脂質(zhì)的脂質(zhì)體，通過油紅染色可以看到。這種細(xì)胞還含有甘油三酯(trigyceride)，用尼羅紅染色后可發(fā)綠色熒光(Fowler和Greenspan，Histochem.Cytochem.33833-836(1985))。
利用含EGF、胰島素、胎球蛋白、地塞米松和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)MLPC可使其分化成具有肌細(xì)胞表型的細(xì)胞(如SkGMTM，產(chǎn)品編號(hào)為CC-3160，Cambrex)。具有肌細(xì)胞表型的細(xì)胞表達(dá)快肌肌球蛋白和α肌動(dòng)蛋白。
利用含人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、NSF-1和FGF-4的培養(yǎng)基(如，NPMMTM-神經(jīng)祖細(xì)胞維持培養(yǎng)基，產(chǎn)品編號(hào)為#CC-3209，Cambrex)在預(yù)先涂布多聚D賴氨酸和層粘連蛋白(BD Biosciences Discovery Labware，產(chǎn)品編號(hào)為#354688)培養(yǎng)裝置內(nèi)誘導(dǎo)MLPC可使其分化成具有神經(jīng)干細(xì)胞表型的細(xì)胞(神經(jīng)球)。細(xì)胞一旦分化成神經(jīng)球，通過加入腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(NT-3)它們還可以進(jìn)一步分化成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，通過加入白血病抑制因子(LIF)、視黃酸和睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可以進(jìn)一步分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞，通過加入3，3’，5-三碘-L-甲狀腺原氨酸(T3)可以進(jìn)一步分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞。通過檢測(cè)是否表達(dá)干蛋白、III類β微管蛋白(微管蛋白β-4)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP)和半乳糖腦苷脂(GalC)可以確定細(xì)胞是否已經(jīng)向神經(jīng)細(xì)胞分化。對(duì)于神經(jīng)球來說，所有這些標(biāo)記都是陽(yáng)性的，而某些類型的分化細(xì)胞不表達(dá)這些標(biāo)記。髓磷脂堿蛋白(MBP)染色陽(yáng)性說明已分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞。
利用含肝素、牛腦提取物、上皮生長(zhǎng)因子(如人重組上皮生長(zhǎng)因子)和氫化可的松的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(如EGM3-MV，產(chǎn)品編號(hào)為#CC-3125，Cambrex)誘導(dǎo)MLPC可使其分化成具有內(nèi)皮細(xì)胞表型的細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞的分化可通過E-選擇素(CD62E)和ICAM-2(CD102)的表達(dá)來確定。
利用含抗壞血酸、氫化可的松、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、EGF、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、FGF-4和干細(xì)胞因子的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(如HCMTM-肝細(xì)胞培養(yǎng)基，產(chǎn)品編號(hào)為#CC-3198，Cambrex)誘導(dǎo)MLPC可使其分化成具有肝細(xì)胞/胰腺細(xì)胞前體細(xì)胞表型的細(xì)胞。肝細(xì)胞和胰腺細(xì)胞具有共同的祖細(xì)胞。肝細(xì)胞的分化可通過肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和人血清白蛋白的表達(dá)來確定。胰腺細(xì)胞的分化可通過胰島素和胰島素原的表達(dá)來確定。
MLPC的修飾群MLPC可以被修飾以使其產(chǎn)生一種或多種目的多肽或其他治療性化合物。為了修飾分離的細(xì)胞以使其產(chǎn)生目的多肽或其他治療性化合物，必須向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入合適的外源核酸。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞被瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，這說明外源核酸是游離的(即，不整合到染色體DNA上)。在另外一些實(shí)施方式中，細(xì)胞被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，即，外源核酸被整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上。本文所用的術(shù)語(yǔ)“外源的”指核酸和特定細(xì)胞時(shí)是指非來源于其天然宿主細(xì)胞的任何核酸。另外，術(shù)語(yǔ)“核酸”也包括天然核酸。例如，編碼分離自人細(xì)胞的多肽的核酸一旦被導(dǎo)入到第二種人源細(xì)胞中，鈣核酸對(duì)于第二種人源細(xì)胞來說就是外源的。外源核酸一般作為載體的一部分被轉(zhuǎn)移，載體內(nèi)的調(diào)節(jié)元件如啟動(dòng)子可操控地連接到目的核酸上。
利用病毒載體如腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、痘苗病毒、麻疹病毒、皰疹病毒或牛乳頭狀瘤病毒載體可改造細(xì)胞。參見Kay等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9412744-12746中有關(guān)病毒載體和非病毒載體的綜述。載體可以通過機(jī)械方式導(dǎo)入，如脂質(zhì)體或化學(xué)介導(dǎo)的DNA攝取。例如，通過本領(lǐng)域熟知的方法將載體導(dǎo)入到MLPC內(nèi)，其中包括轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、電穿孔、顯微注射、細(xì)胞融合、DEAE葡聚糖、鈣磷酸鹽沉淀、脂質(zhì)體、LIPOFECTINTM、溶酶體融合、合成的陽(yáng)離子脂質(zhì)、利用基因槍或DNA載體轉(zhuǎn)運(yùn)子。
載體包含編碼篩選標(biāo)記的核酸。篩選標(biāo)記的非限定性例子包括嘌羅霉素、腺苷脫氨酶(ADA)、氨基葡萄糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo、G418、APH)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸轉(zhuǎn)移酶、胸苷激酶(TK)和黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(XGPRT)。這些標(biāo)記可用于篩選培養(yǎng)物中穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。
MLPC還可以進(jìn)行靶向基因修飾。導(dǎo)入靶向基因修飾的同源重組方法是本領(lǐng)域熟知的。為了獲得同源重組MLPC，需要構(gòu)建同源重組載體，其中目的基因的5’和3’端側(cè)翼序列分別為靶向細(xì)胞基因組內(nèi)源性的基因序列，這樣載體攜帶的目的基因就可以和靶細(xì)胞基因組的內(nèi)源性基因發(fā)生同源重組。兩側(cè)所加的核酸序列要足夠長(zhǎng)，以便于目的基因與靶細(xì)胞基因組的內(nèi)源性基因發(fā)生同源重組。一般來說，載體內(nèi)所包含的側(cè)翼序列有幾個(gè)kb(5’端和3’端)。構(gòu)建同源重組載體的方法以及制備同源重組動(dòng)物的方法是本領(lǐng)域熟知的(參見Thomas和Capecchi，1987，Cell51503；Bradley，1991，Curr.Opin.Bio/Technol.2823-29；以及PCT公開Nos.WO 90/11354、WO91/01140和WO 93/04169)。
使用MLPC的方法MLPC可用于酶替代療法以治療特殊的疾病，其中包括而不限于溶酶體貯積病，如Tay-Sachs綜合征、Niemann-Pick綜合征、Fabry綜合征、Gaucher綜合征、Hunter綜合征和Hurler綜合征，以及其他神經(jīng)節(jié)苷脂貯積病、粘多糖增多癥和糖原貯積病。
在其他實(shí)施方式中，細(xì)胞可作為基因治療的載體來矯正遺傳性代謝缺陷、腦白質(zhì)腎上腺萎縮癥、囊性纖維化、糖原貯積病、甲狀腺功能低下、鐮狀細(xì)胞性貧血、Pearson綜合征、Pompe病、苯酮尿癥(PKIJ)、卟啉病、楓糖尿病、高胱氨酸尿癥、粘多糖貯積癥(mucoplysaccharide nosis)、慢性肉芽腫性疾病和酪氨酸血癥以及Tay-Sachs病，或者治療癌癥、腫瘤或其他病理狀態(tài)。
MLPC可用于修復(fù)因疾病而導(dǎo)致的組織和器官損傷。在這種實(shí)施方式中，給予患者M(jìn)LPC群使因疾病受損的組織或器官再生或修復(fù)。例如，給予患者M(jìn)LPC群以增強(qiáng)患者化療或放療后的免疫系統(tǒng)功能，或者修復(fù)心肌梗死后的心臟組織。
細(xì)胞還可用于組織再生治療或替代治療，其中包括而不限于角膜上皮缺損的治療、軟骨修復(fù)、面部斑痕修復(fù)、粘膜膜、腸墊片、神經(jīng)結(jié)構(gòu)(如視網(wǎng)膜、基底膜上的聽覺神經(jīng)元、嗅上皮上的嗅覺神經(jīng)元)、皮膚燒傷創(chuàng)傷修復(fù)、或者重建其他損傷或患病的器官或組織。
MLPC還可用于治療性移植手術(shù)中以增加或替換肝、胰腺、腎、肺、神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉、骨、骨髓、胸腺、脾、粘膜組織或頭發(fā)的干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
組合物和制品本發(fā)明的特征還有含MLPC純化群或MLPC克隆系的組合物和制品。在某些實(shí)施方式中，MLPC的純化群或克隆系被置于容器內(nèi)(如玻璃瓶或袋子)。在某些實(shí)施方式中，克隆系至少在培養(yǎng)物中經(jīng)歷了3次倍增(如，至少4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50次倍增)。在其他實(shí)施方式中，組合物或制品中也包含培養(yǎng)基(如，MSCGMTM培養(yǎng)基)。在其他實(shí)施方式中，組合物或制品還包含一種或多種冷凍保存液或藥用載體。例如，組合物可包含血清和DMSO，血清、DMSO和海藻糖的混合物，或者人血清、DMSO和海藻糖的混合物。
MLPC的純化群或克隆系可用包裝材料包裝，以試劑盒的形式出售。試劑盒的包裝材料通常包含描述MLPC純化群或克隆系如何培養(yǎng)、分化或使用的說明書或標(biāo)記。生產(chǎn)這種試劑盒的組分和方法也是大家所熟知的。
本發(fā)明還在下列實(shí)施例中做了進(jìn)一步的描述，這些實(shí)施例并不是要限定權(quán)利要求所描述的本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1分離血細(xì)胞本實(shí)施例描述了利用下文所述的細(xì)胞分離試劑分離細(xì)胞的通用方法。等體積的細(xì)胞分離試劑(見表1)和枸櫞酸葡萄糖(ACD)、CPDA(枸櫞酸鹽、磷酸鹽、葡萄糖、腺嘌呤)或肝素化的臍帶血樣品在封閉的無菌容器(如，50ml圓錐形試管)內(nèi)混合(每種25ml)。含20×106細(xì)胞/毫升以上白細(xì)胞的一份血液樣品與兩份細(xì)胞分離試劑混合。在室溫下，試管在振蕩平臺(tái)上溫和振蕩混合20到45分鐘，然后將試管正放在試管架上靜置30到50分鐘，使凝集細(xì)胞與未凝集細(xì)胞分開，未凝集細(xì)胞依然留在溶液中。用移液管從上清中回收未凝集細(xì)胞，不要攪動(dòng)凝集物?；厥盏募?xì)胞用25ml PBS洗滌，500×g離心7分鐘。然后將細(xì)胞團(tuán)重新懸浮于4ml含2％人血清白蛋白的PBS中。
表1細(xì)胞分離試劑

還可以利用含EDTA和乙二醇-雙(2-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)的低滲溶解液從凝集物中回收細(xì)胞。凝集的細(xì)胞用25ml VitaLyse(BioE，St.Paul，MN)處理，并振蕩。10分鐘后細(xì)胞在500×g離心7分鐘，去掉上清，然后將細(xì)胞重懸于4ml PBS中。
利用標(biāo)準(zhǔn)的流式細(xì)胞術(shù)和免疫表型分析法鑒定回收的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、造血干細(xì)胞和非造血干細(xì)胞。在進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)前，利用Coulter Onyx Hematology Analyzer鑒定回收的白細(xì)胞(即，白細(xì)胞計(jì)數(shù))。通過血液學(xué)分析和流式細(xì)胞術(shù)分析、根據(jù)光學(xué)發(fā)散特性鑒定細(xì)胞及標(biāo)記抗體染色來確定細(xì)胞的類型并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
如表2所示，99.9％的紅細(xì)胞被去除，99.8％的單核細(xì)胞和粒細(xì)胞、74％的B細(xì)胞、64.9％的B細(xì)胞和99.4％的血小板被從臍帶血中去除。
表2細(xì)胞回收

實(shí)施例2MLPC的純化表3所示的細(xì)胞分離試劑用于從非凝集的上清相中分離MLPC。參見圖1所示的純化示意圖。
表3細(xì)胞分離試劑

簡(jiǎn)言之，50-150ml CPDA抗凝的臍帶血(48小時(shí)以內(nèi)的臍帶血)與表3所示的等體積細(xì)胞分離組合物溫和混合30分鐘?；旌贤暌院螅瑢⑹⒂醒?細(xì)胞分離組合物混合物的容器向上放置，在正常的1×g重力下使內(nèi)容物沉降30分鐘。沉降完成后從上清中收集非凝集的細(xì)胞。通過離心然后用PBS洗滌的方法從上清中回收細(xì)胞。細(xì)胞重懸到完全MSCGMTM(間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，產(chǎn)品編號(hào)為#PT-3001，Cambrex，Walkersville，MD)中，用完全MSCGMTM將細(xì)胞濃度調(diào)整到2-9×106/ml。將細(xì)胞接種到標(biāo)準(zhǔn)塑料組織培養(yǎng)瓶(如，Corning)、帶槽的玻片或其他培養(yǎng)裝置中，在37℃、含5％ CO2的濕潤(rùn)環(huán)境中培養(yǎng)過夜。除非特別說明，以后的孵育都是在37℃、5％ CO2的濕潤(rùn)環(huán)境中進(jìn)行。在這個(gè)初始孵育過程中，MLPC粘附到塑料上。未粘附的細(xì)胞(如T細(xì)胞、NK細(xì)胞和CD34+造血干細(xì)胞)通過用完全MSCGMTM強(qiáng)力洗滌培養(yǎng)瓶或孔而去除。
通過定期去掉完全MSCGMTM并加入新鮮的完全MSCGMTM來飼養(yǎng)MLPC培養(yǎng)物。通過這種方法，細(xì)胞濃度可維持在1×105-1×106細(xì)胞/75cm2之間。當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到8×105-1×106細(xì)胞/75cm2時(shí)，用10％ DMSO和90％血清冷凍保存細(xì)胞，或者擴(kuò)增到新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。通過去掉完全MSCGMTM并加入PBS+0.1％ EGTA從粘附培養(yǎng)物上回收細(xì)胞。細(xì)胞在37℃孵育15到60分鐘，然后從培養(yǎng)瓶中收集，并用完全MSCGMTM洗滌。然后以1×105細(xì)胞/mL的濃度重新接種細(xì)胞。培養(yǎng)物生長(zhǎng)到匯合時(shí)就會(huì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞已失去增殖和分化能力。如果出現(xiàn)這種情況，培養(yǎng)物的密度就不要超過1×106細(xì)胞/75cm2。
實(shí)施例3MLPC的形態(tài)學(xué)及向成纖維細(xì)胞的發(fā)育按照實(shí)施例1和2描述的方法分離和培養(yǎng)的臍帶血來源的MLPC用標(biāo)準(zhǔn)的MSCGMTM培養(yǎng)直到匯合為止。根據(jù)供體的不同，MLPC培養(yǎng)物生長(zhǎng)到匯合所需的時(shí)間為2到8周不等。這些細(xì)胞在生長(zhǎng)和培養(yǎng)成熟期間的形態(tài)學(xué)見圖2A-2D。
在圖2A所示的早期階段，細(xì)胞分裂比較緩慢，與循環(huán)中的白細(xì)胞形態(tài)相似，但是有樹突狀的胞漿突起。許多細(xì)胞還呈現(xiàn)小的圓形細(xì)胞形態(tài)，與這些細(xì)胞在循環(huán)中的形態(tài)相似。隨著培養(yǎng)的繼續(xù)，白細(xì)胞樣細(xì)胞的形態(tài)開始從白細(xì)胞樣變成更扁平更暗的成纖維細(xì)胞樣(見圖2B)。當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，它們開始聚集、分裂并重新粘附到培養(yǎng)瓶的表面，然后再次擴(kuò)展開來。這個(gè)過程緩慢地持續(xù)進(jìn)行，直到細(xì)胞長(zhǎng)滿可用的表面。圖2C顯示了處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞的形態(tài)。圖2D顯示了MLPC完全匯合后的形態(tài)。除了在畫面的左下角發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)處于活躍分裂期的細(xì)胞以外，其他所有細(xì)胞都呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。
總之，在培養(yǎng)的早期，細(xì)胞小而圓，但是具有胞漿突起，既有手指樣突起又有高度延伸的突起，這是它們與其他血細(xì)胞的區(qū)別。開始培養(yǎng)后不久，細(xì)胞開始擴(kuò)展，變得扁平，呈現(xiàn)與成纖維細(xì)胞一致的形態(tài)。最后，細(xì)胞一旦生長(zhǎng)到匯合在一起，細(xì)胞開始大量地在平行方向上生長(zhǎng)。培養(yǎng)物多次生長(zhǎng)到匯合會(huì)導(dǎo)致其失去增殖和分化能力。
實(shí)施例4利用免疫熒光顯微鏡確定細(xì)胞的免疫表型為了確定MLPC的表面標(biāo)記，將新鮮分離的細(xì)胞接種到16孔帶槽玻片上并使其生長(zhǎng)到匯合。在培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)(從接種后3天到匯合后)收獲細(xì)胞并用下列標(biāo)記染色CD45-FITC(BD/Pharmingen)、CD34-PE(BD/Pharmingen)、CD4-PE(BioE)、CD8-PE(BioE)、抗HLA-DR-PE(BioE)、CD41-PE(BioE)、CD9-PE(Ancell)、CD105-PE(Ancell)、CD29-PE(Coulter)、CD73-PE(BD/Pharmingen)、CD90-PE(BD/Pharmingen)、抗人干細(xì)胞因子-FITC(R&D Systems)、CD14-PE(BD/Pharmingen)、CD15-FITC(Ancell)、CD38-PE(BD/Pharmingen)、CD2-PE(BD/Pharmingen)、CD3-FITC(BD/Pharmingen)、CD5-PE(BD/Pharmingen)、CD7-PE(BD/Pharmingen)、CD16-PE(BD/Pharmingen)、CD20-FITC(BD/Pharmingen)、CD22-FITC(BD/Pharmingen)、CD19-PE(BD/Pharmingen)、CD33-PE(BD/Pharmingen)、CD10-FITC(BD/Pharmingen)、CD61-FITC(BD/Pharmingen)、CD133-PE(R&DSystems)、抗STRO-1(R&D Systems)和羊抗鼠IgG(H+L)-PE(BioE)、SSEA-3(R&DSystems)和羊抗大鼠IgG(H+L)-PE(BioE)、SSEA-4(R&D Systems)和羊抗鼠IgG(H+L)-PE(BioE)。還要分析骨髓MSC(Cambrex，Walkersville，MD)和臍帶血HSC(來自上述非粘附細(xì)胞)的細(xì)胞表面標(biāo)記。
簡(jiǎn)言之，從玻片的孔中去掉細(xì)胞培養(yǎng)基，用Hank’s平衡鹽溶液+2％BSA洗滌細(xì)胞3次，然后在暗處室溫下用抗體染色細(xì)胞20分鐘。孵育以后用Hank’s平衡鹽溶液+2％BSA洗滌細(xì)胞3次，，然后用熒光顯微鏡直接觀察細(xì)胞是否有熒光。臍帶血來源的MLPC與骨髓來源的MSC及臍帶血來源的造血干細(xì)胞(HSC)進(jìn)行比較所得到的結(jié)果列于表4中。
表4


實(shí)施例5克隆的MLPC細(xì)胞系實(shí)施例2的MLPC傳2代以后，通過用含0.1％ EGTA(pH 7.3)的PBS替換細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶的塑料表面分離下來。用完全MSCGMTM將細(xì)胞稀釋到1.3個(gè)細(xì)胞/毫升，然后加入到96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔0.2ml，這樣平均3個(gè)孔約有一個(gè)細(xì)胞。在37℃過夜孵育使細(xì)胞粘附到培養(yǎng)板上以后，觀察培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞的實(shí)際分布情況。只有每孔一個(gè)細(xì)胞的孔繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞繁殖到濃度為1-5×105細(xì)胞/75cm2時(shí)將其轉(zhuǎn)移到更大的培養(yǎng)瓶中以使細(xì)胞濃度維持在1×105到5×105細(xì)胞/75cm2之間，使其保持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)。細(xì)胞在37℃、5％CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。
利用這種方法至少建立了52個(gè)克隆細(xì)胞系，分別命名如下UM081704-1-E2、UM081704-1-B6、UM081704-1-G11、UM081704-1-G9、UM081704-1-E9、UM081704-1-E11、UM081704-1-G8、UM081704-1-H3、UM081704-1-D6、UM081704-1-H11、UM081704-1-B4、UM081704-1-H4、UM081704-1-C2、UM081704-1-G1、UM081704-1-E10、UM081704-1-B7、UM081704-1-G4、UM081704-1-F12、UM081704-1-H1、UM081704-1-D3、UM081704-1-A2、UM081704-1-B11、UM081704-1-D5、UM081704-1-E4、UM081704-1-C10、UM081704-1-A5、UM081704-1-E8、UM081704-1-C12、UM081704-1-E5、UM081704-1-A12、UM081704-1-C5、UM081704-1-A4、UM081704-1-A3、MH091404-2#1-1.G10、UM093004-1-A3、UM093004-1-B7、UM093004-1-F2、UM093004-1-A12、UM093004-1-G11、UM093004-1-G4、UM093004-1-B12、UM093004-2-A6、UM093004-2-A9、UM093004-2-B9、UM093004-2-C5、UM093004-2-D12、UM093004-2-H3、UM093004-2-H11、UM093004-2-H4、UM093004-2-A5、UM093004-2-C3和UM093004-2-C10。按照實(shí)施例所述的方法分析克隆細(xì)胞系UM081704-1-E8的細(xì)胞表面標(biāo)記，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與具有成纖維細(xì)胞形態(tài)的“成熟MLPC”一樣，如表4所示。
實(shí)施例6MLPC向骨細(xì)胞的分化MLPC細(xì)胞群和克隆細(xì)胞系UM081704-1-E8都用完全MSCGMTM培養(yǎng)，并在上述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)條件下擴(kuò)增。用PBS+0.1％ EGTA處理后收獲細(xì)胞，再以5×103到2×104/ml的濃度接種用完全MSCGMTM。細(xì)胞孵育過夜使其粘附，然后培養(yǎng)基替換成成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號(hào)為#PT-3002，Cambrex)，該培養(yǎng)基由添加地塞米松、L-谷氨酰胺、抗壞血酸和β-磷酸甘油的完全MSCGMTM組成。細(xì)胞在37℃、5％ CO2的環(huán)境中培養(yǎng)，每3-4天換一次培養(yǎng)基，共培養(yǎng)2-3周。利用修改的茜素紅染色方法證明是否存在鈣結(jié)晶，在相差顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察鈣礦化的茜素紅染色情況。
實(shí)施例7MLPC向脂肪細(xì)胞的分化MLPC細(xì)胞群和克隆細(xì)胞系UM081704-1-E8都接種到完全MSCGMTM，濃度為1×104到2×105細(xì)胞/毫升培養(yǎng)基，在37℃、5％ CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。使細(xì)胞重新粘附到培養(yǎng)板上，每3-4天換一次培養(yǎng)基，直到培養(yǎng)物生長(zhǎng)到匯合為止。當(dāng)細(xì)胞100％匯合時(shí)，用脂肪細(xì)胞形成分化培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號(hào)為#PT-3004，Cambrex)培養(yǎng)，這種培養(yǎng)基由添加人胰島素、L-谷氨酰胺、地塞米松、吲哚美辛和3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤的完全MSCGMTM組成，至少培養(yǎng)14天。
為了分析分化情況，細(xì)胞用可對(duì)脂質(zhì)特異性染色的油紅染色。MLPC匯合培養(yǎng)物呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，油紅染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沒有任何跡象表明出現(xiàn)了脂質(zhì)體。但是用脂肪細(xì)胞形成培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化3周后MLPC出現(xiàn)了脂肪細(xì)胞特有的脂質(zhì)體(即，胞漿中亮白色的管狀物)，并且油紅染色后產(chǎn)生紅色。用脂肪細(xì)胞形成培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化的MLPC在用特異于甘油三酯的尼羅紅染色后還呈現(xiàn)綠色熒光。未分化的細(xì)胞維持其成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，不被染色。
實(shí)施例8MLPC向肌細(xì)胞的分化MLPC(細(xì)胞群和克隆細(xì)胞系UM081704-1-E8)以1.9×104細(xì)胞/孔的濃度接種到帶四個(gè)槽的用纖連蛋白預(yù)涂布的玻片內(nèi)的完全MSCGMTM中，并在37℃、5％ CO2的環(huán)境中培養(yǎng)24-48小時(shí)使細(xì)胞粘附到板上。去掉培養(yǎng)基，換成10μM的5-氮雜胞苷(產(chǎn)品編號(hào)為#A1287，Sigma Chemical Co.)，繼續(xù)孵育24小時(shí)。細(xì)胞用PBS洗滌2次，然后用含重組人表皮生長(zhǎng)因子(huEGF)、人胰島素、胎球蛋白、地塞米松和重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(100ng/mL)(huFGF-basic，產(chǎn)品編號(hào)為#F0291，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的SkGMTM骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號(hào)為#CC-3160，Cambrex)培養(yǎng)。每2-3天換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)約21天。對(duì)照孔用MSCGMTM培養(yǎng)，而試驗(yàn)孔用SkGMTM(如上所述)培養(yǎng)。
在開始肌細(xì)胞培養(yǎng)后7天收獲細(xì)胞。去掉培養(yǎng)上清，細(xì)胞用2％緩沖甲醛溶液固定2小時(shí)。細(xì)胞用PermaCyteTM(BioE，St.Paul，MN)進(jìn)行透化處理，然后用人快骨骼肌肌球蛋白特異性的鼠單克隆抗體(MY-32，產(chǎn)品編號(hào)為#ab7784，Abcam，Cambridge，MA)或α肌動(dòng)蛋白特異性的鼠單克隆抗體(BM 75.2，產(chǎn)品編號(hào)為#ab11008，Abcam)染色。細(xì)胞與一抗孵育20分鐘，用PBS洗滌，再用羊抗鼠IgG(H+L)-PE(BioE，St.Paul，MN)復(fù)染。肌細(xì)胞培養(yǎng)物含有快骨骼肌肌球蛋白和α肌動(dòng)蛋白，這說明MLPC已轉(zhuǎn)分化成骨骼肌細(xì)胞。
實(shí)施例9MLPC向神經(jīng)細(xì)胞的分化骨髓來源的hMSC(Cambrex)、臍帶血MLPC和MLPC克隆細(xì)胞系在上述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)。按照上述方法收獲細(xì)胞，再以每孔0.8×104個(gè)細(xì)胞的濃度接種到四槽玻片上，該玻片已預(yù)先涂布了多聚D賴氨酸和層粘連蛋白(BD Biosciences DiscoveryLabware，產(chǎn)品編號(hào)為#354688)，每孔加入0.5mL含huFGF-basic、huEGF、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)存活因子-1、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-4(20ng/mL)和200mM GlutaMaxI Supplement(產(chǎn)品編號(hào)為#35050-061，Invitrogen，Carlsbad，CA)的NPMMTM(產(chǎn)品編號(hào)為#CC-3209，Cambrex)。每2-3天換一次培養(yǎng)基，共培養(yǎng)21天。4到20天后出現(xiàn)神經(jīng)球。MLPC轉(zhuǎn)化成神經(jīng)細(xì)胞系可通過干蛋白(抗人干蛋白單克隆抗體，MAB1259，克隆196908，R&D Systems)、III類β微管蛋白(微管蛋白b-4)(抗神經(jīng)元特異性的III類β微管蛋白單克隆抗體，MAB1195，克隆TuJ-1，R&D Systems)、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP)(抗人GFAP單克隆抗體，HG2b-GF5，克隆GF5，AdvancedImmunochemical，Inc.)以及半乳糖腦苷脂(GalC)(鼠抗人GalC單克隆抗體MAB342，mGalC克隆，Chemicon)的陽(yáng)性染色來確定。
在神經(jīng)祖細(xì)胞維持培養(yǎng)基中加入10ng/mL BDNF(產(chǎn)品編號(hào)為#B3795，SigmaChemical Co.)和10ng/mL NT3(產(chǎn)品編號(hào)為#N1905，Sigma Chemical Co.)繼續(xù)培養(yǎng)10-14天，細(xì)胞可進(jìn)一步分化成神經(jīng)元。在神經(jīng)祖細(xì)胞維持培養(yǎng)基中加入10-6M視黃酸(產(chǎn)品編號(hào)為#R2625，Sigma Chemical Co.)、10ng/mL LIF(產(chǎn)品編號(hào)為#L5158，SigmaChemical Co.)和10ng/mL CNTF(產(chǎn)品編號(hào)為#C3710，Sigma Chemical Co.)繼續(xù)培養(yǎng)10-14天，神經(jīng)球可進(jìn)一步分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞。在神經(jīng)祖細(xì)胞維持培養(yǎng)基中加入10-6M T3(產(chǎn)品編號(hào)為#T5516，Sigma Chemical Co.)繼續(xù)培養(yǎng)10-14天，神經(jīng)球可進(jìn)一步分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞。分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞可由髓磷脂堿性蛋白(MBP)(抗MBP單克隆抗體，產(chǎn)品編號(hào)為#ab8764，克隆B505，Abcam)的陽(yáng)性染色來確定。
實(shí)施例10MLPC向內(nèi)皮細(xì)胞的分化MLPC以每孔1.9×104個(gè)細(xì)胞的濃度接種到四槽玻片上(2cm2)。細(xì)胞用1ml含肝素、牛腦提取物、人重組上皮生長(zhǎng)因子和氫化可的松的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基-微脈管系統(tǒng)(EGM3-MV，產(chǎn)品編號(hào)為#CC-3125，Cambrex)培養(yǎng)。每2-3更換一次培養(yǎng)基，共培養(yǎng)約21天。在7到10天內(nèi)發(fā)生形態(tài)學(xué)的改變。MLPC分化成內(nèi)皮細(xì)胞系可通過CD62E [E-選擇素，鼠抗人CD62E單克隆抗體，產(chǎn)品編號(hào)為#551145，克隆68-5H11，BDPharmingen]和CD102[ICAM-2，抗人ICAM-2單克隆抗體，MAB244，克隆86911，R&D Systems]染色來分析。在MSCGM中生長(zhǎng)14天的對(duì)照MLPC是CD62E和CD102染色陰性的，而分化的培養(yǎng)物是CD62E和CD102雙陽(yáng)性的。
實(shí)施例11MLPC向肝細(xì)胞/胰腺細(xì)胞前體細(xì)胞的分化MLPC以1×105細(xì)胞/cm2的濃度體外接種到HCMTM培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號(hào)為#CC-3198，Cambrex)內(nèi)，該培養(yǎng)基含有抗壞血酸、氫化可的松、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、huEGF、重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(40ng/mL)、huFGF-basic(20ng/mL)、重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-4(20ng/mL)和干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(40ng/mL)。細(xì)胞培養(yǎng)29天或更長(zhǎng)時(shí)間以使其分化成肝細(xì)胞系和胰腺細(xì)胞系的前體細(xì)胞。MLPC從成纖維細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變成肝細(xì)胞形態(tài)，表達(dá)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的細(xì)胞表面受體，產(chǎn)生肝細(xì)胞的細(xì)胞產(chǎn)物人血清白蛋白和胰島細(xì)胞的細(xì)胞產(chǎn)物胰島素，二者都可以通過在30天時(shí)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)抗體染色來確定。
其他實(shí)施方式雖然結(jié)合上面的詳細(xì)說明和實(shí)施例已對(duì)本發(fā)明作了描述，但是上述的說明和實(shí)施例是為了說明的目的，并不意味著對(duì)附屬權(quán)利要求所定義的本發(fā)明范圍的限制。其他方面、優(yōu)點(diǎn)及修飾都在權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.人胎兒血多譜系祖細(xì)胞(MLPC)的純化群，其特征在于，所述MLPC是CD9和CD45陽(yáng)性的。
2.如權(quán)利要求1所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC展示白細(xì)胞形態(tài)。
3.如權(quán)利要求1所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC獲自臍帶血。
4.如權(quán)利要求1所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC還是SSEA-4陽(yáng)性的。
5.如權(quán)利要求1所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC還是CD34陽(yáng)性的。
6.如權(quán)利要求1所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC還是CD133、CD41、CD44、CD105、CD29、CD73、CD90、干細(xì)胞因子、SSEA-3和CD13陽(yáng)性的。
7.如權(quán)利要求1所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC是CD15、CD38、血型糖蛋白-A、CD2、CD3、CD8、CD19、CD20、CD22、CD5、CD7、CD10、CD14、CD4、HLA-DR、CD16、CD33和CD61陰性的。
8.如權(quán)利要求1所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)后獲得成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。
9.如權(quán)利要求1所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC在培養(yǎng)時(shí)粘附到塑料表面。
10.如權(quán)利要求1所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC能夠分化成所有三個(gè)胚層來源的細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求1所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC能夠分化成具有骨細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有脂肪細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有神經(jīng)干細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有肌細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有內(nèi)皮細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有肝細(xì)胞表型的細(xì)胞和具有胰腺細(xì)胞表型的細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求1所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC包含外源核酸。
13.如權(quán)利要求12所述的MLPC純化群，其特征在于，所述外源核酸編碼多肽。
14.人胎兒血MLPC的純化群，其特征在于，所述MLPC是CD9陽(yáng)性、CD45陰性、CD34陰性、以及SSEA-4陰性的。
15.如權(quán)利要求14所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC展示成纖維細(xì)胞的形態(tài)。
16.如權(quán)利要求14所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC獲自臍帶血。
17.如權(quán)利要求14所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC還是CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105陽(yáng)性的。
18.如權(quán)利要求14所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC還是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD41、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋白-A、干細(xì)胞因子、SSEA-3和HLA-DR陰性的。
19.如權(quán)利要求14所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC在培養(yǎng)時(shí)粘附到塑料表面。
20.如權(quán)利要求14所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC能夠分化成所有三個(gè)胚層來源的細(xì)胞。
21.如權(quán)利要求14所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC能夠分化成具有骨細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有脂肪細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有神經(jīng)干細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有肌細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有內(nèi)皮細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有肝細(xì)胞表型的細(xì)胞以及具有胰腺細(xì)胞表型的細(xì)胞。
22.如權(quán)利要求14所述的MLPC純化群，其特征在于，所述MLPC包含外源核酸。
23.如權(quán)利要求22所述的MLPC純化群，其特征在于，所述外源核酸編碼多肽。
24.人胎兒血MLPC的克隆系，其特征在于，所述MLPC是CD9陽(yáng)性、CD45陰性、CD34陰性、以及SSEA-4陰性的。
25.如權(quán)利要求24所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC展示成纖維細(xì)胞的形態(tài)。
26.如權(quán)利要求24所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC獲自臍帶血。
27.如權(quán)利要求24所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC還是CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105陽(yáng)性的。
28.如權(quán)利要求24所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC還是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD41、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋白-A、干細(xì)胞因子、SSEA-3和HLA-DR陰性的。
29.如權(quán)利要求24所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC在培養(yǎng)時(shí)粘附到塑料表面。
30.如權(quán)利要求24所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC能夠分化成所有三個(gè)胚層來源的細(xì)胞。
31.如權(quán)利要求24所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC能夠分化成具有骨細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有脂肪細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有神經(jīng)干細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有肌細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有內(nèi)皮細(xì)胞表型的細(xì)胞、具有肝細(xì)胞表型的細(xì)胞以及具有胰腺細(xì)胞表型的細(xì)胞。
32.如權(quán)利要求24所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC包含外源核酸。
33.如權(quán)利要求32所述的克隆系，其特征在于，所述外源核酸編碼多肽。
34.如權(quán)利要求24所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC在培養(yǎng)時(shí)至少經(jīng)歷了5次倍增。
35.如權(quán)利要求24所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC在培養(yǎng)時(shí)經(jīng)歷了至少8次倍增。
36.如權(quán)利要求24所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC在培養(yǎng)時(shí)經(jīng)歷了至少10次倍增。
37.如權(quán)利要求24所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC在培養(yǎng)時(shí)經(jīng)歷了至少25次倍增。
38.包含權(quán)利要1所述MLPC純化群、權(quán)利要求14所述MLPC純化群或權(quán)利要求24所述克隆系以及培養(yǎng)基的組合物。
39.如權(quán)利要求38所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含冷凍保存液。
40.如權(quán)利要求39所述的組合物，其特征在于，所述冷凍保存液是二甲亞砜(DMSO)。
41.如權(quán)利要求40所述的組合物，其特征在于，所述冷凍保存液是1到10％的DMSO。
42.如權(quán)利要求39所述的組合物，其特征在于，所述冷凍保存液是胎牛血清、人血清或人血清白蛋白和如下一種或多種物質(zhì)的混合物DMSO、海藻糖和葡聚糖。
43.如權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于，所述冷凍保存液是人血清、DMSO和海藻糖。
44.如權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于，所述冷凍保存液是胎牛血清和DMSO。
45.包含權(quán)利要1所述MLPC純化群、權(quán)利要求14所述MLPC純化群或權(quán)利要求24所述克隆系的制品。
46.如權(quán)利要求45所述的制品，其特征在于，所述MLPC純化群或所述克隆系被盛裝在容器內(nèi)。
47.如權(quán)利要求46所述的制品，其特征在于，所述容器是玻璃瓶。
48.如權(quán)利要求46所述的制品，其特征在于，所述容器是袋子。
49.如權(quán)利要求46所述的制品，其特征在于，所述容器還盛有冷凍保存液。
50.一種從人胎兒血中純化MLPC群的方法，所述方法包括a)使人胎兒血樣本與組合物接觸，所述組合物包含i)葡聚糖；ii)抗血型糖蛋白-A抗體；iii)抗CD15抗體；以及iv)抗CD9抗體；b)使所述樣品分成凝集相和上清相；c)從所述上清相中回收細(xì)胞；以及d)通過使MLPC粘附到固體基質(zhì)上從回收的細(xì)胞中純化MLPC，其中所述MLPC是CD9和CD45陽(yáng)性的。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述MLPC還是CD34、CD133、CD41、CD44、CD105、CD29、CD73、CD90、干細(xì)胞因子、SSEA-3、SSEA-4和CD13陽(yáng)性的。
52.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述MLPC是CD15、CD38、血型糖蛋白-A、CD2、CD3、CD8、CD19、CD20、CD22、CD5、CD7、CD10、CD14、CD4、HLA-DR、CD16、CD33和CD61陰性的。
53.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述胎兒血樣本是臍帶血。
54.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述固體基質(zhì)是塑料基質(zhì)。
55.如權(quán)利要求50所述的方法，所述方法還包括培養(yǎng)所述MLPC使其獲得成纖維細(xì)胞表型，其中所述MLPC在獲得所述成纖維細(xì)胞表型后是CD9陽(yáng)性、CD45陰性、CD34陰性、以及SSEA-4陰性的。
56.如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述MLPC在獲得所述成纖維細(xì)胞表型后還是CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105陽(yáng)性的。
57.如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述MLPC在獲得所述成纖維細(xì)胞表型后還是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD41、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋白-A、干細(xì)胞因子、SSEA-3和HLA-DR陰性的。
58.如權(quán)利要求50或55所述的方法，還包括檢測(cè)所述MLPC是否表達(dá)CD9。
59.如權(quán)利要求58所述的方法，還包括檢測(cè)所述MLPC是否表達(dá)CD29、CD45、CD73和CD90。
60.一種冷凍保存MLPC的方法，所述方法包括a)使權(quán)利要求1所述的MLPC純化群、權(quán)利要求14所述的MLPC純化群或權(quán)利要求24所述的克隆系與冷凍保存液接觸；以及b)冷凍所述MLPC純化群或所述克隆系。
61.如權(quán)利要求60所述的方法，其特征在于，所述冷凍保存液是DMSO。
62.如權(quán)利要求60所述的方法，其特征在于，所述冷凍保存液是胎牛血清、人血清或人血清白蛋白和如下一種或多種物質(zhì)的混合物DMSO、海藻糖和葡聚糖。
63.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述冷凍保存液是人血清、DMSO和海藻糖。
64.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述冷凍保存液是胎牛血清和DMSO。
65.如權(quán)利要求60所述的方法，其特征在于，所述MLPC純化群或所述克隆系以1×105到5×107細(xì)胞/毫升的濃度懸浮在所述冷凍保存液中。
66.如權(quán)利要求60所述的方法，其特征在于，所述MLPC純化群或所述克隆系以可控速度冷凍。
67.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述冷凍速度是電控制的。
68.如權(quán)利要求60所述的方法，其特征在于，所述MLPC純化群或所述克隆系通過放置在液氮冷凍儲(chǔ)藏罐的蒸汽相中進(jìn)行乙醇浴而冷凍。
69.一種制備分化細(xì)胞群的方法，所述方法包括用有效誘導(dǎo)MLPC分化的試劑培養(yǎng)權(quán)利要1所述的MLPC純化群、權(quán)利要求14所述的MLPC純化群或權(quán)利要求24所述的克隆系。
70.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述試劑包含胰島素、谷氨酰胺、地塞米松、吲哚美辛和3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤。
71.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述試劑包含地塞米松、谷氨酰胺、抗壞血酸和β-磷酸甘油。
72.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述試劑包含上皮生長(zhǎng)因子、胰島素、胎球蛋白、地塞米松和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
73.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述試劑包含堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、NSF-1和視黃酸。
74.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述試劑包含肝素、牛腦提取物、上皮生長(zhǎng)因子和氫化可的松。
75.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述試劑包含抗壞血酸、氫化可的松、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、表皮生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-4和干細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
全文摘要
本發(fā)明描述了能夠廣譜轉(zhuǎn)分化的胎兒血多譜系祖細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/02GK101080486SQ200580012739
公開日2007年11月28日 申請(qǐng)日期2005年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月23日
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