專利名稱：Hiv－1通用引物及探針pcr檢測技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
屬于體外生物醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)(PCR熒光檢測技術(shù))領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
熒光探針是高度特異的定量PCR技術(shù)，利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號。由于探針與模板是特異性結(jié)合，所以熒光信號的強弱就代表了模板的數(shù)量。探針的5′端標(biāo)記有報告基團FAM，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團TAMRA。當(dāng)探針完整的時候，報告基團所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其3′→5′外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團遠離淬滅基團，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號。所以，每經(jīng)過一個PCR循環(huán)，熒光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數(shù)增長的過程。信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。熒光定量技術(shù)正是基于這樣的原理設(shè)計的，該技術(shù)為HIV感染的早期診斷、大規(guī)模篩查、療效動態(tài)分析、新藥開發(fā)等提供良好的技術(shù)支持。
該技術(shù)通過篩選數(shù)千條HIV基因序列，獲得針對HIV各亞型、各分離株檢測的特異、通用引物及熒光探針，通過檢測各種HIV標(biāo)準(zhǔn)血清及臨床血清，確定該試劑盒的各種檢測指標(biāo)，并以國際上公認(rèn)的HIV bDNA檢測試劑盒作為對照，確定該試劑盒檢測的特異性、敏感性及檢測的最低拷貝數(shù)，為HIV的確診、大規(guī)模篩選、病情程度判斷、療效評價、新藥開發(fā)等提供一個簡便、價廉的檢測手段，并最終將取代極為昂貴的進口bDNA定量檢測試劑盒。其關(guān)鍵技術(shù)為獲得針對各種HIV亞型及分離株的特異、敏感的通用引物及通用探針，制備高特異性、高敏感性、重復(fù)性好的HIV熒光定量PCR檢測試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
該技術(shù)選用了針對HIV-1各亞型特異、通用的引物及熒光探針，通過檢測各種HIV-1標(biāo)準(zhǔn)血清及臨床血清，確定其檢測HIV的各種檢測指標(biāo)特異性100％、敏感性95％、重復(fù)性CV值＜10％，HIV檢測的最低含量為50拷貝/ml，證實所采用的通用引物及通用熒光探針具有很好的敏感性、特異性及重復(fù)性。
具體實施例方式
1、標(biāo)本種類待測標(biāo)本為咽拭子、漱口液等。
標(biāo)本采集咽拭子用棉簽擦拭雙側(cè)咽，扁桃體及咽后壁，將棉簽頭浸入含生理鹽水的試管中，棄去尾部。
標(biāo)本存貯當(dāng)天不處理的標(biāo)本置-70℃保存。
2、樣本處理200ul血清+400ul RNA裂解液，振蕩15S；混勻60℃水浴15min；離心數(shù)秒；加入600ul異丙醇，室溫5min；600ul 75％乙醇洗滌沉淀，吸水紙洗干，37℃晾干10min，備用(如需保存RNA，則加入DEPC處理水，一20℃(保存)。加入28ul逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(內(nèi)含0.2uM反義引物，1.8mM Mg2+，50mMTris-HCl(pH8.5)，50mM KCl)及2ul AMV酶，12000r/min離心10S，42℃水浴45min。
3、探針標(biāo)記熒光探針序列的5’端及3’端分別用FAM及DABCYL/TAMRA標(biāo)記。
4、PCR擴增體系和條件取Taq酶2.5U加入反應(yīng)液管內(nèi)(反應(yīng)液0.4uM正義引物，0.4uM反義引物，0.2uM熒光分探針，5.0mM Mg2+，50mM Tris-HCl(pH8.5)，50mM KCl)，然后將樣本、陰性對照或陽性對照的反轉(zhuǎn)錄液各5μl分別加入反應(yīng)液管內(nèi)，混勻后10000r/min離心10s上機(ABI PRISM 7700)擴增和檢測分析。
PCR擴增參數(shù)37℃2min；94℃3min；94℃15sec，60℃30sec，40個循環(huán)熒光信號的收集定為FAM(激發(fā)波長480nm，發(fā)射波長520nm)，數(shù)據(jù)的采集定在60℃。
5、結(jié)果分析在File菜單中選擇 將出現(xiàn) 對話框，指定保存文件的名字，單擊 保存文件。
在 頁面選中所有樣品檢測孔，在 菜單中選取 軟件將對實驗結(jié)果進行分析，使用PE 7700熒光PCR檢測儀進行結(jié)果分析時，基線取3-10或3-15個循環(huán)的熒光信號。
閾值設(shè)定原則以陰性對照擴增曲線的最高點Ct值＝40為準(zhǔn)(其它儀器基線和閾值設(shè)定根據(jù)儀器可作相應(yīng)調(diào)整)。
6、質(zhì)量控制①試劑盒陽性對照CT值＜35；②陰性對照CT值為40，③全程系統(tǒng)參照物CT值＜38，若對照樣品檢測結(jié)果不符合上述條件，認(rèn)為實驗不成立，全部試驗重做。
7、結(jié)果判斷①若檢測樣本的CT值＜38，則判該樣本為陽性。
②若檢測樣本的CT值＝40，則判該樣本為陰性。
③若檢測樣本的CT值38-40之間，為實驗灰區(qū)，需重復(fù)實驗一次，若重復(fù)實驗結(jié)果樣本＞38，判為陽性，否則判為陰性。
權(quán)利要求
1.本試劑盒所使用的探針序列ACYACTGCCCCTTCACCTTTCCASAG要求保護，其它類似ACYACTGCCCCTTCACCTTTCCASAG序列制備的HIV-1探針或引物的方法也要求保護；
2.本試劑盒所使用的PCR正鏈引物序列TTTGGAARGGACCAGCMAA要求保護，其它類似TTTGGAARGGACCAGCMAA序列制備的HIV-1 PCR引物及探針的方法也要求保護；
3.本試劑盒所使用的PCR反義引物序列AKCACCTCCATCTGTTTTCC，其正義鏈為GGAAAACAGATGGCAGGTGMT要求保護，其它類似AKCACCTGCCATCTGTTTTCC序列制備的HIV-1 PCR引物及探針的方法也要求保護。
全文摘要
人類免疫缺陷病毒(HIV)通用探針及引物PCR檢測技術(shù)是體外生物診斷的一部分。該技術(shù)選用了針對HIV－1各亞型的通用正義引物、通用反義引物及通用熒光探針，并用熒光探針PCR檢測技術(shù)。該探針5’標(biāo)記FAM，3’標(biāo)記TAMRA。由該方法組成的檢測試劑盒對各種HIV－1亞型標(biāo)準(zhǔn)血清及臨床血清，獲得該試劑盒用于HIV檢測的各種參數(shù)為特異性100％、敏感性95％、重復(fù)性CV值＜10％、HIV檢測的最低含量為50拷貝/ml。本發(fā)明還詳述了熒光探針的基本原則及HIV熒光探針PCR檢測技術(shù)的具體方法。
文檔編號C12Q1/68GK1966716SQ20051004854
公開日2007年5月23日 申請日期2005年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月15日
發(fā)明者王云龍, 李智濤, 王麗, 周凈, 陳小科 申請人:河南省生物工程技術(shù)研究中心