專利名稱：蘭花細(xì)菌性褐斑病菌檢測用引物和探針及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)，具體地說涉及蘭花細(xì)菌性褐斑病菌 檢測用引物及探針。
背景技術(shù)：
蘭花細(xì)菌性褐斑病(」c^fovorax ave"fle subsp. ca"/e，g)是蘭花
上一種重要的細(xì)菌病害，被列為我國進(jìn)境植物檢疫性有害生物。該 病菌主要侵染蝴蝶蘭，卡特萊蘭，文心蘭，石斛蘭，杓蘭等多種蘭 科植物，該病可通過植株遠(yuǎn)距離傳播，該病目前主要分布于菲律賓、 意大利、葡萄牙、澳大利亞以及我國臺灣等國家和地區(qū)。近年來我 國蘭花生產(chǎn)發(fā)展很快，引進(jìn)蘭花品種和數(shù)量大幅度增加，該病傳入 的風(fēng)險日益增大。
本研究選擇已報道的蘭花褐斑病菌ITS序列設(shè)計一條熒光標(biāo)記 探針和一對引物，建立了蘭花褐斑病菌的熒光PCR檢測方法，反應(yīng) 結(jié)東即可根據(jù)擴(kuò)增曲線判定是否有蘭花褐斑病菌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供用于蘭花細(xì)菌性褐斑病菌實時熒光PCR檢 測的引物及探針序列。
本發(fā)明通過分析已報道蘭花細(xì)菌性褐斑病菌ITS序列的基礎(chǔ)上， 分別設(shè)計引物和熒光探針。所述的引物對由正向和反向引物組成， 其核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO.l和SEQIDN0.2所示；所 述探針的核苷酸序列如序列表中的SEQIDN0.3所示，該探針的一 端標(biāo)記有報告熒光染料，另一端標(biāo)記有淬滅熒光染料，該探針可用 的報告熒光染料選自FAM、 HEX、 TET、 JOE、 VIC、 FITC、 CY3和CY5中一種，可用的淬滅熒光染料選自TAMRA、ROX、DABCYL、 BHQ1和BHQ2。
根據(jù)TaqMan技術(shù)，在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上添加了 一條標(biāo)記了兩 個熒光染料基團(tuán)的核苷酸探針，例如將報告熒光染料標(biāo)記在探針的 5'端，淬滅熒光染料標(biāo)記在探針的3'端，兩者構(gòu)成能量轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)，即 報告熒光染料所發(fā)射的熒光可被淬滅熒光染料吸收，當(dāng)二者距離變 遠(yuǎn)時，抑制作用減弱，報告熒光染料信號增強。在擴(kuò)增反應(yīng)過程中， 探針同模板上的目的擴(kuò)增片段雜交，由于％《酶具有5'端到3'端的 外切酶活性，在擴(kuò)增延伸階段將探針切斷，淬滅熒光染料的抑制作 用消失，報告熒光染料信號增強，從而實現(xiàn)對蘭花細(xì)菌性褐斑病菌 的檢測。
具體地，本發(fā)明提供了 一種蘭花細(xì)菌性褐斑病菌檢測用引物， 該引物的正向引物序列SEQIDNO.l (FP)和反向引物序列SEQID N0.2 (RP)的核苷酸序列為
SEQ ID NO. 1: 5 '-GTCGGTTCGATCCCGTCAT-3' SEQ ID NO.2: 5'陽GGCAACGCTGATTCGACTCTAT陽3' 本發(fā)明還提供了 一種與上述引物配合使用的探針，其核苷酸序 列為SEQ ID NO.3: 5'- ACGATATGCCCTGCGGTAG -3' (LP),該 探針一端標(biāo)記有報告熒光染料，另 一端標(biāo)記有淬滅熒光染料。
優(yōu)選上述探針的5'端標(biāo)記有FAM熒光染料，3'標(biāo)記有TAMRA 熒光染料。
本發(fā)明還提供了一種檢測蘭花細(xì)菌性褐斑病菌的方法，該方法 以樣品總DNA為模板，利用核苷酸序列為SEQIDNO.l的引物FP 和核苷酸序列為SEQIDNO.2的引物RP以及核苷酸序列為SEQID NO.3的探針LP進(jìn)行實時熒光PCR檢測，每個循環(huán)結(jié)東釆集數(shù)據(jù)， 反應(yīng)結(jié)東后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定蘭花細(xì)菌性褐斑病菌的存在。
優(yōu)選地，上述方法中的實時熒光PCR反應(yīng)過程中的退火溫度為60°C。
本發(fā)明還提供了一種用于檢測蘭花細(xì)菌性褐斑病菌的試劑盒， 該試劑盒含有上述引物SEQ ID NO.l和SEQ ID N0.2。
優(yōu)選的，上述試劑盒還包括核苷酸序列為SEQIDNO.3的探針。
具體地，本發(fā)明的檢測蘭花細(xì)菌性褐斑病菌的方法是以樣品總 DNA為模板，進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件是在反應(yīng)體系中 加入超純水水，2xMasterMix,引物FP,引物RP，探針LP,總DNA。 其中Master Mix購自Applied Biosystems公司。
更具體地，本發(fā)明的檢測蘭花細(xì)菌性褐斑病菌的方法是以樣品 總DNA為模板，進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件是在50pL反應(yīng) 體系中加入21.5|aL超純水水，25pL 2xMaster Mix, 1 引物FP ( 20 }imol/L )， 1 引物RP ( 20 jimol/L )， 1 探針LP ( 10 pmol/L ), 1.6 ng總DNA。
其中，上述方法的反應(yīng)條件是第一個循環(huán)為95。C 10min;隨 后40個循環(huán)，94°C 15s, 60°C lmin。
當(dāng)然，可以根據(jù)本發(fā)明給出的引物或者其擴(kuò)增產(chǎn)物序列設(shè)計其 他類型的探針，以適用不同方法的熒光PCR檢測。
進(jìn)一步，還可以將本發(fā)明引物、探針以及相關(guān)試劑組裝成試劑 盒，以方便使用。
根據(jù)蘭花細(xì)菌性褐斑病菌ITS序列設(shè)計的本發(fā)明的引物及探針 是經(jīng)過長期篩選得到的，該探針特異性好，用于熒光PCR檢測靈敏 性高。而且應(yīng)用該引物和探針的檢測方法準(zhǔn)確性高、靈敏度高，其 能夠快速簡單地判斷樣品是否有蘭花細(xì)菌性褐斑病菌，為進(jìn)出口安 全提供了保證。


圖l是樣品檢測，實時熒光PCR技術(shù)檢測蘭花細(xì)菌性褐斑病菌的結(jié) 果，其中l(wèi)是陽性對照，2是蘭花褐斑病樣品，3是健康蘭花。圖2是實時熒光PCR靈敏度測試，其中1-8表示DNA的濃度 分別為9xl(T2fig/|LiL, 9xl(rVg/VL, 9xlO國Vg/pL, 9xl(rVg/pL,
9xio-Vg4iL, 9xi(rVg/)iL, 9xi(rVg"L, 9xi(rVg/inL。
具體實施例方式
下面實施例用于對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不用來限制本發(fā)明 的范圍。 實施例l
引物及探針的設(shè)計和合成
根據(jù)蘭花細(xì)菌性褐斑病菌ITS序列，釆用探針設(shè)計軟件Express 2.0設(shè)計引物及探針，經(jīng)過大量篩選得到如下序列的引物序列和探針 引物的正向序列(FP)為SEQIDNO.l,引物的反向序列(RP) 為SEQIDN0.2,具體序列的組成如下
SEQ ID NO. 1: 5 '誦GTCGGTTCGATCCCGTCAT-3' SEQ ID N0.2: 5'-GGCAACGCTGATTCGACTCTAT-3' 探針的核苷酸序列為LP: 5'-ACGATATGCCCTGCGGTAG-3' 根據(jù)上述核苷酸序列信息合成正向引物FP、反向引物RP和探 針LP,在探針的5'端用FAM熒光染料標(biāo)記，3'端用TAMRA標(biāo) 記。將上述引物FP和引物RP分別配制成濃度為20 (imol/L的溶液， 將標(biāo)記的探針配制成10fxmol/L的溶液，備用。
總DNA的提取
1) 分別釆集適量的健康和表現(xiàn)病狀的石斛蘭幼嫩葉片，按照如 下步驟制備總DNA樣品溶液。
用液氮將上述嫩葉片研成粉末，取0.4 g裝入1.5 ml的離心管中 (該離心管在-20 -C預(yù)冷)；
2) 預(yù)熱1.5xCTAB到95°C,取1 ml加入到裝有葉片粉末的離 心管中，混勻(防止凍融)；3) 立即置于65。C水浴30min,每5min上下顛倒l次，12000g離心5 min。
4) 吸取上清液約60(^1,加入等體積(600jiL)氯仿/異戊醇(24:1)混合液，上下顛倒數(shù)次，至下層液相呈深綠色為止，12000g離心5分鐘。
5) 取450pL上清液于一新1.5ml離心管，加入lml的95°/。乙醇和45pL的IOMNH4AC,混勾，室溫放置10min。
6) 然后12000g離心10min,去上清，用75%的乙醇浸洗沉淀，自然干燥約30min。
7) 加入50pL的1/10TE (含^(ig的RNase ),置于4。C過夜，待DNA溶解后，得健康和病癥總DNA模板液，檢測DNA濃度及質(zhì)量，備用。
實時PCR擴(kuò)增
1、 建立實時熒光PCR反應(yīng)體系
取上述總DNA模板液分別配制成含1.6ngDNA的健康和病癥的模板液，另外配制9xlO g/VLDNA的蘭花褐斑病陽性對照，分別進(jìn)行如下實時熒光PCR反應(yīng)
在3個50iiL反應(yīng)體系中都加入21.5 ^L超純水，25 (iL2xMasterMix (購自Applied Biosystems公司)，1 pL引物FP( 20 (imol/L )， 1 jaL引物RP ( 20 pmol/L )， 1 |iL探針LP ( 10 (imol/L),然后分別加入1.6ng的健康總DNA、病癥總DNA和陽性對照總DNA
2、 實時熒光PCR反應(yīng)
將樣品分別管放入ABI公司ABI7700型號熒光PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng)第一個循環(huán)為95匸10min;隨后40個循環(huán)，94°C 15s, 60°C lmin。每個循環(huán)結(jié)束后釆集數(shù)據(jù)。熒光強度變化曲線如圖l所示。試驗結(jié)果
通過實時熒光PCR檢測可觀察到明顯的熒光強度變化，健康對照沒有變化,表現(xiàn)癥狀的石斛蘭葉片總DNA的熒光強度與陽性對照的熒光強度都產(chǎn)生了變化，可以看出釆用上述方法對葉片中蘭花褐斑病的檢測很準(zhǔn)確和靈敏。實施例2
用超純水分別稀釋細(xì)菌DNA,進(jìn)行相對靈敏度檢測，在50pL反應(yīng)體系中，DNA分別為9xlO g4iL， 9xlO g/jiL， 9xlO-4|ug/|iL，9xlO g4iL， 9xlO g小L， 9xl(rVg/pL， 9xl(rVg/iiL， 9xlO-Vg/|LiL。按照如上方法，使用本發(fā)明的引物SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2和探針SEQIDN0.3測試本發(fā)明方法的檢測靈敏度，結(jié)果如圖2所示，本發(fā)明方法的最低檢測限是9x 1 (TVg爾L,本發(fā)明方法用于檢測蘭花褐斑病菌非常靈敏，效果非常好。序歹IJ 表
<110>中國檢驗檢疫科學(xué)研究院
<120>蘭花細(xì)菌性褐斑病菌檢測用引物和探針及其檢測方法
<130〉
<160〉 3
<170> Patentln version 3.3
<210><211〉<212〉<213><400〉
1
19
DNA
人工序列1
gtcggttcga tcccgtcat 19
<210> 2<211> 22<212> DNA<213〉人工序列<400> 2
ggcaacgctg attcgactct at 22
<210〉 3<211> 19<212〉 DNA<213>人工序列<400> 3
acgatatgcc ctgcggtag 19
權(quán)利要求
1、一種蘭花細(xì)菌性褐斑病菌檢測用引物，該引物的正向引物序列SEQ ID NO.1和反向引物序列SEQ ID NO.2如下SEQ ID NO.15′-GTCGGTTCGATCCCGTCAT-3′SEQ ID NO.25′-GGCAACGCTGATTCGACTCTAT-3′。
2、 與權(quán)利要求l所述的引物配合使用的探針，其核苷酸序列為 SEQ ID N0.3: 5'- ACGATATGCCCTGCGGTAG -3'，該探針 一端標(biāo)記 有報告熒光染料，另一端標(biāo)記有淬滅熒光染料。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的探針，其5'端標(biāo)記有FAM熒光染料， 3'標(biāo)記有TAMRA熒光染料。
4、 一種檢測蘭花細(xì)菌性褐斑病菌的方法，該方法以樣品總DNA 為模板,利用核苷酸序列為SEQIDNO.l的引物FP和核苷酸序列為 SEQ ID NO.2的引物RP以及核苷酸序列為SEQ ID NO.3的探針LP 進(jìn)行實時熒光PCR檢測，每個循環(huán)結(jié)束釆集數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)東后根據(jù) 擴(kuò)增曲線判定蘭花細(xì)菌性褐斑病菌的存在。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中實時熒光PCR反應(yīng)過程 中的退火溫度為60°C。
6、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，以樣品總DNA為模板，進(jìn)行 實時熒光PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件是在反應(yīng)體系中加入超純水水， 2xMasterMix,引物FP,引物RP,探針LP，總DNA。其中Master Mix購自Applied Biosystems公司。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中反應(yīng)條件是在50/xL反應(yīng) 體系中加入21.5/xL超純水水，25/xL 2xMaster Mix, 1 /iL引物FP ( 20 /miol/L ), 1 /xL引物RP ( 20 /xmol/L )， 1 探針LP ( 10 /xmol/L), 1.6 ng總DNA。
8、 根據(jù)權(quán)利要求4-7所述的方法，其中熒光PCR反應(yīng)的反應(yīng)條 件是第一個循環(huán)為95°C 10min;隨后40個循環(huán)，94°C 15s， 60°Clmin。
9、 一種用于檢測蘭花細(xì)菌性褐斑病菌的試劑盒，該試劑盒包含 引物SEQ ID NO.l和SEQ ID N0.2。
10、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，該試劑盒還包括核苷酸序 列為SEQIDN0.3的探針。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種蘭花細(xì)菌性褐斑病菌檢測用引物和探針及其檢測方法，所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，所述探針的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了檢測蘭花細(xì)菌性褐斑病菌的方法。該方法以樣品總DNA為模板，利用上述引物和探針進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增，每個循環(huán)結(jié)束采集數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。本發(fā)明探針特異性好，檢測方法快速簡單，準(zhǔn)確性高，靈敏度高，為進(jìn)出口安全提供了保證。
文檔編號C12Q1/68GK101457259SQ200910076399
公開日2009年6月17日 申請日期2009年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月15日
發(fā)明者丁翠珍, 朱水芳, 葛建軍, 趙文軍, 青 陳, 陳洪俊, 陳紅運 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院;廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心