專利名稱：基于凝膠固定核酸的dna微陣列芯片制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA微陣列芯片的制備方法，尤其涉及一種基于凝膠固定核酸的DNA微陣列芯片制備方法。
背景技術(shù)：
基因芯片是近年來在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)高新技術(shù)。所謂基因芯片就是按特定的排列方式固定有大量基因探針(寡核苷酸探針或cDNA探針)的硅片、玻片、塑料片。基因芯片技術(shù)是高效地大規(guī)模獲取相關(guān)生物信息的主要手段。目前，該技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域主要有基因表達(dá)譜分析、新基因發(fā)現(xiàn)、基因突變及多態(tài)性分析、基因組文庫作圖、疾病診斷和預(yù)測(cè)、藥物篩選、基因測(cè)序等。九十年代初以美國(guó)為主開始進(jìn)行的各種生物芯片的研制，不到十年的功夫，芯片技術(shù)得以迅速發(fā)展，并呈現(xiàn)發(fā)展高峰。目前基因芯片的制備可以分成點(diǎn)樣制備和原位合成制備法。以Affymetrix公司為代表的原位合成制備法是構(gòu)建高密度寡核酸陣列的最有效方法，但由于其缺乏靈活性而使單片芯片的價(jià)格高而不能被廣泛使用，況且該方法也無法制備通過PCR擴(kuò)增的cDNA芯片。點(diǎn)樣法具有相當(dāng)?shù)撵`活性適合大多數(shù)研究和臨床應(yīng)用。對(duì)于中低密度的芯片而言，點(diǎn)樣法比原位合成具有更快的生產(chǎn)速度。該方法目前被大多數(shù)研究單位所采用。點(diǎn)樣法制備的基因芯片質(zhì)量好壞的由下列兩個(gè)因素決定一是固定核酸的載體，另一個(gè)是在載體上固定核酸所采用的化學(xué)方法。換一種方法說就是核酸固定的效率和核酸雜交的效率是決定基因芯片的準(zhǔn)確性和靈敏性的兩個(gè)最重要因素。在載體使用方面目前廣泛使用的載體是玻璃，石英等硬質(zhì)載體，這類載體由于只能在其表面固定核酸，而且核酸固定密度太高往往會(huì)由于空間位阻效應(yīng)而導(dǎo)致雜交效率的降低。在采用的化學(xué)固定方法方面不管使用玻璃等硬質(zhì)載體還是凝膠載體，目前廣泛的使用的化學(xué)方法均需要多步化學(xué)反應(yīng)過程對(duì)載體進(jìn)行活化獲得與核酸連接的諸如醛基等活性基團(tuán)，過程繁瑣，不但耗時(shí)長(zhǎng)、工作量大，而且穩(wěn)定性和重復(fù)性差，使得芯片質(zhì)量很不穩(wěn)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種反應(yīng)可控的基于凝膠固定核酸的DNA微陣列芯片制備方法，由本發(fā)明制得的DNA微陣列芯片具有很好的均勻性、重復(fù)性和高的準(zhǔn)確性和高的靈敏性，并能提高雜交效率。
本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種基于凝膠固定核酸的DNA微陣列芯片制備方法，將丙烯酰胺修飾的核酸、丙烯酰胺單體、過硫酸銨、丙三醇和水混合成預(yù)聚合物，其中，核酸的濃度在0.001-100uM之間，丙烯酰胺單體重量濃度在1-30％之間，過硫酸銨重量濃度在0.01-5％之間，丙三醇的重量濃度為10-50％，然后將預(yù)聚合物點(diǎn)樣于固體基板上，點(diǎn)樣完后將點(diǎn)樣基片置于一放置有四甲基乙二胺的密閉盒中，使四甲基乙二胺揮發(fā)，揮發(fā)的四甲基乙二胺與固體基板上預(yù)聚合物陣點(diǎn)接觸并使其發(fā)生聚合反應(yīng)，使各陣點(diǎn)上的核酸通過共聚反應(yīng)在固體基板上得到固定。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明利用一步不受外界影響的聚合反應(yīng)在三維多孔凝膠上獲得更多的核酸固定容量，同時(shí)三維多孔凝膠能夠提供類似于液相的環(huán)境有利于雜交提高雜交效率，使制備的基因芯片具有好的準(zhǔn)確性和高的靈敏性。核酸分子通過一步不容易受外界影響的聚合化學(xué)反應(yīng)形成穩(wěn)定的C-C鍵方式實(shí)現(xiàn)固定，因此具有很高的核酸固定效率及其獲得高穩(wěn)定性的固定核酸，由于所用化學(xué)試劑的質(zhì)量可以通過丙烯酰胺單體的現(xiàn)場(chǎng)聚合得到確認(rèn)，因此重復(fù)性好。另一方面由于四甲基乙二胺是在丙烯酰胺修飾的核酸，丙烯酰胺單體，丙三醇，過硫酸銨和水等混合的預(yù)聚合物點(diǎn)樣于固體基板后通過真空揮發(fā)使預(yù)聚合物陣點(diǎn)聚合的，從而使這種聚合可控，預(yù)聚合物在點(diǎn)樣前不會(huì)發(fā)生聚合反應(yīng)，點(diǎn)樣溶液的核酸濃度和樣品粘度保持不變，因此這種核酸固定方法制備的DNA微陣列具有很好的均勻性和重復(fù)性。


圖1是一種寡聚核苷酸微陣列芯片的雜交熒光圖象。
圖2是一種cDNA微陣列芯片的雜交熒光圖象。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
本實(shí)施例將丙烯酰胺修飾的不同核酸，分別與一定的比例的丙烯酰胺單體，丙三醇，過硫酸銨和水混合成預(yù)聚合物，然后將不同核酸的預(yù)聚合物置于點(diǎn)樣板的不同位置上，通過手工或者點(diǎn)樣儀器將核酸預(yù)聚合物點(diǎn)樣于固體基板的不同位置上(利用位置編碼使固體基板每個(gè)位置上的核酸分子為已知樣(序列))，點(diǎn)樣完后將點(diǎn)樣基片置于一放置有四甲基乙二胺密閉潮濕盒中，在真空作用下四甲基乙二胺揮發(fā)并與固體基板上預(yù)聚合物陣點(diǎn)接觸使其發(fā)生聚合反應(yīng)，使各陣點(diǎn)上的核酸通過共聚反應(yīng)在固體基板上得到固定。(參見圖1)將5’端丙烯酰胺修飾的不同序列的寡聚核苷酸和不含核酸的空白樣品(例如，分別與Cy3顏料標(biāo)記序列Cy3-TGC TGT GAG TGA ACC TGC TGT GTT GA-3′完全正配，中央位置錯(cuò)配1，2，3個(gè)堿基的序列5’-TCA ACA CAG CAG GTT CAC TCA CAG CA-3’(P0)；5’-TCAACA CAG CAG CTT CAC TCA CAG CA-3’(P1)；5’-TCA ACA CAG CAC GAT CAC TCACAG CA-3’(P2)；5’-TCA ACA CAG CAC CAT CAC TCA CAG CA-3’(P3)(下表帶下劃線的字母表示錯(cuò)配堿基)分別與3％的丙烯酰胺單體，30％丙三醇，0.1％過硫酸銨和水混合成1uM探針的預(yù)聚合物，然后將這四種不同核酸的預(yù)聚合物置于點(diǎn)樣板的不同位置上，通過點(diǎn)樣儀將核酸預(yù)聚合物點(diǎn)樣于固體基板的不同位置上(分別表示P0，P1，P2，P3序列和不含核酸的空白樣品P的各10個(gè)寡核酸陣點(diǎn)構(gòu)成寡核酸微陣列)，點(diǎn)樣完后將點(diǎn)樣基片置于一放置有四甲基乙二胺密閉潮濕盒中，在真空作用下四甲基乙二胺揮發(fā)并與固體基板上預(yù)聚合物陣點(diǎn)接觸使其發(fā)生聚合反應(yīng)，使各陣點(diǎn)上的核酸通過共聚反應(yīng)在固體基板上得到固定。固定完成后的DNA微陣列芯片在常溫下與10uM的Cy3-TGC TGT GAG TGA ACC TGC TGT GTTGA-3′序列雜交2小時(shí)，用掃描儀掃描得到微陣列芯片的雜交熒光圖象。在圖1中具有完全匹配序列(P0)具有最強(qiáng)的熒光信號(hào)，錯(cuò)配序列的熒光信號(hào)均比完全匹配序列的低，其錯(cuò)配1，2，3個(gè)堿基的熒光強(qiáng)度分別為完全正配的51.9％，2.48％和0.899％。很明顯信號(hào)強(qiáng)度隨著堿基錯(cuò)配數(shù)目的增加而下降很快，能夠區(qū)分正配和單堿基錯(cuò)配序列。
實(shí)施例2本實(shí)施例將低密度脂蛋白受體基因14417位點(diǎn)丙烯酰胺修飾的不同PCR產(chǎn)物，分別與一定的比例的丙烯酰胺單體，丙三醇，過硫酸銨和水混合成預(yù)聚合物，然后將不同核酸的預(yù)聚合物置于點(diǎn)樣板的不同位置上，通過手工或者點(diǎn)樣儀器將核酸預(yù)聚合物點(diǎn)樣于固體基板的不同位置上，制備成cDNA微陣列芯片。其具體過程為三個(gè)已知14417位點(diǎn)多態(tài)性冠心病病人的新鮮血樣本由在5’端丙烯酰胺修飾的前引物5’-TAC TAT CCT TCC CAG CTC CT和未修飾的反相引物5’-TTTTCA GCA ACT TGG CAT-3’擴(kuò)增。50ulPCR體系中含有50ng基因組DNA，1×PCR緩沖液，3mM MgCl2，250uM dNTPs，20pmol引物of 2U Taq DNA聚合酶。DNA PCR條件為94℃預(yù)變性5分鐘，35個(gè)94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒的循環(huán)，最后72℃延伸7分鐘。擴(kuò)增完成后PCR樣品與3％的丙烯酰胺單體，30％丙三醇，1％過硫酸銨和水混合成大約0.1-0.2uM探針的預(yù)聚合物，然后將這三個(gè)樣本的PCR產(chǎn)物和空白樣四種預(yù)聚合物置于點(diǎn)樣板的不同位置上，通過點(diǎn)樣儀將核酸預(yù)聚合物點(diǎn)樣于固體基板的不同位置上，點(diǎn)樣完后將點(diǎn)樣基片置于一放置有四甲基乙二胺密閉潮濕盒中，在真空作用下四甲基乙二胺揮發(fā)并與固體基板上預(yù)聚合物陣點(diǎn)接觸使其發(fā)生聚合反應(yīng)，使各陣點(diǎn)上的核酸通過共聚反應(yīng)在固體基板上得到固定。固定完成后的cDNA微陣列芯片在常溫下與10uM的標(biāo)記序列5’-Cy3-GGAAAA CAG CCA A-3’，5’-Cy5-GGA AAA GAG CCA A-3’序列雜交2小時(shí)，掃描得到雜交熒光圖象(圖2)。圖中純合子14417C/C給出強(qiáng)的CY3熒光信號(hào)(圖2中4，5行，綠色熒光)。純合子14417G/G給出強(qiáng)的Cy5熒光信號(hào)(圖2中7，8行，紅色熒光)。雜合型14417C/G即給出Cy3的熒光信號(hào)又同時(shí)給出Cy5的熒光信號(hào)，兩種染料疊加后，給出強(qiáng)的黃色熒光信號(hào)(圖2中1，2行)。
實(shí)施例3一種基于凝膠固定核酸的DNA微陣列芯片制備方法，將丙烯酰胺修飾的核酸、丙烯酰胺單體、過硫酸銨、丙三醇和水混合成預(yù)聚合物，其中，核酸的濃度在0.001-100uM之間，丙烯酰胺單體重量濃度在1-30％之間，過硫酸銨重量濃度在0.01-5％之間，丙三醇的重量濃度為10-50％，而核酸的最佳濃度范圍在0.1-10uM之間，丙烯酰胺單體的最佳濃度重量范圍在3-15％之間，過硫酸銨的最佳重量濃度范圍在0.1-1％之間，具體來說，核酸的濃度可選擇0.001、0.1、8、10、50或100uM之間，丙烯酰胺單體重量濃度可選擇1％、3％、15％、10％、24％或30％之間，過硫酸銨重量濃度可選擇0.01％、0.1％、1％、3％、5％之間，丙三醇的重量濃度可選擇10％、15％、32％、42％或50％，然后將預(yù)聚合物點(diǎn)樣于固體基板上，點(diǎn)樣完后將點(diǎn)樣基片置于一放置有四甲基乙二胺的密閉盒中，使四甲基乙二胺揮發(fā)，揮發(fā)的四甲基乙二胺與固體基板上預(yù)聚合物陣點(diǎn)接觸并使其發(fā)生聚合反應(yīng)，使各陣點(diǎn)上的核酸通過共聚反應(yīng)在固體基板上得到固定，所述四甲基乙二胺四甲基乙二胺的揮發(fā)方式可采用自然揮發(fā)、蒸發(fā)或真空揮發(fā)，放置四甲基乙二胺的密閉盒中的濕度為80-100％，固體基板采用玻璃、硅片、凝膠、塑料、橡膠或陶瓷中的一種，上述丙烯酰胺修飾的核酸可采用市售的丙烯酰胺修飾的核酸。
權(quán)利要求
1.一種基于凝膠固定核酸的DNA微陣列芯片制備方法，其特征在于將丙烯酰胺修飾的核酸、丙烯酰胺單體、過硫酸銨、丙三醇和水混合成預(yù)聚合物，其中，核酸的濃度在0.001-100uM之間，丙烯酰胺單體重量濃度在1-30％之間，過硫酸銨重量濃度在0.01-5％之間，丙三醇的重量濃度為10-50％，然后將預(yù)聚合物點(diǎn)樣于固體基板上，點(diǎn)樣完后將點(diǎn)樣基片置于一放置有四甲基乙二胺的密閉盒中，使四甲基乙二胺揮發(fā)，揮發(fā)的四甲基乙二胺與固體基板上預(yù)聚合物陣點(diǎn)接觸并使其發(fā)生聚合反應(yīng)，使各陣點(diǎn)上的核酸通過共聚反應(yīng)在固體基板上得到固定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于凝膠固定核酸的DNA微陣列芯片制備方法，其特征在于核酸的最佳濃度范圍在0.1-10uM之間，丙烯酰胺單體的最佳濃度重量范圍在3-15％之間，過硫酸銨的最佳重量濃度范圍在0.1-1％之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于凝膠固定核酸的DNA微陣列芯片制備方法，其特征在于四甲基乙二胺四甲基乙二胺的揮發(fā)方式可采用自然揮發(fā)、蒸發(fā)或真空揮發(fā)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于凝膠固定核酸的DNA微陣列芯片制備方法，其特征在于放置四甲基乙二胺的密閉盒中的濕度為80-100％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于凝膠固定核酸的DNA微陣列芯片制備方法，其特征在于固體基板采用玻璃、硅片、凝膠、塑料、橡膠或陶瓷中的一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于凝膠固定核酸的DNA微陣列芯片制備方法，將丙烯酰胺修飾的核酸、丙烯酰胺單體、過硫酸銨、丙三醇和水混合成預(yù)聚合物，其中，核酸的濃度在0.001－100uM之間，丙烯酰胺單體重量濃度在1－30％之間，過硫酸銨重量濃度在0.01－5％之間，丙三醇的重量濃度為10－50％，然后將預(yù)聚合物點(diǎn)樣于固體基板上，點(diǎn)樣完后將點(diǎn)樣基片置于一放置有四甲基乙二胺的密閉盒中，使四甲基乙二胺揮發(fā)，揮發(fā)的四甲基乙二胺與固體基板上預(yù)聚合物陣點(diǎn)接觸并使其發(fā)生聚合反應(yīng)，使各陣點(diǎn)上的核酸通過共聚反應(yīng)在固體基板上得到固定。由本發(fā)明制得的DNA微陣列芯片具有很好的均勻性、重復(fù)性和高的準(zhǔn)確性和高的靈敏性，并能提高雜交效率。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1733935SQ20051004059
公開日2006年2月15日 申請(qǐng)日期2005年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月17日
發(fā)明者肖鵬峰, 陸祖宏, 程璐 申請(qǐng)人:東南大學(xué)