專利名稱：產(chǎn)高濃度乳鏈菌肽的乳酸菌及其篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)乳鏈菌肽(Nisin)的乳酸菌、其篩選方法、以及使用乳酸菌的食品或飼料。
背景技術(shù)：
一些乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)——乳酸菌中的一種，通過(guò)發(fā)酵由糖產(chǎn)生乳酸和乳鏈菌肽--一種抗菌肽。它的細(xì)胞和培養(yǎng)液對(duì)微生物具有抑菌和抗菌效果，并且近年來(lái)，特別是其改善食品保存的性能已經(jīng)引起人們的極大興趣。
乳鏈菌肽是一種抗菌肽，其分子量大約為3.5kDa，包含34個(gè)氨基酸并且在一個(gè)分子內(nèi)包含羊毛硫氨酸、β-甲基羊毛硫氨酸、脫水丙氨酸和脫水三丁酸甘油酯。關(guān)于乳鏈菌肽、乳鏈菌肽A、乳鏈菌肽Z和乳鏈菌肽Q，早已報(bào)道將其用作天然氨基酸的替代物。人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)其抗菌譜廣而且抗菌效果不僅表現(xiàn)在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌而且也表現(xiàn)在革蘭氏陰性細(xì)菌上(GillA.O.et al.Adv.Int J Food Microbiol.2003，Vol.80，p 251-9.)。
乳鏈菌肽已經(jīng)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為細(xì)菌素中唯一的公認(rèn)安全物質(zhì)(GRAS)，并且它是一種安全物質(zhì)，已經(jīng)在食品、飼料、藥物制劑等等中被廣泛接受、使用。
就使用生產(chǎn)乳鏈菌肽的乳酸乳球菌和其培養(yǎng)物用作抑菌劑的例子而言，曾提出通過(guò)利用培養(yǎng)液用作食品添加劑(JP-A-5-268975)和通過(guò)與乳酸乳球菌混合而保藏易腐食品或者發(fā)酵食品的方法(JP-A-5-211859)。
就其用作除食品外的用途而言的例子，曾提出用作嗽口水或藥物制劑(JP-A-9-077681)。
有報(bào)道稱，屬于乳酸乳球菌的并作為有高乳鏈菌肽生產(chǎn)能力的乳酸菌，其產(chǎn)生的培養(yǎng)液每毫升有6,750IU的乳鏈菌肽(De Vuyst et al.Blackie Academic and Professional，1994，p151-211)。然而，沒(méi)有披露具體的培養(yǎng)條件。有報(bào)道說(shuō)在乳酸乳球菌UL719的分批培養(yǎng)中，每毫升培養(yǎng)液中生產(chǎn)出4,100IU的乳鏈菌肽(Amiali et al.Adv.World J.Microbiol.Biotecnoly，1998，p 887-894)。
作為篩選具有高乳鏈菌肽生產(chǎn)能力的菌株的方法，有報(bào)道稱使用紅霉素抗性作為指標(biāo)挑選的菌株具有高達(dá)5,000IU/ml乳鏈菌肽的抗性并提供最高10倍于使用乳酸乳球菌Lactococcus lactis N8作為親本菌株的乳鏈菌肽生產(chǎn)能力(Qiao et al.，Adv.Biotechnol.Let.，1997，p 199-202)。據(jù)稱其最高值為2.8×10-5IU/cfu。然而，對(duì)培養(yǎng)液的細(xì)菌數(shù)量未作描述，并且未顯示培養(yǎng)液的乳鏈菌肽生產(chǎn)總量。除了Qiao等的文件，既沒(méi)有關(guān)于篩選具有高乳鏈菌肽生產(chǎn)能力菌株的方法的報(bào)道，也沒(méi)有關(guān)于使用乳鏈菌肽抗性作為指標(biāo)篩選有高乳鏈菌肽生產(chǎn)能力菌株的方法的報(bào)道。
從低乳鏈菌肽生產(chǎn)能力的乳酸菌培養(yǎng)液中獲得高濃度乳鏈菌肽的方法要采用膜濃縮，或者通過(guò)連續(xù)培養(yǎng)將乳鏈菌肽積聚在培養(yǎng)基中(JP-A-2002-85083公報(bào))等等。然而、連續(xù)培養(yǎng)要求復(fù)雜昂貴的裝置，并且在濃縮法中乳鏈菌肽活性下降。因此，這些方法并不總是經(jīng)濟(jì)而有效的方法。
還有報(bào)道稱，生產(chǎn)乳鏈菌肽的乳酸菌培養(yǎng)物對(duì)微生物的抑菌力高于乳酸菌的抑菌力(美國(guó)專利公報(bào)No.5,965,178)。實(shí)際上，在制造日本豆醬方法中(JP-A-2001-224359公報(bào))或者在制造熟豆方法中(JP-A-2003-116477公報(bào))聯(lián)合使用乳酸菌和乳鏈菌肽溶液增加了抑菌效果。
同時(shí)，在通過(guò)前述濃縮或連續(xù)培養(yǎng)制備高濃度乳鏈菌肽溶液的方法中，存在著細(xì)菌被除去的問(wèn)題。因此，這就要求包含高濃度乳鏈菌肽和乳酸菌的培養(yǎng)液通過(guò)簡(jiǎn)單方法比如分批培養(yǎng)來(lái)制備。最后，開(kāi)發(fā)一種培養(yǎng)并篩選生產(chǎn)高濃度乳鏈菌肽的乳酸菌的方法，并且開(kāi)發(fā)有高乳鏈菌肽生產(chǎn)能力的乳酸菌是可取的。當(dāng)開(kāi)發(fā)有高乳鏈菌肽生產(chǎn)能力的乳酸菌時(shí)，其培養(yǎng)物用于食品、飲料和飼料，這使得有效地改善這些食品、飲料和飼料的保藏特性成為可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，提供通過(guò)即使是簡(jiǎn)單的分批培養(yǎng)就能夠在培養(yǎng)液中生產(chǎn)高濃度乳鏈菌肽的乳酸菌和其培養(yǎng)液，并且提供有高乳鏈菌肽生產(chǎn)能力的乳酸菌的簡(jiǎn)易篩選方法。
為解決該問(wèn)題，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，即使是在分批培養(yǎng)中，通過(guò)對(duì)用乳酸菌所產(chǎn)細(xì)菌素培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行篩選，特別是在一種包含有乳酸菌所產(chǎn)細(xì)菌素的合成培養(yǎng)基中使用腸道菌素抗性或乳鏈菌肽抗性作為指標(biāo)進(jìn)行篩選，能夠獲得比迄今為止已經(jīng)報(bào)道的乳酸菌有更高乳鏈菌肽生產(chǎn)能力的乳酸菌。即，本發(fā)明內(nèi)容如下所述。
(1)乳酸菌，在使用液體培養(yǎng)基進(jìn)行分批培養(yǎng)時(shí)，其在每毫升培養(yǎng)基上的清液中能產(chǎn)生6,800IU或更多的乳鏈菌肽。
(2)在(1)中所述的乳酸菌，其在每毫升培養(yǎng)基的上清液中產(chǎn)生8,100IU或更多的乳鏈菌肽。
(3)在(1)中所述的乳酸菌、其在每毫升培養(yǎng)基的上清液中產(chǎn)生10,125IU或更多的乳鏈菌肽。
(4)在(1)中所述的乳酸菌，其中液體培養(yǎng)基包含0.5％的酵母抽提物、0.5％的氯化鈉、3％的葡萄糖和1.5％的碳酸鈣。
(5)在(1)中所述的乳酸菌，其中生產(chǎn)出的乳鏈菌肽是乳鏈菌肽A或乳鏈菌肽Z。
(6)在(1)中所述的乳酸菌屬于乳球菌屬。
(7)在(6)中所述的乳酸菌為乳酸乳球菌Lactococcus lactis AJ110212(FERM BP-8552)。
(8)一種產(chǎn)乳鏈菌肽的乳酸菌的篩選方法，包括篩選在含有乳酸菌所產(chǎn)細(xì)菌素的合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)菌。
(9)如在(8)中所述的產(chǎn)乳鏈菌肽的乳酸菌篩選方法，其中細(xì)菌素是腸道菌素或乳鏈菌肽。
(10)如在(8)中所述的產(chǎn)乳鏈菌肽的乳酸菌的篩選方法，其中細(xì)菌素是每毫升培養(yǎng)基中有11,000～90,000IU的乳鏈菌肽。
(11)如在(8)中所述的產(chǎn)乳鏈菌肽的乳酸菌的篩選方法，其中細(xì)菌素是每毫升培養(yǎng)基中有20,000～80,000IU的乳鏈菌肽。
(12)一種含有通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如(1)到(7)中所述的乳酸菌而獲得的乳酸菌的培養(yǎng)液，一種含有該乳酸菌的培養(yǎng)液干產(chǎn)品，一種乳酸菌被除去的培養(yǎng)液的上清液，或者該培養(yǎng)液的上清液的干產(chǎn)品。
(13)一種含有(12)中所述的乳酸菌的培養(yǎng)液，一種含有乳酸菌的培養(yǎng)液的干產(chǎn)品，一種除去乳酸菌的培養(yǎng)液的上清液，或者保藏特性得以改善的、含有該培養(yǎng)液的上清液的干產(chǎn)品的食品、飲料或飼料。
本發(fā)明的乳酸菌是對(duì)乳酸菌所產(chǎn)細(xì)菌素具有抗性的菌株，在含有0.5％酵母抽提物、0.5％氯化鈉、3％葡萄糖和1.5％碳酸鈣的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行分批培養(yǎng)時(shí)，該菌株在每毫升培養(yǎng)基的上清液中產(chǎn)生6,800IU或更多的乳鏈菌肽。
一種獲得乳酸菌培養(yǎng)物的方法如下所述。
使用的液體培養(yǎng)基基本上要求能夠培養(yǎng)產(chǎn)乳鏈菌肽的乳酸菌，它通常是一種由碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等的水溶液制成的合成培養(yǎng)基。該合成培養(yǎng)基包含至少一種單糖比如葡萄糖和半乳糖、乳糖和蔗糖作為碳源，以及至少一種蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、蛋白胨、酵母抽提物、魚肉提取物、酪蛋白氨基酸、麥芽汁等等作為氮源。氯化鈉、碳酸鈣等作為無(wú)機(jī)鹽。優(yōu)選包含0.5％酵母抽提物、0.5％氯化鈉、3％葡萄糖和1.5％碳酸鈣的液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至pH 6.0～7.0，使用時(shí)滅菌然后冷卻。對(duì)產(chǎn)生乳鏈菌肽來(lái)說(shuō)，在培養(yǎng)期間將培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)至6.0～7.0很重要，并且添加碳酸鈣用于調(diào)節(jié)pH。
將生產(chǎn)乳鏈菌肽的乳酸菌接種在濃度為105～109細(xì)胞/ml的培養(yǎng)基中，在25℃～35℃下、優(yōu)選在27.5℃～32.5℃下，以0(允許靜置)到150rpm的低速攪拌，同時(shí)將pH調(diào)節(jié)至5.0～6.5、優(yōu)選5.5下進(jìn)行培養(yǎng)。生產(chǎn)乳鏈菌肽的乳酸菌屬于乳酸乳球菌Lactococcus lactis ssp.lactis，其例子包括JCM 7638、ATCC 11454、NCDO 497、IFO 12007等。
培養(yǎng)液的乳鏈菌肽活性采用Ishizaki等的方法測(cè)量(Adv.J.Fac.Agr.，Kyushu Univ.，40，p73-85)。即，得到的培養(yǎng)液通過(guò)HPLC(高效液相層析法)測(cè)量。乳鏈菌肽藥物制劑(Sigma公司)用作標(biāo)準(zhǔn)樣。此時(shí)，乳鏈菌肽的活性值是國(guó)際單位規(guī)定的40IU/μg。
當(dāng)制備用于測(cè)量乳鏈菌肽活性的樣品時(shí)，將吐溫-20添加到樣品培養(yǎng)液中使其終濃度變成0.1％，并充分混合?；旌衔镫x心或通過(guò)0.22μm的過(guò)濾器處理以除去乳酸菌。
獲得生產(chǎn)高濃度乳鏈菌肽的乳酸菌的方法描述如下。該方法中，使用突變菌株。首先，在能夠用于培養(yǎng)乳酸菌的合成液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌體。接著，一部分乳酸菌培養(yǎng)液接種于一種含有細(xì)菌素的液體培養(yǎng)基中，所述細(xì)菌素比如是植物乳桿菌素(plantaricin S)、赫烏替素(herveticin J)、片球菌素(pediocin PA-1)或腸道菌素，優(yōu)選接種于包含產(chǎn)乳酸菌的細(xì)菌素的液體培養(yǎng)基中，所述細(xì)菌素比如是植物乳桿菌素S、赫烏替素J、片球菌素PA-1或腸道菌素，更優(yōu)選接種于包含乳酸菌素(lactibiotics)(乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素的一個(gè)分類)比如乳鏈球菌素(lacticin)481、乳桿菌素(lactocin)S、和乳鏈菌肽或II-型細(xì)菌素類(乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素的一個(gè)分類)比如片球菌素PA-1和腸道菌素的液體培養(yǎng)基中，進(jìn)一步優(yōu)選接種于包含屬于乳酸菌素的乳鏈菌肽或?qū)儆贗I-型細(xì)菌素類的腸道菌素的液體培養(yǎng)基中，尤其優(yōu)選接種于乳鏈菌肽數(shù)量大于親本菌株產(chǎn)生的乳鏈菌肽數(shù)量的液體培養(yǎng)基中，于30℃下培養(yǎng)，接著通過(guò)自發(fā)突變誘導(dǎo)或者使用突變誘導(dǎo)物、紫外線等對(duì)乳酸菌進(jìn)行誘導(dǎo)。突變誘導(dǎo)物的例子包括N-甲基-N’-硝基-N-硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS)、4-二甲基氨基苯重氮磺酸鈉(DAPA)等。
將突變誘導(dǎo)的菌株涂到包含細(xì)菌素比如乳鏈菌肽的合成瓊脂培養(yǎng)基上。此時(shí)，合成瓊脂培養(yǎng)基的乳鏈菌肽濃度是11,000～90,000IU/ml，優(yōu)選20,000～80,000IU/ml。而除乳鏈菌肽之外的細(xì)菌素，涂以乳酸菌素或II-型細(xì)菌素類。細(xì)菌素的數(shù)量是一個(gè)可以抑制其中親本菌株生長(zhǎng)的數(shù)量，并且優(yōu)選2～200倍，更優(yōu)選5～200倍。例如，對(duì)于腸道菌素，雖然其數(shù)量隨親本菌株而變，但根據(jù)Fujita等報(bào)道的結(jié)果(在2004 Nihon Nyusankin Gakkai上宣布的“Enterococcus faecium TUA 1344L產(chǎn)生的細(xì)菌素”)，它通常可以是0.5μg/ml或以上、1～100μg/ml、2.5～100μg/ml，以及從10～100μg/ml。涂在培養(yǎng)基上的乳酸菌的數(shù)量?jī)?yōu)選使得為形成的菌落彼此不接觸。具體地講，菌落數(shù)目?jī)?yōu)選每平板100～300個(gè)。為有效地篩選提高乳鏈菌肽生產(chǎn)能力的突變株，從生長(zhǎng)在培養(yǎng)基上的菌株中選出比親本菌株生長(zhǎng)更好的菌株。從視覺(jué)上觀察生長(zhǎng)情況。
按照前述用于獲得乳酸菌培養(yǎng)液的方法培養(yǎng)篩選的菌株。使用培養(yǎng)液進(jìn)行小平板分析，并且篩選出對(duì)指標(biāo)細(xì)菌的抗菌活性高于親本的菌株。小平板分析描述如下。將通過(guò)逐步稀釋乳酸菌培養(yǎng)液上清而獲得的溶液、和作為一個(gè)指標(biāo)的對(duì)乳鏈菌肽敏感的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌培養(yǎng)液，添加到小平板的每個(gè)孔，以使細(xì)胞數(shù)量為102～105細(xì)胞/ml，并且將它們混合。這里使用的指標(biāo)細(xì)菌包括Bacillus subtilis JCM1456T，Lactobacillus sakei JCM1157T等。接著，這些小平板在37℃下保溫4～24小時(shí)，優(yōu)選12～21小時(shí)，以指標(biāo)細(xì)菌的生長(zhǎng)程度測(cè)量抗菌活性，即培養(yǎng)液中的乳鏈菌肽活性。生長(zhǎng)程度用孔的混濁程度估計(jì)(Abs＝595nm)。當(dāng)培養(yǎng)液中乳鏈菌肽活性在高到抑制指標(biāo)細(xì)菌的生長(zhǎng)時(shí)，孔的混濁度不再增加。隨著孔混濁度的增加，比較親本菌株和突變株在培養(yǎng)液的上清最大稀釋比例，通過(guò)估計(jì)菌株生產(chǎn)的乳鏈菌肽數(shù)量可能比親本菌株所提供的數(shù)量更大來(lái)篩選稀釋比例比親本菌株高的菌株。
最后，培養(yǎng)上述篩選的菌株，使用HPLC測(cè)量培養(yǎng)液中的乳鏈菌肽數(shù)量，以證實(shí)培養(yǎng)液中乳鏈菌肽活性，即乳酸菌的乳鏈菌肽生產(chǎn)能力提高了。
通過(guò)前述方法，可以有效地獲得即使采用分批培養(yǎng)也能在培養(yǎng)液中產(chǎn)生高濃度乳鏈菌肽的乳酸菌。在過(guò)去的報(bào)導(dǎo)中，乳鏈菌肽的最大生產(chǎn)量是6,750IU/ml(De Vuyst et.al.)。同時(shí)，具有比已知的最高乳鏈菌肽生產(chǎn)能力更高的乳酸菌，即具有在每毫升的上清液中產(chǎn)生6,800IU或更多乳鏈菌肽能力的乳酸菌，可以通過(guò)在包含0.54％酵母抽提物、0.5％氯化鈉、3％葡萄糖和1.5％碳酸鈣并維持pH的液體培養(yǎng)基中于優(yōu)化條件下培養(yǎng)而獲得。具體地講，有可能獲得在每毫升的上清液中產(chǎn)生乳鏈菌肽至少為7,425IU/ml的乳酸菌，其乳鏈菌肽生產(chǎn)能力是已知乳鏈菌肽生產(chǎn)能力最高的乳酸菌的1.1倍，在每毫升的上清液中產(chǎn)生乳鏈菌肽至少為8,100IU/ml的乳酸菌，其乳鏈菌肽生產(chǎn)能力是已知乳鏈菌肽生產(chǎn)能力最高的乳酸菌的1.2倍，在每毫升的上清液中產(chǎn)生至少10,125IU/ml乳鏈菌肽的乳酸菌，其乳鏈菌肽生產(chǎn)能力是已知乳鏈菌肽生產(chǎn)能力最高的乳酸菌的1.5倍，在每毫升的上清液中產(chǎn)生至少12,150IU/ml乳鏈菌肽的乳酸菌，其乳鏈菌肽生產(chǎn)能力是已知乳鏈菌肽生產(chǎn)能力最高的乳酸菌的1.8倍。據(jù)此認(rèn)為，通過(guò)在更適當(dāng)?shù)募尤虢z氨酸和半胱氨酸或其類似物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)有乳鏈菌肽生產(chǎn)能力的乳酸菌，可以獲得每毫升的上清液中最高數(shù)量為20,000IU的乳鏈菌肽。
通過(guò)在易于生長(zhǎng)乳酸菌的培養(yǎng)基比如YDCS培養(yǎng)基(0.54％酵母抽提物、0.5％氯化鈉、3％葡萄糖、0.67mg/dl絲氨酸、0.67mg/dl半胱氨酸和1.5％碳酸鈣)中進(jìn)行分批培養(yǎng)，能夠有效地生產(chǎn)有高乳鏈菌肽生產(chǎn)能力的乳酸菌和包含乳酸菌的培養(yǎng)液。例如，包含乳酸菌的培養(yǎng)液通過(guò)噴霧干燥或鼓式干燥，可以形成包含乳酸菌的培養(yǎng)液的干產(chǎn)品。通過(guò)例如對(duì)包含乳酸菌的培養(yǎng)液進(jìn)行過(guò)濾處理或傾析而形成乳酸菌從培養(yǎng)液被除去的培養(yǎng)液上清液，以及可以通過(guò)例如對(duì)培養(yǎng)液的上清液進(jìn)行的噴霧干燥或鼓式干燥以形成培養(yǎng)液上清液的干產(chǎn)品。將通過(guò)前述方法獲得的培養(yǎng)物以0.01～10％的量添加到食品、飲料或飼料中能夠提高保藏特性。此時(shí)，培養(yǎng)物可以是培養(yǎng)液本身、經(jīng)消毒的培養(yǎng)液、除去細(xì)菌的培養(yǎng)液、或者其濃縮物或干產(chǎn)品。食品和飲料的例子包括果汁、乳制品、肉制品、提取的產(chǎn)品、發(fā)酵食品調(diào)味品比如日本豆醬和醬油，等等。飼料例子包括青貯飼料等等。例如，在日本豆醬或醬油中米曲的生產(chǎn)步驟期間，通過(guò)噴灑產(chǎn)乳鏈菌肽乳酸菌和包含高濃度乳鏈菌肽的培養(yǎng)液，可以被比平常更有效地抑制不希望有的微生物比如桿菌屬細(xì)菌的污染。因此，容易形成具有較少微生物污染的感官出色的產(chǎn)品。此外，米曲(日本酒曲)的微生物污染可以通過(guò)在米曲中使用前述培養(yǎng)液而得到抑制。也有可能通過(guò)使米曲經(jīng)受無(wú)鹽分解并將蛋白質(zhì)以很高程度分解的方式制造新的調(diào)味品。
當(dāng)包含乳鏈菌肽的培養(yǎng)液被用作食品抑菌劑時(shí)，據(jù)認(rèn)為培養(yǎng)基成分對(duì)使用的食品有感官上的副作用。然而，含乳鏈菌肽培養(yǎng)液的使用減少了培養(yǎng)液的添加量，從而消除了培養(yǎng)基成分的感官副作用。在乳酪生產(chǎn)中，有個(gè)例子，其中產(chǎn)乳鏈菌肽的乳酸菌作為抑制會(huì)使乳酪呈多孔狀的梭狀芽孢桿菌的生長(zhǎng)的曲引接種。當(dāng)乳酸菌生產(chǎn)大量的乳鏈菌肽時(shí)，其抑菌效果自然地提高，以至于可以更安全地生產(chǎn)沒(méi)有污染的乳酪。
具體實(shí)施例方式
下面參照實(shí)施例對(duì)本發(fā)明加以具體說(shuō)明。當(dāng)然，本發(fā)明的技術(shù)范圍并不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1從自然界分離的產(chǎn)乳鏈菌肽Z的菌株(親本菌株顯示于表3)涂到乳鏈菌肽濃度為1,000、2,000、5,000或10,000IU/ml的M17培養(yǎng)基(Difco公司制造)上，并且在30℃下培養(yǎng)2天。該菌株在乳鏈菌肽濃度為1,000或2,000IU/ml的M17培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而沒(méi)有在乳鏈菌肽濃度為5,000或10,000IU/ml的M17培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。結(jié)果證實(shí)這些菌株對(duì)乳鏈菌肽的最小生長(zhǎng)抑制濃度(MIC)是5,000IU/ml。
從自然界分離的產(chǎn)乳鏈菌肽Z的乳酸菌在M17培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)的乳酸菌用500μg/ml的NTG處理以誘導(dǎo)突變。
突變菌株涂到制備的M17培養(yǎng)基上去，使得乳鏈菌肽濃度變成1,000、2,000、4,000、8,000、10,000、20,000、40,000、80,000、或100,000IU/ml，并且在30℃下保溫大約3天。
在各個(gè)乳鏈菌肽濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)目如表1所示。
表1在含乳鏈菌肽培養(yǎng)基上培養(yǎng)的產(chǎn)乳鏈菌肽Z的乳酸菌細(xì)胞數(shù)

如表1所示，當(dāng)乳鏈菌肽濃度達(dá)到8,000IU/ml或更高時(shí)，能夠在平板生長(zhǎng)的細(xì)胞數(shù)目開(kāi)始下降。因此，據(jù)此認(rèn)為以高濃度生產(chǎn)乳鏈菌肽的乳酸菌可以在包含8,000IU/ml到100,000IU/ml乳鏈菌肽的合成培養(yǎng)基上篩選。這樣，從每個(gè)平板中選出300株菌株，并且通過(guò)小平板分析將那些乳鏈菌肽生產(chǎn)能力優(yōu)于親本的菌株選出。
每個(gè)篩選的乳酸菌菌株培養(yǎng)在不含葡萄糖的硫基乙醇酸鹽培養(yǎng)基(Difco公司制造)上于37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。將其培養(yǎng)液播種在50ml的YD培養(yǎng)基(0.5％酵母抽提物、0.5％氯化鈉、3.0％葡萄糖和1.5％碳酸鈣、pH7.0、Sakaguchi燒瓶)中，以100rpm振蕩以進(jìn)行分批培養(yǎng)。
每個(gè)菌株的乳鏈菌肽產(chǎn)量通過(guò)HPLC測(cè)量。結(jié)果是，以每毫升培養(yǎng)基中產(chǎn)量為6,800IU或更多的乳鏈菌肽生產(chǎn)菌株數(shù)目如表2所示，每個(gè)平板上獲得的突變株的乳鏈菌肽活性如表3所示。
表2產(chǎn)高濃度乳鏈菌肽的菌株數(shù)量

表3獲得的菌株乳鏈菌肽活性

L.lactis JCM7638普通乳鏈菌肽Z菌株L.lactis #404在20,000IU/ml乳鏈菌肽平板上篩選的菌株L.lactis AJ110212在40,000IU/ml乳鏈菌肽平板上篩選的菌株L.lactis #N139在40,000IU/ml乳鏈菌肽平板上篩選的菌株L.lactis #N43在40,000IU/ml乳鏈菌肽平板上篩選的菌株L.lactis #N113在40,000IU/ml乳鏈菌肽平板上篩選的菌株L.lactis #N84在80,000IU/ml乳鏈菌肽平板上篩選的菌株因此發(fā)現(xiàn)，可以從含20,000IU/ml到80,000IU/ml乳鏈菌肽的培養(yǎng)基中有效地篩選出乳鏈菌肽產(chǎn)量為6,800IU/ml或更多的菌株。
在從含40,000IU/ml乳鏈菌肽的平板上篩選的菌株中獲得了乳鏈菌肽生產(chǎn)能力最高的菌株L.lactis AJ110202。研究發(fā)現(xiàn)，L.lactis AJ110212菌株的乳鏈菌肽生產(chǎn)能力是親本菌株的大約3.0倍，并且是普通乳鏈菌肽Z生產(chǎn)菌株L.lactis JCM7638的大約3.4倍。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，其乳鏈菌肽生產(chǎn)能力大約是1.8倍于de Vuyst等曾報(bào)導(dǎo)的6,750IU/ml的最高乳鏈菌肽生產(chǎn)能力。順便講一下，L.lactis AJ110212菌株于2003年11月19日保藏于國(guó)家高級(jí)工業(yè)科學(xué)和技術(shù)研究所國(guó)際專利微生物保藏中心，保藏編號(hào)FERM BP-8552。
實(shí)施例2按如下方法制備含腸道菌素溶液。使用糞腸球菌Enterococcus faecium JCM 5804作為產(chǎn)腸道菌素的細(xì)菌在MRS培養(yǎng)基(Difco公司制造)于37℃下培養(yǎng)22小時(shí)，同時(shí)搖床振蕩。將培養(yǎng)液離心分離，使用過(guò)濾器(ADVANTEC制造的免洗注射器過(guò)濾裝置、Dismic-25cs、纖維素醋酸酯0.45μm)過(guò)濾得到上清液。使用超濾膜初步純化上清液。也就是說(shuō)，通過(guò)離心和超濾(脫鹽)收集上清液部分。該步驟中，濃縮培養(yǎng)液中的腸道菌素以制備包含大約200μg/ml腸道菌素的溶液。濃縮前后抗菌活性通過(guò)使用如實(shí)施例1中的從自然界分離的乳鏈菌肽Z的乳酸菌進(jìn)行的由均勻生長(zhǎng)于固體培養(yǎng)基的菌落方法(spot-on-lawn method)得到了確認(rèn)。
從自然界分離的產(chǎn)乳鏈菌肽Z的乳酸菌(親本菌株顯示于表3中)在M17培養(yǎng)基(Difco公司制造)上預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)的乳酸菌用500μg/ml的NTG處理以誘導(dǎo)突變。
將突變菌株涂到M17培養(yǎng)基或腸道菌素濃度為約20μg/ml的M17培養(yǎng)基上，在30℃下保溫大約1～3天。生長(zhǎng)在含腸道菌素的M17平板上的菌落數(shù)與在不含腸道菌素的M17平板上的菌落數(shù)相比是1/100。因此，從含乳鏈菌肽M17培養(yǎng)基上的結(jié)果看，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為產(chǎn)高濃度乳鏈菌肽的乳酸菌生可以從含這一濃度腸道菌素的M17培養(yǎng)基中挑選出來(lái)。從而篩選出108株菌株，并且通過(guò)小平板分析將乳鏈菌肽生產(chǎn)能力優(yōu)于親本菌株的菌株挑選出來(lái)。
每個(gè)篩選的乳酸菌在不含葡萄糖的硫基乙醇酸鹽的培養(yǎng)基(Difco公司制造)中于37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。將其培養(yǎng)液播種在50ml的YD培養(yǎng)基(0.5％酵母抽提物、0.5％氯化鈉、3.0％葡萄糖和1.5％碳酸鈣、pH7.0、Sakaguchi燒瓶)中，以100rpm振蕩以進(jìn)行分批培養(yǎng)。
每個(gè)菌株的乳鏈菌肽產(chǎn)量通過(guò)HPLC測(cè)量。然后得到了24個(gè)每毫升培養(yǎng)基的產(chǎn)乳鏈菌肽濃度為6,800IU或更多的菌株。
從本方法的在含腸道菌素的平板中篩選的菌株中得到了有最高乳鏈菌肽生產(chǎn)能力的菌株L.lactis AJ110376(乳鏈菌肽活性10,802IU/ml)。研究發(fā)現(xiàn)，L.lactis AJ110212菌株的乳鏈菌肽生產(chǎn)能力是親本菌株的大約2.7倍，是普通乳鏈菌肽Z生產(chǎn)菌株L.lactis JCM7638的大約3.4倍。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，該菌株具有的乳鏈菌肽生產(chǎn)能力大約是1.6倍于De Vuyst等曾報(bào)導(dǎo)的6,750IU/ml的最高乳鏈菌肽生產(chǎn)能力。
對(duì)照例1在實(shí)施例1中描述的L.lactis #N43涂到制備好的紅霉素濃度為0.01～0.2μg/ml的M17培養(yǎng)基上，在30℃下保溫大約1～3天。接著，乳酸菌在不含葡萄糖的硫基乙醇酸鹽培養(yǎng)基(Difco公司制造)中于37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。將其培養(yǎng)液播種在50ml的YD培養(yǎng)基(0.5％酵母抽提物、0.5％氯化鈉、3.0％葡萄糖和1.5％碳酸鈣、pH 7.0、Sakaguchi燒瓶)中，以100rpm振蕩培養(yǎng)。在培養(yǎng)基上清液中每個(gè)菌株生產(chǎn)的乳鏈菌肽數(shù)量通過(guò)HPLC測(cè)量，結(jié)果如表4所示。
表4使用紅霉素抗性作為指標(biāo)的產(chǎn)乳鏈菌肽細(xì)菌的篩選

如表4所示，未能獲得同親本菌株相比乳鏈菌肽生產(chǎn)能力有所提高的菌株，并且未能如Qiao等在文獻(xiàn)中的描述那樣，通過(guò)用紅霉素抗性作為指標(biāo)進(jìn)行篩選而提高乳鏈菌肽生產(chǎn)能力。最后，使用乳鏈菌肽作為指標(biāo)的篩選方法應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是到目前為止比使用紅霉素抗性作為指標(biāo)更為有效的篩選方法。
對(duì)照例2
如實(shí)施例1描述的從自然界分離的產(chǎn)乳鏈菌肽Z的乳酸菌(親本菌株顯示于表3中)在M17培養(yǎng)基(Difco公司制造)上預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)的細(xì)菌用500μg/ml的NTG處理以誘導(dǎo)突變。
突變菌株涂到制備的紅霉素濃度變成0.2μg/ml的M17培養(yǎng)基上，在30℃下保溫大約1～3天。接著，從平板上生長(zhǎng)的乳酸菌中隨機(jī)地挑選出20個(gè)菌株。每個(gè)菌株在不含葡萄糖的硫基乙醇酸鹽培養(yǎng)基(Difco公司制造)上于37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。將其培養(yǎng)液播種在50ml的YD培養(yǎng)基(0.5％酵母抽提物、0.5％氯化鈉、3.0％葡萄糖和1.5％碳酸鈣、pH7.0、Sakaguchi燒瓶)，以100rpm振蕩培養(yǎng)。使用HPLC測(cè)量每個(gè)菌株在培養(yǎng)物上清液中生產(chǎn)的乳鏈菌肽數(shù)量。最終未能獲得一株其乳鏈菌肽活性高于親本的菌株。如此，未獲得乳鏈菌肽生產(chǎn)能力優(yōu)于親本的菌株，并且未能如Qiao等在文獻(xiàn)中的描述那樣，通過(guò)用紅霉素抗性作為指標(biāo)進(jìn)行篩選而提高乳鏈菌肽生產(chǎn)能力。因此，用乳鏈菌肽或者除了乳鏈菌肽之外的細(xì)菌素作為指標(biāo)的篩選方法，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是到目前為止比用紅霉素抗性作為指標(biāo)的篩選方法有效得多。
工業(yè)實(shí)用性使用本發(fā)明的方法可以獲得乳鏈菌肽生產(chǎn)能力高的乳酸菌，并且本發(fā)明的乳酸菌可以生產(chǎn)高濃度的乳鏈菌肽。因此，有高乳鏈菌肽活性的培養(yǎng)液可以通過(guò)簡(jiǎn)單的分批培養(yǎng)制備。該培養(yǎng)液用于多種食品、飲料和飼料，如此能改善食品、飲料和飼料的保存性能。因此，本發(fā)明在食品和飼料工業(yè)領(lǐng)域很有用。
權(quán)利要求
1.一種乳酸菌，其特征在于，在液體培養(yǎng)基中分批培養(yǎng)時(shí)，其在每毫升培養(yǎng)基的上清液中產(chǎn)生6,800IU或更多的乳鏈菌肽。
2.如權(quán)利要求1所述的乳酸菌，其特征在于，其在每毫升培養(yǎng)基的上清液中產(chǎn)生8,100IU或更多的乳鏈菌肽。
3.如權(quán)利要求1所述的乳酸菌，其特征在于，其在每毫升培養(yǎng)基的上清液中產(chǎn)生10,125IU或更多的乳鏈菌肽。
4.如權(quán)利要求1所述的乳酸菌，其特征在于，所述液體培養(yǎng)基含有0.5％的酵母抽提物、0.5％的氯化鈉、3％的葡萄糖和1.5％的碳酸鈣。
5.如權(quán)利要求1所述的乳酸菌，其特征在于，其生產(chǎn)的乳鏈菌肽是乳鏈菌肽A或乳鏈菌肽Z。
6.如權(quán)利要求1所述的乳酸菌，其特征在于，其屬于乳球菌屬。
7.如權(quán)利要求6所述的乳酸菌，其特征在于，其為乳酸乳球菌AJ110212(FERM BP-8552)。
8.一種產(chǎn)乳鏈菌肽的乳酸菌的篩選方法，包括篩選在含有乳酸菌所產(chǎn)細(xì)菌素的合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)菌。
9.如權(quán)利要求8所述的產(chǎn)乳鏈菌肽的乳酸菌的篩選方法，其特征在于，所述細(xì)菌素是腸道菌素或乳鏈菌肽。
10.如權(quán)利要求8所述的產(chǎn)乳鏈菌肽的乳酸菌的篩選方法，其特征在于，所述細(xì)菌素是數(shù)量為每毫升培養(yǎng)基中11,000～90,000IU的乳鏈菌肽。
11.如權(quán)利要求8所述的產(chǎn)乳鏈菌肽的乳酸菌的篩選方法，其特征在于，所述細(xì)菌素是數(shù)量為每毫升培養(yǎng)基中20,000～80,000IU的乳鏈菌肽。
12.一種含有通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的乳酸菌而得到的含有乳酸菌的培養(yǎng)液，一種含有所述乳酸菌的培養(yǎng)液的干產(chǎn)品，一種乳酸菌被除去的培養(yǎng)液的上清液，或者一種所述培養(yǎng)液的上清液的干產(chǎn)品。
13.一種含有如權(quán)利要求12所述的乳酸菌的培養(yǎng)液，一種含有所述乳酸菌的培養(yǎng)液的干產(chǎn)品，一種乳酸菌被除去的培養(yǎng)液的上清液，或者含有所述培養(yǎng)液的上清液干產(chǎn)品且保藏特性得以改善的食品、飲料或者飼料。
全文摘要
用乳酸菌對(duì)一種乳酸菌所產(chǎn)細(xì)菌素具有的抗性作為指標(biāo)篩選生長(zhǎng)在包含細(xì)菌素的合成培養(yǎng)基中的細(xì)菌，經(jīng)過(guò)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行分批培養(yǎng)后，得到了具有每毫升培養(yǎng)基的上清液中6,800IU或更多乳鏈菌肽的生產(chǎn)能力的乳酸菌。當(dāng)最終的培養(yǎng)物用于食品或飼料時(shí)，可以提高食品或飼料的保藏特性。
文檔編號(hào)A23L3/3463GK1918282SQ200480042019
公開(kāi)日2007年2月21日 申請(qǐng)日期2004年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月23日
發(fā)明者田中尚子, 西內(nèi)博章, 上原章敬, 松本信俊 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社