專利名稱：細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域。它由一般用于生長(zhǎng)細(xì)胞和特別是植物細(xì)胞的液體培養(yǎng)系統(tǒng)組成。此培養(yǎng)系統(tǒng)基于提供波攪拌的原理，所述提供波攪拌對(duì)一次性塑料袋中含有的細(xì)胞培養(yǎng)物提供方便的混合和通氣。此種大規(guī)模、有效和一次性的培養(yǎng)系統(tǒng)可以大大降低生長(zhǎng)成本。
背景技術(shù)：
常規(guī)的培養(yǎng)系統(tǒng)一般由具有用于通氣和混合培養(yǎng)內(nèi)容物的工具(空氣分布器、葉輪)的堅(jiān)硬容器(玻璃或不銹鋼)組成。此類系統(tǒng)是復(fù)雜的，因?yàn)榇笠?guī)模的生產(chǎn)基于不銹鋼容器、原位滅菌，所以通常的設(shè)備和與防腐生物工藝相關(guān)的支持設(shè)施極端昂貴。60％以上的生產(chǎn)成本是由于固定成本發(fā)酵裝置的高資本成本、折舊、利息和資本消耗。由于產(chǎn)量低和每次培養(yǎng)周期后需要清洗和滅菌生物反應(yīng)器，所以運(yùn)行成本也高。
在植物細(xì)胞培養(yǎng)的特定工業(yè)應(yīng)用中，已使用了不同的公知的培養(yǎng)系統(tǒng)諸如攪動(dòng)槽或氣升式反應(yīng)器。盡管對(duì)商業(yè)化植物代謝物做了許多努力，但是很少達(dá)到了商業(yè)成功。一個(gè)原因是雖然可能獲得高于整個(gè)植物中所希望的化合物(迷迭香酸、紫草寧等)的含量(達(dá)干重的20％)，但是生產(chǎn)力低。導(dǎo)致生產(chǎn)力低的主要限制為與細(xì)菌相比，植物細(xì)胞的低生長(zhǎng)率(低于每天0.7，min 20h加倍時(shí)間)。在工業(yè)發(fā)酵罐中分批培養(yǎng)表示在極高成本設(shè)施中用植物細(xì)胞培養(yǎng)每年運(yùn)行不超過10-20次。這表示工業(yè)生產(chǎn)的瓶頸是經(jīng)濟(jì)瓶頸而不是生物瓶頸。
為了克服此類問題和降低生產(chǎn)成本，最近出現(xiàn)了基于使用多種一次性塑料袋代替不銹鋼發(fā)酵罐的新技術(shù)。用預(yù)先滅菌的一次性塑料袋的此類新系統(tǒng)是有前景的，原因是由于塑料是低成本材料，而且它們不需要費(fèi)時(shí)和費(fèi)成本的清洗、滅菌、設(shè)備的驗(yàn)證和維修，所以它們降低了資本投資。由于提供的塑料袋是預(yù)先滅菌的，所以它允許通過不需要長(zhǎng)時(shí)間培訓(xùn)/學(xué)習(xí)過程和/或經(jīng)驗(yàn)的非本領(lǐng)域技術(shù)人員操作，因此在該過程中它具有更大的靈活性。此外，使用非侵入性攪拌工具允許降低機(jī)械復(fù)雜性和污染的可能性。此類系統(tǒng)中的通氣用通常的進(jìn)氣和起泡進(jìn)行通氣/攪拌和大批混合。反應(yīng)器可以由槽中具有氣體噴霧器塑料袋墊圈和有接種和除去培養(yǎng)基樣品能力的磁頭板組成。Osmotec生產(chǎn)的一次性圓錐形塑料袋用于小規(guī)模使用(幾升)，通過進(jìn)氣口用氣泡通氣。美國專利號(hào)6,432,698也描述了培養(yǎng)微生物或細(xì)胞的一次性生物反應(yīng)器，所述一次性生物反應(yīng)器除了在這里用塑料材料制備外，接近氣升式生物反應(yīng)器，包含用于混合和提供氣體氣泡的的空氣起泡器。在此類發(fā)明中，小氣泡對(duì)敏感細(xì)胞可以是有害的，增加了泡沫形成和細(xì)胞與壁的粘附，和/或從培養(yǎng)基中剝奪了一些有用的氣體(例如用于植物細(xì)胞的乙烯)。
為將細(xì)胞損傷降到最小和改善細(xì)胞生長(zhǎng)和生產(chǎn)力，提出了在此類一次性裝置中的不同的無氣泡的通氣/混合系統(tǒng)。例如，另一建議是用機(jī)械系統(tǒng)攪拌或根本不攪拌的可通過氣體的塑料袋在美國專利號(hào)5,057,429中，將氣體可透過的塑料袋旋轉(zhuǎn)或振動(dòng)使氧氣和營養(yǎng)物擴(kuò)散到動(dòng)物細(xì)胞。美國專利號(hào)5,225,346中也描述了靜止的氣體可透過的袋子。至今對(duì)此類培養(yǎng)系統(tǒng)沒有進(jìn)行工業(yè)研發(fā)，一方面是因?yàn)閿U(kuò)大外部攪拌裝置是困難的，另一方面是由于在含有幾升培養(yǎng)基的靜止袋子中向細(xì)胞供應(yīng)的氧氣不充足的問題。在WO 00/66706中，通過圍繞反應(yīng)器框架的振動(dòng)軸振動(dòng)進(jìn)行攪拌。在《demande de brevet d’invention FR-A-2519020》中，也是圍繞允許攪拌的振動(dòng)軸振動(dòng)。此軸可以置于設(shè)備的中央或置于一端。Wave Biotech(SinghV，美國專利號(hào)6,190,913)也研發(fā)了用置于搖動(dòng)機(jī)械裝置上的膨脹袋子系統(tǒng)，所述機(jī)械裝置移動(dòng)袋子使其中含有的液體進(jìn)行波樣運(yùn)動(dòng)。因?yàn)榇朔N機(jī)械攪拌需要復(fù)雜的設(shè)備以達(dá)到大體積的培養(yǎng)，搖動(dòng)機(jī)械裝置限制了槽的大小；實(shí)際上波誘導(dǎo)機(jī)械裝置支持了全部的培養(yǎng)腔。在FR-A-2519020中，培養(yǎng)體積僅僅在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模(2.5升)，在WO 00/66706中限制在200升。在US 6,190,913中，要求保護(hù)從100ml至500L的使用體積。在所有此三個(gè)專利中，整個(gè)培養(yǎng)腔周期性的從一側(cè)向另一側(cè)搖動(dòng)，產(chǎn)生對(duì)每側(cè)的非常高的壓力，這對(duì)大規(guī)模培養(yǎng)是不適合的。
本發(fā)明的目的是通過一次性裝置提供有效和低成本的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，所述一次性培養(yǎng)裝置比已經(jīng)描述的大部分一次性培養(yǎng)系統(tǒng)更易于放大。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及包含柔性培養(yǎng)腔和波誘導(dǎo)機(jī)械裝置的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其中波誘導(dǎo)機(jī)械裝置舉起培養(yǎng)腔長(zhǎng)度的5到50％。
本發(fā)明也涉及此種裝置培養(yǎng)植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞或微生物的用途。
附圖簡(jiǎn)述

圖1為裝置的透視圖。
圖2為裝置的側(cè)視圖。
圖3為通過上下移動(dòng)波誘導(dǎo)機(jī)械裝置的波形成的圖示。
圖4顯示細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、錐形瓶和攪拌槽反應(yīng)器中培養(yǎng)的大豆細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，表示為每升g鮮重。
圖5顯示細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、錐形瓶和攪拌槽反應(yīng)器中培養(yǎng)的大豆細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，表示為每升g干重。
發(fā)明詳述本裝置提供了用于培養(yǎng)活細(xì)胞的簡(jiǎn)單系統(tǒng)。它由兩種組分組成一次性培養(yǎng)腔和波誘導(dǎo)機(jī)械裝置。此波誘導(dǎo)機(jī)械裝置舉起培養(yǎng)腔長(zhǎng)度的5到50％。
便宜的、柔韌的和一次性膨脹塑料袋優(yōu)選組成培養(yǎng)腔。此塑料袋部分填充液體培養(yǎng)基和細(xì)胞，由于波運(yùn)動(dòng)，對(duì)所述液體培養(yǎng)基和細(xì)胞進(jìn)行混合和充氧。這樣，培養(yǎng)基的表面連續(xù)更新，發(fā)生對(duì)細(xì)胞無害的無氣泡通氣。用簡(jiǎn)單的機(jī)械裝置上下運(yùn)動(dòng)塑料袋的至少一端引起誘導(dǎo)波運(yùn)動(dòng)。此波誘導(dǎo)的機(jī)械裝置由用與定時(shí)器連接的發(fā)動(dòng)機(jī)或者活塞周期性升高的小板組成。此種簡(jiǎn)單的波誘導(dǎo)機(jī)械裝置允許容易地放大。
因?yàn)楸景l(fā)明是一次性的和在大規(guī)模上是有效的，所以它是在工業(yè)應(yīng)用中降低生產(chǎn)成本的好的備選系統(tǒng)。此外，因?yàn)椴恍枰駛鹘y(tǒng)不銹鋼設(shè)備中的清洗、維修或驗(yàn)證，所以此種一次性系統(tǒng)允許方法的靈活性和降低了失效時(shí)間。此培養(yǎng)細(xì)胞可以用于植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)或微生物培養(yǎng)，由于波誘導(dǎo)機(jī)械裝置非常簡(jiǎn)單，從小袋到大袋的放大是非常容易的。此方法允許通過分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)允許重頭產(chǎn)生代謝物、生物轉(zhuǎn)化、重組蛋白質(zhì)或繁殖胚胎發(fā)生的植物細(xì)胞系以及對(duì)技術(shù)人員顯然的任意其它用途。
本發(fā)明的基本設(shè)計(jì)在圖1(透視圖)和圖2(側(cè)面圖)中顯示。生物反應(yīng)器由不同部分組成，其包含由諸如，例如沿著邊緣(2)密封的柔韌生物相容塑料布的材料制成的至少一個(gè)培養(yǎng)腔(1)，以產(chǎn)生內(nèi)部。由于本發(fā)明基于提供波的攪拌原理，所以第二個(gè)基本部分是波誘導(dǎo)機(jī)械裝置(7)，所述波誘導(dǎo)機(jī)械裝置可以由例如，在培養(yǎng)腔至少一端以下放置的板或如拉起培養(yǎng)腔一端的系統(tǒng)的任意其它適當(dāng)工具組成。波誘導(dǎo)機(jī)械裝置也可以由在培養(yǎng)腔的中央部分或任意其它部分上下運(yùn)動(dòng)的板組成。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，培養(yǎng)腔由具有可密封和可高壓滅菌性質(zhì)的柔韌聚丙烯制成的袋子，因此它可以用小實(shí)驗(yàn)室高壓滅菌器或通過本領(lǐng)域公知的其它方法滅菌。然而其它類型的塑料材料諸如聚乙烯也是合適的，可以使用其它類型的滅菌技術(shù)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，柔韌生物相容的防水材料沿著它們的邊緣(2)例如，用熱脈沖密封器熱密封。然而根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法，也可以使用其它的密封技術(shù)，包括但不限于超聲或無線電波焊接。可以不同的方式例如模注射制備不需要密封的其它類型的塑料。
袋子優(yōu)選枕頭形狀但可以用其它形狀，尺寸可以變化以適合使用者的需要。在本發(fā)明中，形成培養(yǎng)腔的袋子可以具有正方形、長(zhǎng)方形、橢圓形、圓形或梯形表面。然而長(zhǎng)方形優(yōu)選地用于改進(jìn)本發(fā)明的方法和裝置的效率。袋子的特別優(yōu)選的尺寸對(duì)于100升培養(yǎng)物為長(zhǎng)3.20m，寬0.9m或?qū)τ?5升培養(yǎng)物為長(zhǎng)3m和寬0.3m。然而，長(zhǎng)度可達(dá)10m和10m以上，本發(fā)明允許從1升至幾百升，諸如100、300、500、1000L或更多培養(yǎng)基。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，連接到培養(yǎng)腔的上側(cè)的至少兩個(gè)管子可以保證氧氣更新；第一個(gè)(3)提供了進(jìn)氣(根據(jù)培養(yǎng)需要的壓縮空氣或其它氣體)，第二個(gè)(4)排泄廢氣。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，此兩個(gè)管子裝備了過濾器例如，0.22μm過濾器以防止空氣傳播的污染。提供氧氣供應(yīng)和排除通過培養(yǎng)產(chǎn)生的氣體的另一方法是至少在袋子的上表面部分提供氣體通透膜。此膜必須具有氣體通透性和足可保證培養(yǎng)的良好充氧的表面。此膜可以例如密封或焊接在袋子上。此膜必須優(yōu)選不通透液體、水蒸氣和污染物。
此外，在圖1顯示的基本設(shè)計(jì)中，至少兩個(gè)其它管子可以連接在培養(yǎng)腔上。一個(gè)(5)連接在袋子的上部以用懸浮在新鮮無菌培養(yǎng)基中的接種物填充生物反應(yīng)器。另一個(gè)(6)與袋子的下側(cè)連接以收取樣品或收獲培養(yǎng)物。這些管子優(yōu)選(但不限于)由可高壓滅菌的硅酮制備，內(nèi)徑/外徑的比率為8/12mm，但此比率當(dāng)然可以改變以適合操作人員的需要。
培養(yǎng)系統(tǒng)的第二個(gè)基本部分為波誘導(dǎo)機(jī)械裝置(7)。如圖2顯示地，此裝置在由小板制成，其優(yōu)選正好置于培養(yǎng)腔的至少一端，但所述板可以置于培養(yǎng)腔的中間點(diǎn)，或置于所述培養(yǎng)腔的任意其它部分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，板的寬度與培養(yǎng)腔的寬度相等并且板的長(zhǎng)度為培養(yǎng)腔長(zhǎng)度的5到50％，更優(yōu)選8到20％。通過上下運(yùn)動(dòng)1°至90°，優(yōu)選1至45°，最優(yōu)選1°至25°角，小板在液體培養(yǎng)物(9)中誘導(dǎo)波(8)，其提供培養(yǎng)物的混合和充氧。由于袋子是膨脹的，它允許波在培養(yǎng)腔(10)中擴(kuò)散。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基的高度為膨脹的培養(yǎng)腔高度的10至30％。令人驚奇地是當(dāng)波到達(dá)相反端(11)時(shí)，它在起始點(diǎn)(12)返回而不受破壞。然后，機(jī)械裝置再次產(chǎn)生脈沖(13)。為改善波地返回，輕微舉起相反端也是可能的。
用機(jī)動(dòng)化臂或用活塞但也可以選擇其它類型裝置可以將波誘導(dǎo)機(jī)械裝置的小板周期性升高。此裝置優(yōu)選與定時(shí)器連接，以選擇波誘導(dǎo)的更合適的頻率。
當(dāng)非常長(zhǎng)的培養(yǎng)腔用于大體積，例如幾百升以上的培養(yǎng)時(shí)，也可以將波誘導(dǎo)機(jī)械裝置置于培養(yǎng)腔的每一端。在此種情況下波誘導(dǎo)機(jī)械裝置交替舉起培養(yǎng)腔長(zhǎng)度的5到50％或更優(yōu)選7到20％。
本發(fā)明基于波誘導(dǎo)提供液體培養(yǎng)物混合和無氣泡通氣的事實(shí)。通過從頂部空間空氣擴(kuò)散到液體培養(yǎng)物進(jìn)行氧轉(zhuǎn)移和提供無剪切力的生長(zhǎng)。
由于培養(yǎng)腔和攪動(dòng)方法簡(jiǎn)單，因此此種培養(yǎng)系統(tǒng)易于操作。由于波誘導(dǎo)機(jī)械裝置不支持整個(gè)培養(yǎng)腔但僅僅需要舉起培養(yǎng)腔的至少一端，因此容易實(shí)現(xiàn)從小體積到幾百升的放大。
優(yōu)選地，培養(yǎng)腔以20至80％，最優(yōu)選20至40％的填充率填充細(xì)胞和培養(yǎng)基。
實(shí)施例以下實(shí)施例為在本發(fā)明范圍內(nèi)一些產(chǎn)品和制備所述產(chǎn)品的方法的示例。不將該實(shí)施例認(rèn)為是以任意方式限制本發(fā)明?？梢詫?duì)本發(fā)明進(jìn)行改變和修改。即，技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到這些實(shí)施例的許多變化以覆蓋寬范圍的配方、成分、加工和混合物以對(duì)多種應(yīng)用合理地調(diào)節(jié)本發(fā)明的化合物的天然存在的水平。
實(shí)施例與大豆細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)的比較本發(fā)明生長(zhǎng)大豆細(xì)胞的能力用分批培養(yǎng)得到證實(shí)。甚至在較大規(guī)模時(shí)，這比得上或好于錐形瓶或攪動(dòng)槽生物反應(yīng)器。
Glycine max(L.)Merr.的組織培養(yǎng)株最初來自用Gamborg等人的培養(yǎng)基(1968)培養(yǎng)的不同品種，所述培養(yǎng)基添加20g.L-1蔗糖、7g.L-1瓊脂(bacto-agar Difco)和1mg.L-12，4-二氯苯氧乙酸。將pH調(diào)整到5.8，然后高壓滅菌(115℃，30分鐘)。將一株(13406，cv.Maple arrow)轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中(與無瓊脂和30g.L-1蔗糖的組織培養(yǎng)物相同的培養(yǎng)基)，在組織培養(yǎng)中心相同的條件下，每?jī)芍茉?50mL錐形瓶(100mL培養(yǎng)基具有3g.L-1鮮重)中傳代培養(yǎng)。將錐形瓶置于100轉(zhuǎn)/分鐘(振動(dòng)直徑20mm)的定軌搖床上。
用與以上談及的相同的培養(yǎng)基和溫度和pH條件，使用具有六個(gè)平葉片葉輪的14L攪動(dòng)槽生物反應(yīng)器(New Brunswick Scientific)。將含有9L新鮮培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器在115℃高壓滅菌40分鐘。將十四日齡大豆細(xì)胞從兩個(gè)1L錐形瓶(500ml培養(yǎng)基)中過濾。將300g鮮重的大豆細(xì)胞放到無菌槽的1L新鮮培養(yǎng)基中，所述無菌槽具有與生物反應(yīng)器無菌連接用于接種的特定輸出裝置。將攪拌器速度調(diào)整到100轉(zhuǎn)/分鐘。用裝備可滅菌氧探針(金)和質(zhì)量流速計(jì)的生物傳感器，通過升高或降低空氣流速將溶解氧維持在30％。
細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(如以前描述地)填充新鮮培養(yǎng)基中的10L大豆細(xì)胞(30g/L鮮重)。將室溫調(diào)節(jié)到25℃，每4秒產(chǎn)生波(通過編程如以上談及的波誘導(dǎo)機(jī)械裝置)。
生長(zhǎng)測(cè)定在特定生長(zhǎng)期從燒瓶、攪動(dòng)槽生物反應(yīng)器和細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)取培養(yǎng)批的樣品并測(cè)定樣品體積。然后通過過濾將細(xì)胞從液體培養(yǎng)物中除去并稱重(鮮重)。將此生物量的等分試樣置于100℃的干燥室24小時(shí)，然后精確稱重(干重)。
此實(shí)施例顯示10L規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)似乎對(duì)細(xì)胞提供了溫和的環(huán)境，比得上燒瓶并且好于攪動(dòng)槽反應(yīng)器。細(xì)胞損傷是有限的，在操作條件下質(zhì)量和氣體轉(zhuǎn)移是有效的。
如以上已經(jīng)談及地，本發(fā)明提供了許多優(yōu)點(diǎn)，所述優(yōu)點(diǎn)又是經(jīng)濟(jì)利益的關(guān)鍵它提供了生長(zhǎng)植物細(xì)胞的溫和環(huán)境容易放大它是一次性的它易于操作
權(quán)利要求
1.細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其包含-柔性培養(yǎng)腔，和-波誘導(dǎo)機(jī)械裝置，其中所述波誘導(dǎo)機(jī)械裝置舉起培養(yǎng)腔長(zhǎng)度的5到50％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其中所述波誘導(dǎo)系統(tǒng)移動(dòng)培養(yǎng)腔下面部分表面面積的8至20％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其中所述波誘導(dǎo)機(jī)械裝置將培養(yǎng)腔的下面部分移動(dòng)1至90°，優(yōu)選1至25°的角度。
4.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)腔包含循環(huán)空氣的裝置，諸如管或空氣可透過的膜。
5.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其中所述波誘導(dǎo)機(jī)械裝置交替舉起培養(yǎng)腔長(zhǎng)度的5到50％。
6.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其中所述培養(yǎng)腔為柔性塑料袋。
7.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其中所述培養(yǎng)腔填充率為10至80％，優(yōu)選20-40％。
8.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的用途，用于培養(yǎng)植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞或微生物。
9.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的用途，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生生物量細(xì)胞、胚胎發(fā)生的植物細(xì)胞、代謝物、次生植物代謝物和/或重組分子。
全文摘要
本發(fā)明提供了生長(zhǎng)細(xì)胞或微生物的新的裝置，其中所述培養(yǎng)腔部分填充液體培養(yǎng)基和細(xì)胞。波誘導(dǎo)機(jī)械裝置舉起培養(yǎng)腔長(zhǎng)度的5到50％。通過誘導(dǎo)從生物反應(yīng)器的一端到另一端的間歇波實(shí)現(xiàn)混合和通氣。由于本發(fā)明的設(shè)計(jì)非常簡(jiǎn)單，因此可以用柔性塑料材料制造它和用此裝置作為一次性系統(tǒng)。此外，此種混合/通氣原理將通常由于剪切力和小氣泡引起的細(xì)胞損傷降到最小。由于波誘導(dǎo)機(jī)械裝置非常簡(jiǎn)單，所以允許容易且有效地從小規(guī)模到較大規(guī)模的放大。此種大規(guī)模、有效且一次性的培養(yǎng)系統(tǒng)可以很大地降低生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12M1/04GK1882681SQ200480033857
公開日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2004年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月18日
發(fā)明者D·庫爾圖瓦, A·R·G·居維葉, N·埃諾 申請(qǐng)人:雀巢技術(shù)公司