專利名稱：分離的發(fā)光蛋白mtClytin及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及發(fā)光蛋白mtClytin，其核苷酸和氨基酸序列以及發(fā)光蛋白mtClytin的活性和用途。
背景技術：
發(fā)光蛋白活生物體產(chǎn)生光的現(xiàn)象被稱作生物發(fā)光。它是細胞中生化反應的結果，所述反應以光量子的形式發(fā)出化學能(化學發(fā)光的方法被稱作冷發(fā)射)。以該方式產(chǎn)生的光是單色的，因為它的發(fā)出與離散電子傳遞相關，其可通過次級發(fā)光染料(例如Aequora屬的發(fā)光水母中的熒光蛋白)易位進入較長波長的光譜區(qū)。
生物發(fā)光具有生物學功能的多樣性在200至1000m(Mesopelagial)之間的海洋中層帶，大約90％的活生物體發(fā)冷光。此時，發(fā)光信號被用于吸引配偶，欺騙和作為誘餌。螢火蟲(Glowworms)以及螢火蟲(fireflies)也使用光信號尋找配偶。另一方面，細菌、真菌和單細胞藻類發(fā)光的意義不明。其被假定用于協(xié)調(diào)大種群中的眾多單獨個體或表示生物鐘的類型。
許多腔腸動物具有生物發(fā)光性(Morin等，1974)。這些生物發(fā)出藍色或綠色光。水母發(fā)光蛋白(源自Aequoria victoria(Shimomura等，1969)且于1962年被鑒別出的首個產(chǎn)生光的蛋白)作為分離的蛋白發(fā)出藍光，而并非如經(jīng)Aequoria victoria表象觀察到的綠光。隨后從該Aequoria victoria中分離出綠色熒光蛋白(GFP)，其(作為被水母發(fā)光蛋白活化的結果)使水母在表型上呈現(xiàn)綠色(Johnson等，1962；Hastings等，1969；Inouye等，1994)。同樣已被鑒定和描述的其它發(fā)光蛋白可以為clytin(Inouye等，1993)、mitrocomin(Fagan等，1993)和obelin(Illarionov等，1995)。
表1某些發(fā)光蛋白概述。表中給出了名稱，已從中分離出該蛋白的生物體，和數(shù)據(jù)庫登錄的識別號(Acc.No.)。

表2某些發(fā)光蛋白概述。表中給出了已從中分離出該蛋白的生物體，發(fā)光蛋白的名稱和專利或申請文選。

生物發(fā)光現(xiàn)被應用于各種各樣的技術方法中，例如作為環(huán)境保護的生物指示劑、在生物化學中用于敏感性檢測蛋白或定量特定化合物，或被稱作“報道分子”而用于研究細胞中的基因調(diào)節(jié)。
發(fā)光蛋白不僅在其核苷酸序列和氨基酸序列還在其生物化學性質(zhì)和物理性質(zhì)上存在差異。
已經(jīng)證明，發(fā)光蛋白的物理性質(zhì)和生物化學性質(zhì)可通過改變這些蛋白的氨基酸序列而進行改變。誘變的發(fā)光蛋白的實例在文獻中已有描述(US 6,495,355；US 5,541,309；US 5,093,240；Shimomura等，1986)。
上述發(fā)光蛋白通過氧化性腔腸素(coelenterazine)產(chǎn)生光(Haddock等，2001；Jones等，1999)。
報道系統(tǒng)一般而言，采用簡單的生物化學方法或組織化學方法即可輕易檢測基因產(chǎn)物的基因被稱作報道基因或指示基因。報道基因至少可分為2個類型。
1.抗性基因。該術語用于這樣的基因，其在細胞上的表達提供了對抗生素或在如果缺乏抗性基因時存在于生長培養(yǎng)基中即導致細胞死亡的其他物質(zhì)的抗性。
2.報道基因。報道基因的產(chǎn)物作為融合指示物或非融合指示物而被用于基因操作中。最常見的報道基因包括β-半乳糖苷酶(Alam等，1990)、堿性磷酸酶(Yang等，1997；Cullen等，1992)，和熒光素酶以及其它發(fā)光蛋白(Shinomura，1985；Phillips GN，1997；Snowdowne等，1984)。
在可見的光譜范圍內(nèi)發(fā)射光子(該發(fā)射通過激發(fā)的發(fā)射體分子的方式產(chǎn)生)被稱作發(fā)光。這種情況與熒光相反，其能量并非由外在較短波長的輻射形式所提供。
化學發(fā)光和生物發(fā)光之間存在差異。當激發(fā)電子返回基態(tài)時，導致激發(fā)分子自身發(fā)冷光的化學反應被稱作化學發(fā)光。如果該反應由酶催化，則該現(xiàn)象被稱作生物發(fā)光。反應中涉及的酶通常被稱作熒光素酶。
物種Clytia gregaria的分類刺胞動物門→薄水母目→鐘螅水母科→Clytia gregaria物種Clytia grenaria屬于刺胞動物門，具體地說是水母(Medusae)。生物發(fā)光表型和熒光表型已于1998年被分別報道(Ward等，1998)。
分離cDNA為了研究物種Clytia gregaria的生物發(fā)光活性，從白海(BiologicalStation Kartesh，Russia)中獲取樣品并貯存于液氮中。為了構建Clytiagregaria的cDNA文庫，使用來自Novagen(USA)的“Straight A”分離法分離poly(a)+RNA。
實施RT-PCR來制備cDNA。為此，根據(jù)以下程序，將1μg RNA與逆轉(zhuǎn)錄酶(Superscript Gold II)一起孵育PCR 1.30 秒 95℃2.6 分鐘68℃3.10 秒 95℃4.6 分鐘68℃步驟3然后步驟4進行17個循環(huán)將反應產(chǎn)物與蛋白酶k孵育，37℃下培養(yǎng)30分鐘，以便使聚合酶失活，然后用乙醇沉淀cDNA。使用Clontech(USA)“SMART cDNA文庫構建試劑盒”依照廠商說明書構建cDNA表達文庫。將cDNA克隆至表達載體pTriplEx2(Clontech；USA)。通過電穿孔法將表達載體轉(zhuǎn)化至細菌E.coli XL1-blue。
將細菌鋪于固體LB營養(yǎng)培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24小時。然后進行影印培養(yǎng)，使用硝化纖維濾紙將細菌轉(zhuǎn)移至另一固體營養(yǎng)培養(yǎng)基平板。影印培養(yǎng)板依次于37℃培養(yǎng)24小時，然后將生長的菌落移至LB液體培養(yǎng)基。加入IPTG(終濃度，0.1mM)后，細菌于振蕩器上37℃培養(yǎng)4小時。經(jīng)離心獲得細菌，然后于0℃，0.5ml的破裂緩沖液(5mM EDTA，20mM Tris-HCL，pH 9.0)中重懸細菌團決。然后通過超聲波處理破裂細菌。
在加入發(fā)光基團(終濃度，10E-07M)后，溶解產(chǎn)物于4℃培養(yǎng)3小時。然后在加入氯化鈣(終濃度，20mM)后用光度計測量生物發(fā)光。
鑒定發(fā)光蛋白。發(fā)光蛋白被命名為mtClytin。以下詳細描述發(fā)光蛋白mtClytin。
MtClytin發(fā)光蛋白mtClytin在氨基酸水平上表現(xiàn)出與源自Clytia gregaria的Clytin最高的同源性，其同一性為87％，而其與源自Obeliageniculata的Obelin的同一性為77％(參見實施例8；圖8)。對于Clytin，87％的同源性出現(xiàn)于蛋白的C末端，其中整個蛋白上分布有多個可識別的氨基酸置換。在核苷酸水平上，同一性小于30％(參見實施例7；圖7)。使用BLAST法進行序列比較(Altschul等，1997)。
發(fā)光蛋白Clytin-2在氨基酸水平上表現(xiàn)出與源自Clytia gregaria的Clytin最高的同源性。然而，該序列在氨基酸序列上存在多處差異，實施例11(圖9)中描述了這些差異。這些差別可導致物理化學，生物化學和生物發(fā)光特性的改變。發(fā)光蛋白Clytin-2不具有信號肽(如發(fā)光蛋白mtClytin具有可導致發(fā)光蛋白轉(zhuǎn)移至線粒體中的信號肽。采用計算機程序MITOPROT(Claros等，1996)鑒別該信號肽(如實施例10所示)。SEQ ID NO3中給出經(jīng)MITOPROT確定的信號肽。發(fā)光蛋白mtClytin是首個已鑒別出用于易位至粒體中的天然信號肽的發(fā)光蛋白。
本發(fā)明還涉及mtClytin的功能等同物。功能等同物是那些具有可比擬理化性質(zhì)并與SEQ ID NO2有至少70％同源性的蛋白。優(yōu)選至少80％或90％同源性。特別優(yōu)選至少95％的同源性。
本發(fā)明還涉及mtClytin信號肽的功能等同物。功能等同物是那些具有可比擬理化性質(zhì)并與SEQ ID NO3有至少70％同源性的蛋白或肽。優(yōu)選至少80％或90％同源性。特別優(yōu)選至少95％的同源性。
發(fā)光蛋白mtClytin適于用作細胞系統(tǒng)(尤其是受體、離子通道、轉(zhuǎn)運載體、轉(zhuǎn)錄因子)或誘導系統(tǒng)的報道基因。
MtClytin信號肽還適于與報道基因融合，以便用作細胞系統(tǒng)(尤其是受體、離子通道、轉(zhuǎn)運載體、轉(zhuǎn)錄因子)或誘導系統(tǒng)的融合報道基因。
發(fā)光蛋白mtClytin還適于用作通過標記，鑒別和特征化細胞器(尤其是線粒體)的報道基因。
mtClytin信號肽還適于與肽或蛋白融合以易位至細胞器(尤其是線粒體)中。
發(fā)光蛋白mtClytin還適于用作測定細胞器(尤其是線粒體)內(nèi)部和外部參數(shù)，尤其是鈣濃度的報道基因。
mtClytin信號肽還適于作為融合肽用作測定細胞器(尤其是線粒體)內(nèi)部和外部參數(shù)，尤其是鈣濃度的報道基因。
發(fā)光蛋白mtClytin還適于用作細菌性和真核生物性系統(tǒng)，尤其是哺乳動物細胞、細菌、酵母、桿狀病毒和植物中的報道基因。
發(fā)光蛋白mtClytin適于用作聯(lián)合生物發(fā)光或化學發(fā)光系統(tǒng)，尤其是使用熒光素酶、氧合酶或磷酸酶系統(tǒng)的細胞系統(tǒng)的報道基因。
mtClytin信號肽還適于作為融合肽用作聯(lián)合生物發(fā)光或化學發(fā)光系統(tǒng)，尤其是使用熒光素酶、氧合酶或磷酸酶系統(tǒng)的細胞系統(tǒng)的報道基因。
發(fā)光蛋白mtClytin適于作為融合蛋白特別用于受體、離子通道、轉(zhuǎn)運載體、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白水解酶、激酶、磷酸二酯酶、水解酶、肽酶、轉(zhuǎn)移酶、膜蛋白和糖蛋白。
mtClytin信號肽還適于作為融合肽作為融合蛋白尤其是用于受體、離子通道、轉(zhuǎn)運載體、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白水解酶、激酶、磷酸二酯酶、水解酶、肽酶、轉(zhuǎn)移酶、膜蛋白和糖蛋白。
發(fā)光蛋白mtClytin適于被，尤其是抗體、生物素、或磁性或可磁化的載體固定。
發(fā)光蛋白mtClytin適于作為蛋白用于能量傳遞系統(tǒng)，尤其是FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)、BRET(生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移)、FET(場效應晶體管)、FP(熒光偏振)和HTRF(均相時間分辨熒光分析)系統(tǒng)。
發(fā)光蛋白mtClytin適于標記底物或配體，尤其是蛋白酶、激酶或轉(zhuǎn)移酶。
發(fā)光蛋白mtClytin適于在細菌系統(tǒng)中(尤其是對于滴度測定)作為生物化學系統(tǒng)，特別對于蛋白水解酶和激酶的底物進行表達。
發(fā)光蛋白mtClytin適于用作，尤其是偶聯(lián)至抗體、偶聯(lián)至酶、偶聯(lián)至受體或偶聯(lián)至離子通道和其他蛋白的標記物。
mtClytin信號肽還適于作為融合肽用作尤其是偶聯(lián)至抗體、偶聯(lián)至酶、偶聯(lián)至受體或偶聯(lián)至離子通道和其他蛋白的標記物。
發(fā)光蛋白mtClytin適于用作尋求藥理學活性化合物，尤其在HTS(高通量篩選)中的報道基因。
mtClytin信號肽還適于用作尋求藥理學活性化合物，尤其在HTS(高通量篩選)中的報道基因。
發(fā)光蛋白mtClytin適于用作檢測系統(tǒng)，尤其是ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)、免疫組織化學、Western印跡法或共聚焦顯微鏡法的組件。
發(fā)光蛋白mtClytin適于用作分析相互作用，尤其是蛋白-蛋白相互作用、DNA-蛋白相互作用、DNA-RNA相互作用、RNA-RNA相互作用或RNA-蛋白相互作用(DNA脫氧核糖核酸；RNA核糖核酸)的標記物。
發(fā)光蛋白mtClytin適于用作在轉(zhuǎn)基因生物，尤其是小鼠、大鼠、倉鼠和其它哺乳動物，靈長類動物、魚、蟲或植物中表達的標記物或融合蛋白。
mtClytin信號肽還適于作為融合肽而用作在轉(zhuǎn)基因生物，尤其在小鼠、大鼠、倉鼠和其他哺乳動物，靈長類動物、魚、蟲或植物中表達的標記物或融合蛋白。
發(fā)光蛋白mtClytin適于用作分析胚胎發(fā)育的標記物或融合蛋白。
發(fā)光蛋白mtClytin適于通過偶聯(lián)介質(zhì)，尤其通過生物素、通過NHS(N-羥基磺基丁二酰亞胺)或通過CN-Br的方式用作標記物。
發(fā)光蛋白mtClytin適于用作與核酸，尤其是DNA或RNA偶聯(lián)的報道分子。
發(fā)光蛋白mtClytin適于用作與蛋白或肽偶聯(lián)的報道分子。
mtClytin信號肽還適于作為融合肽而用作與蛋白或肽偶聯(lián)的報道分子。
發(fā)光蛋白mtClytin適于用作測量細胞內(nèi)或細胞外鈣濃度的報道分子。
發(fā)光蛋白mtClytin適用于特征化細胞系統(tǒng)中信號級聯(lián)反應。
與核酸或肽偶聯(lián)的發(fā)光蛋白mtClytin適于用作探針，尤其是對于Northern印跡、Southern印跡、Western印跡、ELISA、核酸序列測定、蛋白分析或芯片分析。
發(fā)光蛋白mtClytin適用于標記藥理學制劑，尤其是傳染因子、抗體或“小分子”。
發(fā)光蛋白mtClytin適用于地質(zhì)學研究，尤其是對于海洋，地下水和河流。
發(fā)光蛋白mtClytin適于在表達系統(tǒng)中，尤其是在體外翻譯系統(tǒng)、細菌系統(tǒng)、酵母系統(tǒng)、桿狀病毒系統(tǒng)、病毒系統(tǒng)和真核生物系統(tǒng)中表達。
mtClytin信號肽還適于作為融合肽而在表達系統(tǒng)中，尤其是在體外翻譯系統(tǒng)、細菌系統(tǒng)，酵母系統(tǒng)，桿狀病毒系統(tǒng)，病毒系統(tǒng)和真核生物系統(tǒng)中表達。
發(fā)光蛋白mtClytin適于在外科手術方面，尤其是在侵入性、非侵入性和最低限度侵入性介入方面中使組織或細胞可視化。
發(fā)光蛋白mtClytin還適于標記腫瘤組織和其它表型改變的組織，尤其是在組織學研究和外科介入方面。
本發(fā)明還涉及發(fā)光蛋白mtClytin，尤其是以野生型蛋白、融合蛋白和誘變化蛋白的純化。
本發(fā)明還涉及mtClytin信號肽，尤其是以野生型蛋白、融合蛋白和誘變化蛋白的純化。
本發(fā)明還涉及發(fā)光蛋白mtClytin在化妝品領域，尤其是沐浴添加劑、洗劑、肥皂、身體染色劑、牙膏和粉底中的用途。
本發(fā)明還涉及發(fā)光蛋白mtClytin在染色，尤其是食品染色、沐浴添加劑、墨水、紡織品和塑料制品中的用途。
本發(fā)明還涉及發(fā)光蛋白mtClytin在紙染色，尤其是賀卡、紙制品、壁紙和手工藝制品中的用途。
本發(fā)明還涉及發(fā)光蛋白mtClytin在液體染色，尤其是水槍、噴泉、飲料和冰中的用途。
本發(fā)明還涉及發(fā)光蛋白mtClytin在生產(chǎn)玩具，尤其是手指染料和化妝品中的用途。
本發(fā)明涉及編碼SEQ ID NO2所示多肽的核酸分子。
本發(fā)明涉及編碼SEQ ID NO3所示多肽的核酸分子。
本發(fā)明涉及編碼SEQ ID NO6所示多肽的核酸分子。
本發(fā)明涉及具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明涉及具有SEQ ID NO3所示氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明涉及具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明還涉及核酸分子，其選自組成如下的一組a)編碼包含SEQ ID NO2所公開的氨基酸序列的多肽的核酸分子；b)包含SEQ ID NO1所示序列的核酸分子；c)其互補鏈在嚴格條件下與a)或b)中的核酸分子雜交且編碼表現(xiàn)發(fā)光蛋白生物學功能的多肽的核酸分子；
核酸分子的嚴格條件下雜交可在，例如，包含0.2×SSC(1×標準鹽水-枸櫞酸鹽＝150mM NaCl，15mM枸櫞酸鈉)的水溶液中于68℃進行(Sambrook等，1989)。
d)由于遺傳密碼的簡并性而與c)中所述核酸分子不同的核酸分子；e)表現(xiàn)出與SEQ ID NO1至少95％的序列同源性且其蛋白產(chǎn)物表現(xiàn)出發(fā)光蛋白生物學功能的核酸分子；和f)表現(xiàn)出與SEQ ID NO1至少65％的序列同源性且其蛋白產(chǎn)物表現(xiàn)出發(fā)光蛋白生物學功能的核酸分子。
本發(fā)明還涉及表現(xiàn)出與SEQ ID NO1或SEQ ID NO5至少95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％或60％的序列同源性且編碼具有發(fā)光蛋白性質(zhì)的多肽的核酸分子。
本發(fā)明還涉及表現(xiàn)出與SEQ ID NO4至少95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％或60％的序列同源性且編碼具有信號肽或前導肽性質(zhì)的多肽的核酸分子。
本發(fā)明涉及上述的核酸分子，其中序列包含發(fā)光蛋白編碼序列5’端的或前導或信號序列編碼序列5’端的功能啟動子。
本發(fā)明還涉及如上述的核酸分子，其構成重組體DNA或RNA載體。
本發(fā)明涉及包含上述載體的生物體。
本發(fā)明涉及具有大于10個連續(xù)核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸與mtClytin分子或根據(jù)本發(fā)明的其它分子的DNA或RNA序列相同或互補。
本發(fā)明涉及由上述核苷酸序列編碼的發(fā)光蛋白。
本發(fā)明涉及在細菌、真核細胞或體外表達系統(tǒng)中表達根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光蛋白多肽的方法。
本發(fā)明還涉及純化/分離根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光蛋白多肽的方法。
本發(fā)明涉及具有大于5個連續(xù)氨基酸且其被針對根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光蛋白的抗體免疫識別的肽。
本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光蛋白編碼核酸作為標記基因或報道基因，尤其是針對尋找藥理學活性化合物和診斷劑的用途。
本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光蛋白或根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光蛋白編碼核酸作為標記物或報道分子或作為標記基因或報道基因的用途。
本發(fā)明涉及發(fā)光蛋白mtClytin(SEQ ID NO2)，或編碼發(fā)光蛋白mtClytin的核酸作為標記物或報道分子，或作為標記基因或報道基因，尤其是針對尋找藥理學活性化合物和診斷劑的用途。
本發(fā)明涉及SEQ ID NO1所示核酸作為標記基因或報道基因，尤其是針對尋找藥理學活性化合物和診斷劑的用途。
本發(fā)明涉及SEQ ID NO6所示肽和其相應核酸序列SEQ ID NO5作為標記基因或報道基因，尤其是針對尋找藥理學活性化合物和診斷劑的用途。
本發(fā)明還涉及識別根據(jù)本發(fā)明的多肽的多克隆抗體或單克隆抗體。
本發(fā)明還涉及識別發(fā)光蛋白mtClytin(SEQ ID NO2)或發(fā)光蛋白Clytin-2(SEQ ID NO6)的單克隆抗體或多克隆抗體。
本發(fā)明還涉及識別發(fā)光蛋白mtClytin的信號肽(SEQ ID NO3)的單克隆抗體或多克隆抗體。
本發(fā)明還涉及核酸分子，其選自組成如下的一組a)編碼包含SEQ ID NO3所公開的氨基酸序列的多肽的核酸分子；b)包含SEQ ID NO4所示序列的核酸分子；c)其互補鏈在嚴格條件下與a)或b)中的核酸分子雜交且編碼表現(xiàn)信號肽或前導肽的生物學功能的肽的核酸分子；d)由于遺傳密碼的簡并性而與c)中所述核酸分子不同的核酸分子；e)表現(xiàn)出與SEQ ID NO4至少95％的序列同源性且編碼具有信號肽或前導肽的生物學功能的肽的核酸分子；和f)表現(xiàn)出與SEQ ID NO4至少65％的序列同源性且編碼具有信號肽或前導肽的生物學功能的肽的核酸分子。
本發(fā)明還涉及核酸分子，其選自組成如下的一組a)編碼包含SEQ ID NO6所公開的氨基酸序列的多肽的核酸分子；b)包含SEQ ID NO5所公開的序列的核酸分子；c)其互補鏈在嚴格條件下與a)或b)中的核酸分子雜交且編碼表現(xiàn)出發(fā)光蛋白的生物學功能的多肽的核酸分子；d)由于遺傳密碼的簡并性而與c)中所述核酸分子不同的核酸分子；e)表現(xiàn)出與SEQ ID NO5至少95％的序列同源性且編碼具有發(fā)光蛋白的生物學功能的多肽的核酸分子；和f)表現(xiàn)出與SEQ ID NO5至少80％的序列同源性且編碼具有發(fā)光蛋白的生物學功能的多肽的核酸分子。
本發(fā)明還涉及如前面段落所述的核酸，其包含編碼序列5’端的功能啟動子。
本發(fā)明包括包含如上述的核酸的重組體DNA或RNA載體。
本發(fā)明還涉及包含如上述的載體的生物體。
本發(fā)明還涉及具有大于10個連續(xù)核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸與上述核酸分子的組成序列相同或互補。
本發(fā)明還涉及由如上所述的核酸序列編碼的多肽。
本發(fā)明還涉及在細菌、病毒細胞、酵母或真核生物細胞中或在體外表達系統(tǒng)中表達上述多肽的方法。
本發(fā)明還涉及純化/分離根據(jù)本發(fā)明的多肽的方法。
本發(fā)明還涉及具有大于5個連續(xù)氨基酸的肽，所述肽被針對發(fā)光蛋白mtClytin的抗體免疫識別。
本發(fā)明還涉及具有大于5個連續(xù)氨基酸的肽，所述肽被針對發(fā)光蛋白Clytin-2的抗體免疫識別。
本發(fā)明還涉及具有大于5個連續(xù)氨基酸的肽，所述肽被針對SEQID NO3所公開的信號肽或前導肽的抗體免疫識別。
本發(fā)明還涉及具有大于5個連續(xù)氨基酸的肽，所述肽被針對SEQID NO6(Clytin-2)所示發(fā)光蛋白的抗體免疫識別。
本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的核酸作為標記基因或報道基因的用途。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的發(fā)光蛋白作為標記物或報道分子的用途。
本發(fā)明還涉及包含SEQ ID NO4所示序列或與SEQ ID NO4具有60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％，優(yōu)選95％序列同一性的序列的核酸作為信號序列或前導序列的用途。
本發(fā)明還涉及包含SEQ ID NO3所示序列或與SEQ ID NO3具有60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％，優(yōu)選95％序列同一性的序列的肽作為信號肽或前導肽的用途。
本發(fā)明還涉及如以上兩個段落中所述的用途，用于將與信號肽或前導肽融合的蛋白轉(zhuǎn)運至細胞器中。
本發(fā)明還涉及如以上段落中所述的用途，其中細胞器是線粒體。
本發(fā)明還涉及如以上段落中所述的用途，其中細胞器是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)。
本發(fā)明還涉及SEQ ID NO4所示核酸序列作為信號序列或前導序列的用途。
本發(fā)明還涉及SEQ ID NO3所示的肽，其包含所述序列；作為信號肽或前導肽的用途。
本發(fā)明還涉及如以上兩個段落中所述的用途，用于將與信號肽或前導肽融合的蛋白轉(zhuǎn)運至細胞器中。
本發(fā)明還涉及如以上段落中所述的用途，其中細胞器是線粒體。
本發(fā)明還涉及如以上段落中所述的用途，其中細胞器是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的多肽作為報道蛋白在尋找藥物學活性化合物中的用途。
最后，本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的核酸作為報道基因在尋找藥物學活性化合物中的用途。
本發(fā)明發(fā)光蛋白的表達在將基因?qū)脒m宜的宿主細胞后，能使被克隆至表達載體的外源基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的分子生成被稱為表達。表達載體包括在原核生物細胞或真核生物細胞中表達基因所需的控制信號。
一般而言，表達載體可以通過兩種不同的方式構建。在被稱為轉(zhuǎn)錄融合的方式中，由克隆的外源基因所編碼的蛋白被合成為真正的生物學活性蛋白。為此目的，表達載體攜帶所有表達所需的5’和3’控制信號。
在被稱為翻譯融合的方式中，由克隆的外源基因所編碼的蛋白與易于檢測的另一蛋白一起作為雜合蛋白而被表達。表達所需的5’和3’控制信號(包括起始密碼子和，或者，編碼所要形成的雜合蛋白的N端區(qū)域的序列的一部分)是載體的起始點。其它插入的蛋白部分不僅在許多情況下穩(wěn)定由克隆的外源基因所編碼的蛋白使其免于被細胞蛋白酶切斷，其還可被用于檢測和分離產(chǎn)生的雜合蛋白。表達可以瞬時或穩(wěn)定地發(fā)生。適宜的宿主生物體是細菌、酵母、病毒或真核生物系統(tǒng)。
本發(fā)明的發(fā)光蛋白的純化蛋白(在其同樣已被過表達后)的分離通常被稱作蛋白純化。很多已建立的方法和工藝可用于純化蛋白。
固體/液體分離是與蛋白分離相關的基本操作。在下列時候需要該工藝步驟，當從培養(yǎng)基分離細胞時，在破裂細胞和除去細胞碎片后澄清粗提物時，和沉淀后分離沉淀物的時，等等。其通過離心和過濾方式進行實施。
為獲得細胞內(nèi)的蛋白，必須破壞細胞壁或使其具有可透過性。為此目的，根據(jù)規(guī)模和生物體，使用高壓勻漿器或攪拌球磨機或玻璃珠砂磨機。在實驗室規(guī)模上，尤其要使用機械性細胞整合和超聲波處理。
在細胞外蛋白的情況和細胞內(nèi)蛋白的情況下(細胞破碎之后)，使用鹽(尤其是硫酸銨)或有機溶劑(醇、丙酮)的各種沉淀法均為濃縮蛋白的快速且有效的方法。純化細胞內(nèi)蛋白時，需要除去可溶解性核酸(例如，用硫酸鏈霉素或硫酸魚精蛋白沉淀)。分離細胞外蛋白時，通常在加入沉淀劑前加入載體(例如淀粉、硅藻土)以獲得較易處理的沉淀物。
很多層析法和分配法(吸收層析法和離子交換層析法，凝膠過濾法，親和層析法和電泳)可用于高度純化。柱層析也被用于工業(yè)規(guī)模。親和層析(使高達數(shù)百每步驟的純化因子成為可能)對實驗室規(guī)模尤其重要。
細胞外蛋白在相對稀的溶液中獲得。如同細胞外蛋白一樣，它們在進一步使用前必須濃縮。除已提到的方法外，超濾法同樣已被證明在工業(yè)規(guī)模上有價值。
蛋白所伴隨的無機鹽在具體應用時通常是不需要的?？梢酝ㄟ^，特別是通過凝膠過濾，滲析和滲濾將其除去。
很多蛋白以干制劑進行使用。真空干燥、冷凍干燥和噴霧干燥是重要的干燥法。
核苷酸序列和氨基酸序列發(fā)光蛋白mtClytin由以下核苷酸序列(SEQ ID NO1)編碼5｀-gacagataaaaaattcactccttagattatttagtgaataagagaaaaaaaggataagaaatcaagatgcaaaggtttacaaatcgtcttctttccatgtcggctttacgtgcaagatcaagattgcaacgcacggcaaattttcacaccagcatactcttggctacagattcaaaatacgcggtcaaactcgatcctgattttgcaaatccaaaatggatcaacagacacaaatttatgttcaactttttggacataaacggtaaggggaaaatcacattagatgaaatcgtctccaaagcttcagacgacatttgtgctaaactggatgcaacaccagaacagaccaaacgtcaccaggatgctgttgaagcctttttcaagaaaatgggcatggattatggtaaagaagttgcattcccagaatttattaagggatgggaagagttggccgaacacgacttggaactctggtctcaaaacaaaagtacattgatccgtgaatggggagatgctgttttcgacattttcgacaaagacgcaagtggctcaatcagtttagacgaatggaaggcttacggacgaatctctggaatctgtccatcagacgaagacgctgagaagacgttcaaacattgtgatttggacaacagtggcaaacttgatgttgatgagatgaccaggcaacatttaggcttctggtacacattggatccaacttctgatggtctttatggcaattttgttccctaagaagcgttcagttaaaaacgctaaacattgttcagttgtaaaattatattcattttcatttcgtaaaattagtatttataaatttgtatcataaattgtatccatgttgtagactaaataagactcggcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3｀.
其產(chǎn)生以下氨基酸序列(SEQ ID NO2)MQRFTNRLLSMSALRARSRLQRTANFHTSILLATDSKYAVKLDPDFANPKWINRHKFMFNFLDINGKGKITLDEIVSKASDDICAKLDATPEQTKRHQDAVEAFFKKMGMDYGKEVAFPEFIKGWEELAEHDLELWSQNKSTLIREWGDAVFDIFDKDASGSISLDEWKAYGRISGICPSDEDAEKTFKHCDLDNSGKLDVDEMTRQHLGFWYTLDPTSDGLYGNFVP推定的發(fā)光蛋白mtClytin信號肽具有以下序列(SEQ ID NO3)MQRFTNRLLSMSALRA并具有以下核酸序列5｀-atgcaaaggtttacaaatcgtcttctttccatgtcggctttacgtgca-3｀(SEQ ID NO 4)發(fā)光蛋白Clytin-2由以下核酸序列(SEQ ID NO5)編碼
5｀-GATCTCAGCTCAACTTGCAATAAGTATCAGATCAAATTTTGCAACTCAAAGCAAATCATCAACTTCATCATAATGACTGACACTGCTTCAAAATACGCTGTCAAACTCAAGACCAACTTTGAAGATCCAAAATGGGTCAACAGACACAAATTTATGTTCAACTTTTTGGACATTAACGGCAACGGAAAAATCACTTTGGATGAAATTGTCTCCAAAGCTTCGGATGACATTTGCGCCAAACTTGGAGCTACACCAGCTCAAACCCAACGTCATCAGGAAGCTGTTGAAGCTTTCTTCAAGAAGATTGGTTTGGATTATGGCAAAGAAGTCGAATTCCCAGCTTTCGTTAACGGATGGAAAGAACTGGCCAAACATGACTTGAAACTTTGGTCCCAAAACAAGAAATCTTTGATCCGCAATTGGGGAGAAGCTGTATTCGACATTTTCGACAAGGACGGAAGTGGCTCAATCAGTTTGGACGAATGGAAAACATACGGAGGAATCTCTGGAATCTGTCCATCAGACGAAGACGCTGAAAAGACCTTCAAACATTGCGATTTGGACAACAGTGGCAAACTTGATGTTGACGAGATGACCAGACAACATTTGGGATTCTGGTACACCTTGGACCCTAACGCTGATGGTCTTTATGGCAACTTTGTCCCTTAAAAACTTTTTTTGCTGTAAATTCTTTACGGGTTATTTTTTCATAATTGTCATTTGATTTTAACTTTGTTTCGGAAAATGAAAAATATTCTTTATTCAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3｀其產(chǎn)生以下氨基酸序列(SEQ ID NO6)MTDTASKYAVKLKTNFEDPKWVNRHKFMFNFLDINGNGKITLDEIVSKASDDICAKLGATPAQTQRHQEAVEAFFKKIGLDYGKEVEFPAFVNGWKELAKHDLKLWSQNKKSLIRNWGEAVFDIFDKDGSGSISLDEWKTYGGISGICPSDEDAEKTFKHCDLDNSGKLDVDEMTRQHLGFWYTLDPNADGLYGNFVP這些序列再現(xiàn)于序列表中。
附圖簡述

圖1圖1表示載體pTriplEX2-mtClytin的質(zhì)粒圖譜。
圖2圖2表示載體pcDNA3-mtClytin的質(zhì)粒圖譜。
圖3圖3表示mtClytin的細菌表達的結果和細菌表達后mtClytin的生物發(fā)光活性。(Y＝RLU相對光單位；X＝稀釋度；黑色柱＝mtClytin；灰色柱＝對照裂解物)。
圖4圖4表示mtClytin真核生物表達的結果和在CHO細胞中表達后mtClytin的生物發(fā)光活性。(Y＝RLU相對光單位；X＝ATP(以mol/l的對數(shù)表示)。
圖5圖5表示mtClytin生物發(fā)光的動力學分析。(Y＝RLU相對光單位；X＝時間[秒])。
圖6圖6表示Obelin生物發(fā)光的動力學分析。(Y＝RLU相對光單位；X＝時間[秒])。
圖7圖7表示Clytin和mtClytin在氨基酸水平上的比對。
圖8圖8表示Clytin和mtClytin在核酸水平上的比對。
圖9圖9表示Clytin，mtCyltin和Clytin-2在氨基酸水平上的比對。
具體實施例方式
實施例實施例1采用Clontech公司的質(zhì)粒pTriplEx2作為載體用于制備下述的構建體。載體的衍生物被稱為pTriplEx2-mtClytin。載體pTriplEx2-mtClytin被用于在細菌系統(tǒng)中表達mtClytin。
圖1表示載體pTriplEx2-mtClytin的質(zhì)粒圖譜。
實施例2采用Clontech公司的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)作為載體用于制備下述的構建體。載體的衍生物被稱作pcDNA3-mtClytin。載體pcDNA3-mtClytin被用于在真核生物系統(tǒng)中表達mtClytin。
圖2表示載體pcDNA3-mtClytin的質(zhì)粒圖譜。
實施例3細菌性表達通過用表達質(zhì)粒pTriplEx2-mtClytin和pTriplEx2轉(zhuǎn)化細菌在E.coli菌株BL21(DE3)中進行細菌性表達。轉(zhuǎn)化的細菌在LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)3小時，然后通過加入IPTG至終濃度1mM，誘導表達4小時。通過離心分離采集誘導的細菌，在50mM Tris/HCl(pH 9.0)+5mM EDTA中重懸并經(jīng)超聲裂解。隨后，裂解產(chǎn)物以13000rpm(16000ref)離心15分鐘，然后除去上清液。上清液(用Tris/HCl pH 9.0稀釋1∶5，1∶10，1∶20和1∶50)與發(fā)光基團(于Tris/HCl pH 9.0中的10E-07M發(fā)光基團)在黑暗中孵育3小時。在加入5mM氯化鈣后立即用光度計測量生物發(fā)光。測量積分時間(integration time)是40秒。
圖3表示細菌中mtClytin生物發(fā)光的檢測結果。
實施例4
真核生物性表達通過在瞬時實驗中用表達質(zhì)粒pcDNA3-mtClytin和pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染細胞，在CHO細胞中進行構成性真核生物性表達。為此，將10000個細胞/孔(DMEM-F12培養(yǎng)基中)鋪于96孔微量平板上，然后將平板于37℃培養(yǎng)過夜。使用Fugene 6試劑盒(Roche)按照廠商說明書實施轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染的細胞在DMEM-F12培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)過夜。然后除去培養(yǎng)基，并用50μl的發(fā)光基團(PBS中10E-07M發(fā)光基團)代替。細胞于37℃培養(yǎng)3小時，然后加入ATP(三磷酸腺苷)至終濃度1μM。在加入后立即開始用光度計測量?？倻y量時間是60秒，積分時間是1秒。
圖4表示CHO細胞中mtClytin生物發(fā)光的檢測結果。
實施例5BLASTmtClytin在氨基酸水平上的BLAST分析結果＞emb|CAD87655.1|無名蛋白產(chǎn)品[Clytia gregaria]，長度＝198，評分＝368bits(945)，Expect＝e-101，同一性＝171/195(87％)，Positives＝182/195(92％)＞sp|Q08121|CLYT_CLYGR Clytin前體(Phialidin)，pir||S28860clytin-hydromedusa(Clytia gregarium)，emb|CAA49754.1|clytin[Clytia gregaria]，gb|AAA28293.1|apoclytin，長度＝198，評分＝368bits(945)，Expect＝e-101，同一性＝171/195(87％)，Positives＝182/195(92％)＞emb|CAD87658.1|無名蛋白產(chǎn)品[合成構建體]，長度＝198，評分＝367bits(943)，Expect＝e-101，同一性＝170/195(87％)，Positives＝182/195(93％)＞sp|Q27709|OBL_OBELO Obelin前體(OB)，pdb|1EL4|A鏈A，鈣調(diào)節(jié)的發(fā)光蛋白Obelin的結構，由SulfurSas測定，gb|AAA67708.1|無名蛋白產(chǎn)品，長度＝195，評分＝327bits(837)，Expect＝1e-88，同一性＝150/193(77％)，Positives＝170/193(87％)＞emb|CAD87674.1|無名蛋白產(chǎn)品[合成構建體]，長度＝195，評分＝326bits(835)，Expect＝2e-88，同一性＝149/193(77％)，Positives＝170/193(87％)＞emb|CAD87672.1|無名蛋白產(chǎn)品[合成構建體]，長度＝195，評分＝325bits(834)，Expect＝3e-88，同一性＝149/193(77％)，positives＝170/193(87％)＞emb|CAD87673.1|無名蛋白產(chǎn)品[合成構建體]，長度＝195，評分＝325bits(833)，Expect＝4e-88，同一性＝149/193(77％)，Positives＝170/193(87％)＞pdb|1JF0|A鏈A，來自Geniculata的Obelin的晶體結構，在1.82A分辨率，gb|AAL86372.1|AF394688_1apoobelin[Obelia geniculata]，長度＝195，評分＝325bits(833)，Expect＝4e-88，同一性＝149/193(77％)，Positives＝168/193(86％)實施例6BLASTmtClytin在核酸水平上的BLAST分析結果＞emb|AX702125.1|序列23，來自專利WO03006497，長度＝597，評分＝669bits(348)，Expect＝0.0，同一性＝504/582(86％)＞emb|AX702119.1|序列17，來自專利WO03006497，長度＝597；評分＝669bits(348)，Expect＝0.0，同一性＝504/582(86％)＞emb|X70221.1|CGCLYTIN C.gregaria mRNA for clytin，長度＝747，評分＝669bits(348)，Expect＝0.0，同一性＝504/582(86％)＞gb|L13247.1|CYlAPOCLYT Clytia gregarium apoclytin mRNA，completecds，長度＝747，評分＝669bits(348)，Expect＝0.0，同一性＝504/582(86％)＞emb|AX702187.1|序列85，來自專利WO03006497，長度＝597，評分＝664bits(345)，Expect＝0.0，同一性＝503/582(86％)＞emb|AX702185.1|序列83，來自專利WO03006497，長度＝597，評分＝664bits(345)，Expect＝0.0，同一性＝503/582(86％)＞emb|AX702183.1|序列81，來自專利WO03006497，長度＝597，評分＝664bits(345)，Expect＝0.0，同一性＝503/582(86％)＞emb|AX702181.1|序列79，來自專利WO03006497，長度＝597，評分＝664bits(345)，Expect＝0.0，同一性＝503/582(86％)＞emb|AX702179.1|序列77，來自專利WO03006497，長度＝597，評分＝664bits(345)，Expect＝0.0，同一性＝503/582(86％)＞emb|AX702131.1|序列29，來自專利WO03006497，長度＝597，評分＝664bits(345)，Expect＝0.0，同一性＝503/582(86％)＞emb|AX702129.1|序列27，來自專利WO03006497，長度＝597，評分＝664bits(345)，Expect＝0.0，同一性＝503/582(86％)實施例7圖7表示mtClytin與Clytin(Clytia gregaria)在核酸水平上的比對。
實施例8圖8表示mtClytin與Clytin(Clytia gregaria)在氨基酸水平上的比對。
實施例9mtClytin的動力學分析對于mtClytin生物發(fā)光的動力學分析，采用pcDNA3-mtClytin或pcDNA-Obelin或pcDNA3(無任何整合的cDNA)瞬時轉(zhuǎn)染CHO細胞。轉(zhuǎn)染和檢測如實施例4中所述。以1秒的積分時間，讀數(shù)時間為60秒。
圖5和圖6表示mtClytin和Obelin的動力學分析結果。
實施例10MITOPROT分析使用計算機程序MITOPROT分析mtClytin信號肽(Claros等，1996)。分析以下發(fā)光蛋白Obelin(Q27709)、水母發(fā)光蛋白(P07164)、Clytin(Q08121)和mtClytin(SEQ ID NO2)。
分析結果Obelin序列名稱OBELIN輸入序列長度195aa---------------------------------------------------------計算參數(shù)的值query序列的凈電荷 -11分析區(qū)11引導肽中堿性殘基的數(shù)目3引導肽中酸性殘基的數(shù)目0裂解位點 未測到裂解序列 ----------------------------------------------------------所用的疏水尺度GESKD GVH1 ECSH17 -0.624 0.259 -0.308 0.295MesoH -1.573 -0.241 -0.642 0.060MuHd_07514.019 3.641 4.408 1.523MuHd_0957.994 7.898 3.285 1.838MuHd_10013.734 9.836 5.597 2.742MuHd_10521.195 11.755 7.339 4.117Hmax_075-9.450 -2.800 -4.008 1.132Hmax_095-0.963 1.837 -1.971 1.103Hmax_1000.400 1.300 -1.942 2.240Hmax_10510.617 6.067 0.733 3.127---------------------------------------------------------概率輸出到線粒體的0.1479水母發(fā)光蛋白序列名稱AEQUORIN輸入序列長度196aa---------------------------------------------------------計算參數(shù)的值query序列的凈電荷-13分析區(qū) 3引導肽中堿性殘基的數(shù)目 0引導肽中酸性殘基的數(shù)目 0裂解位點 未測到裂解序列 ----------------------------------------------------------所用的疏水尺度GESKDGVH1 ECSH17 0.006 0.794 -0.2630.368MesoH -1.673 -0.382-0.7030.048MuHd_07524.326 4.153 5.947 2.450MuHd_09512.638 7.213 4.218 1.796MuHd_10013.748 8.827 4.477 2.427MuHd_10516.581 11.4265.056 3.453Hmax_0750.438 0.233 -2.4901.692Hmax_0950.525 -1.400-2.3940.674Hmax_100-0.100 -1.200-2.2921.550Hmax_1050.500 -0.000-2.1641.540---------------------------------------------------------概率輸出到線粒體 0.0148Clytin序列名稱CLYTIN輸入序列長度198.aa---------------------------------------------------------計算參數(shù)的值query序列的凈電荷 -9分析區(qū) 32引導肽中堿性殘基的數(shù)目 6引導肽中酸性殘基的數(shù)目 2裂解位點 未測到裂解序列 ----------------------------------------------------------所用的疏水尺度GES KD GVH1 ECSH17 -0.4290.341 -0.313 0.313MesoH -1.778-0.307 -0.718 0.053MuHd_07532.92817.509 7.351 5.708MuHd_09530.87420.344 9.074 5.834MuHd_10036.59622.666 10.051 6.762MuHd_10539.17419.336 10.379 7.609Hmax_0754.900 7.087 -1.223 3.684Hmax_09513.60010.100 1.251 4.390
Hmax_100 14.00012.600 1.601 5.060Hmax_105 6.650 13.067 -0.468 3.920---------------------------------------------------------概率輸出到線粒體 0.2047Clytin-2序列名稱CLYTIN-2輸入序列長度198aa---------------------------------------------------------計算參數(shù)的值query序列的凈電荷-7分析區(qū) 16引導肽中堿性殘基的數(shù)目 3引導肽中酸性殘基的數(shù)目 1裂解位點未測到裂解序列----------------------------------------------------------所用疏水尺度GES KD GVH1 ECSH17 -0.2880.341 -0.2130.313MesoH -1.519-0.206 -0.6810.081MuHd_07532.59415.092 8.192 4.075MuHd_09536.09019.707 8.836 6.716MuHd_10038.61720.269 9.682 6.851MuHd_10530.26716.082 8.229 5.470Hmax_0756.533 6.417 -0.7932.508Hmax_09513.60010.100 1.251 4.390Hmax_10013.60010.100 1.251 4.390Hmax_10513.41710.150 1.612 3.862---------------------------------------------------------概率輸出到線粒體 0.3974mtClytin序列名稱mtClytin輸入序列長度228aa---------------------------------------------------------計算參數(shù)的值query序列的凈電荷 -8分析區(qū) 34
引導肽中堿性殘基的數(shù)目 6引導肽中酸性殘基的數(shù)目 0裂解位點17裂解序列MQRFTNRLLSMSALRA---------------------------------------------------------所用疏水尺度GES KD GVH1 ECSH17 -0.1350.453 -0.343 0.309MesoH -1.623-0.215 -0.701 0.073MuHd_07533.39419.322 8.634 7.593MuHd_09534.72619.634 8.110 8.861MuHd_10032.82516.596 7.376 7.520MuHd_10528.00519.893 7.410 7.865Hmax_07516.68317.733 2.851 5.763Hmax_09513.12513.388 2.299 4.314Hmax_1008.300 11.500 1.845 3.830Hmax_1051.700 9.500 -1.171 2.390---------------------------------------------------------概率輸出到線粒體0.9974被分析的肽易位至線粒體的概率以接近1的計算因數(shù)增加。
Obelin、水母發(fā)光蛋白、Clytin、Clytin-2和mtClytin的蛋白序列的分析表明僅mtClytin具有可以轉(zhuǎn)運至線粒體的蛋白特征。
實施例11圖9顯示mtClytin，Clytin(Clytia gregaria)和Clytin-type2在氨基酸水平上比對。
文獻/專利US 6,495,355US 5,541,309US 5,093,240US-0908909US 6,152,358JP-0176125
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序列表<110>Bayer AG，BHC<120>分離的發(fā)光蛋白mtClytin，及其用途<130>Le A 36 839<1G0>6<170>專利版本3.1<210>1<211>912<212>DNA<213>Clytia gregaria<400>1gacagataaa aaattcactc cttagattat ttagtgaata agagaaaaaa aggataagaa 60atcaagatgc aaaggtttac aaatcgtctt ctttccatgt cggctttacg tgcaagatca120agattgcaac gcacggcaaa ttttcacacc agcatactct tggctacaga ttcaaaatac180gcggtcaaac tcgatcctga ttttgcaaat ccaaaatgga tcaacagaca caaatttatg240ttcaactttt tggacataaa cggtaagggg aaaatcacat tagatgaaat cgtctccaaa300gcttcagacg acatttgtgc taaactggat gcaacaccag aacagaccaa acgtcaccag360gatgctgttg aagocttttt caagaaaatg ggcatggatt atggtaaaga agttgcattc420ccagaattta ttaagggatg ggaagagttg gccgaacacg acttggaact ctggtctcaa480aacaaaagta cattgatccg tgaatgggga gatgctgttt tcgacatttt cgacaaagac540gcaagtggct caatcaGttt agacgaatgg aaggcttacg gacgaatctc tggaatctgt600ccatcagacg aagacgctga gaagacgttc aaacattgtg atttggacaa cagtggcaaa660cttgatgttg atgagatgac caggcaacat ttaggcttct ggtacacatt ggatccaact720tctgatggtc tttatggcaa ttttgttccc taagaagcgt tcagttaaaa acgctaaaca780ttgttcagtt gtaaaattat attcattttc atttcgtaaa attagtattt ataaatttgt840atcataaatt gtatccatgt tgtagactaa ataagactcg gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa900aaaaaaaaaa aa912<210>2<211>228<212>PRT<213>Clytia gregaria
<400>2Met Gln Arg Phe Thr Asn Arg Leu Leu Seu Met Ser Ala Leu Arg Ala1 5 10 15Arg Ser Arg Leu Gln Arg Thr Ala Asn Phe His Thr Ser Ile Leu Leu20 25 30Ala Thr Asp Ser Lys Tyr Ala Val Lys Leu Asp Pro Asp Phe Ala Asn35 40 45Pro Lys Trp Ile Asn Arg His Lys Phe Met Phe Asn Phe Leu Asp Ile50 55 60Asn Gly Lys Gly Lys Ile Thr Leu Asp Glu Ile Val Ser Lys Ala Sar65 70 75 80Asp Asp Ile Cys Ala Lys Lau Asp Ala Thr Pro Glu Gln Thr Lys Arg85 90 95His Gln Asp Als Val Glu Ala Phe Phe Lys Lys Met Gly Met Asp Tyr100 105 110Gly Lys Glu Val Ala Phe Pro Glu Phe Ile Lys Gly Trp Glu Glu Lau115 120 125Ala Glu His Asp Leu Glu Leu Trp Ser Gln Asn Lys Ser Thr Leu Ile130 135 140Arg Glu Trp Gly Asp Ala Val Phe Asp Ile Phe Asp Lys Asp Ala Ser145 150 155 160Gly Ser Ile Ser Leu Asp Glu Trp Lys Ala Tyr Gly Arg Ile Ser Gly165 170 175Ile Cys Pro Ser Asp Glu Asp Ala Glu Lys Thr Phe Lys His Cys Asp180 185 190Leu Asp Asn Ser Gly Lys Leu Asp Val Asp Glu Met Thr Arg Gln His195 200 205Leu Gly Phe Trp Tyr Thr Leu Asp Pro Thr Ser Asp Gly Leu Tyr Gly210 215 220Asn Phe Val Pro225<210>3<211>16<212>PRT<213>Clytia gregaria<400>3Met Gln Arg phe Thr Asn Arg Leu Leu Ser Met Ser Ala Leu Arg Ala1 5 10 15
<210>4<211>48<212>DNA<213>Clytia gregaria<400>4atgcaaaggt ttacaaatcg tcttctttcc atgtcggctt tacgtgca 48<210>5<211>791<212>DNA<213>Clytia gregaria<400>5gatctcagct caacttgcaa taagtabcag atcaaatttt gcaactcaaa gcaaatcatc 60aacttcatca taatgactga cactgcttca aaatacgctg tcaaactcaa gaccaacttt120gaagatccaa aatgggtcaa cagacacaaa tttatgttca actttttgga cattaacggc180aacggaaaaa tcactttgga tgaaattgtc tccaaagctt cggatgacat ttgcgccaaa240cttggagcta caccagatca aacccaacgt catcaggaag ctgttgaagc tttcttcaag300aagattggtt tggattatgg caaagaagtc gaattcccag ctttcgttaa cggatggaaa360gaactggcca aacatgactt gaaactttgg tcccaaaaca agaaatcttt gatccgcaat420tggggagaag ctgtattcga cattttcgac aaggacggaa gtggctcaat cagtttggac480gaatggaaaa catacggagg aatctctgga atctgtccat cagacgaaga cgctgaaaag540accttcaaac attgcgattt ggacaacagt ggcaaacttg atgttgacga gatgaccaga600caacatttgg gattctggta caccttggac cctaacgctg atggtcttta tggcaacttt660gtcccttaaa aacttttttt gctgtaaatt ctttacgggt tattttttca taattgtcat720ttgattttaa ctttgtttcg gaaaatgaaa aatattcttt attcagaaaa aaaaaaaaaa780aaaaaaaaaa a 791<210>6<211>198<212>PRT<21a>Clytia gregaria<400>6Met Thr Asp Thr Ala Ser Lys Tyr Ala val Lys Leu Lys Thr Asn Phe1 5 10 15Glu Asp Pro Lys Trp Val Asn Arg His Lys Phe Met Phe Asn Phe Leu20 25 30Asp Ile Asn Gly Asn Gly Lys Ile Thr Leu Asp Glu Ile Val Ser Lys35 40 45Ala Ser Asp Asp Ile Cys Ala Lys Leu Gly Ala Thr Pro Ala Gla Thr50 55 60Gln Arg His Gln Glu Ala Val Glu Ala Phe Phe Lys Lys Ile Gly Leu65 70 75 80
Asp Tyr Gly Lys Glu Val Glu Phe Pro Ala Phe Val Asn Gly Trp Lys85 90 95Glu Leu Ala Lys His Asp Leu Lys Leu Trp Ser Gln Asn Lys Lys Ser100 105 110Leu Ile Arg Asn Trp Gly Glu Ala Val Phe Asp Ile Phe Asp Lys Asp115 120 125Gly Ser Gly Ser Ile Ser Leu Asp Glu Trp Lys Thr Tyr Gly Gly Ile130 135 140Ser Gly Ile Cys Pro Ser Asp Glu Asp Ala Glu Lys Thr Phe Lys His145 150 155 160Cys Asp Leu Asp Asn Ser Gly Lys Leu Asp Val Asp Glu Met Thr Arg165 170 175Gln His Leu Gly Phe Trp Tyr Thr Leu Asp Pro Asn Ala Asp Gly Leu180 185 190Tyr Gly Asn Phe Val Pro19權利要求
1.核酸分子，其選自組成如下的一組a)編碼包含SEQ ID NO2所公開的氨基酸序列的多肽的核酸分子；b)包含SEQ ID NO1所示序列的核酸分子；c)其互補鏈在嚴格條件下與a)或b)中的核酸分子雜交且編碼表現(xiàn)發(fā)光蛋白的生物學功能的多肽的核酸分子；d)由于遺傳密碼的簡并性而與c)中所述核酸分子不同的核酸分子；e)表現(xiàn)出與SEQ ID NO1至少95％的序列同源性且編碼具有發(fā)光蛋白的生物學功能的多肽的核酸分子；和f)表現(xiàn)出與SEQ ID NO1至少65％的序列同源性且編碼具有發(fā)光蛋白的生物學功能的多肽的核酸分子。
2.核酸分子，其選自組成如下的一組a)編碼包含SEQ ID NO3所公開的氨基酸序列的多肽的核酸分子；b)包含SEQ ID NO4所示序列的核酸分子；c)其互補鏈在嚴格條件下與a)或b)中的核酸分子雜交且編碼表現(xiàn)信號肽或前導肽的生物學功能的肽的核酸分子；d)由于遺傳密碼的簡并性而與c)中所述核酸分子不同的核酸分子；e)表現(xiàn)出與SEQ ID NO4至少90％的序列同源性且編碼表現(xiàn)信號肽或前導肽的生物學功能的肽的核酸分子；和f)表現(xiàn)出與SEQ ID NO4至少60％的序列同源性且編碼表現(xiàn)信號肽或前導肽的生物學功能的肽的核酸分子。
3.核酸分子，其選自組成如下的一組a)編碼包含SEQ ID NO6所公開的氨基酸序列的多肽的核酸分子；b)包含SEQ ID NO5所示序列的核酸分子；c)其互補鏈在嚴格條件下與a)或b)中的核酸分子雜交且編碼表現(xiàn)發(fā)光蛋白的生物學功能的多肽的核酸分子；d)由于遺傳密碼的簡并性而與c)中所述核酸分子不同的核酸分子；e)表現(xiàn)出與SEQ ID NO5至少95％的序列同源性且編碼具有發(fā)光蛋白的生物學功能的多肽的核酸分子；和f)表現(xiàn)出與SEQ ID NO5至少80％的序列同源性且編碼具有發(fā)光蛋白的生物學功能的多肽的核酸分子。
4.一種如權利要求1、2或3所述的核酸，其包含編碼序列5’端的功能啟動子。
5.一種重組體DNA或RNA載體，其包含如權利要求4所述的核酸。
6.一種生物體，其包含如權利要求5中所述的載體。
7.一種具有大于10個連續(xù)核苷酸的寡核苷酸，其與如權利要求1、2或3中所述的核酸分子的構成序列相同或互補。
8.一種多肽，其用如權利要求1、2或3中所述的核酸序列編碼。
9.一種表達如權利要求8中所述多肽的方法，其在細菌、病毒系統(tǒng)、酵母細胞、或真核細胞或體外表達系統(tǒng)中。
10.一種純化/分離如權利要求8中所述發(fā)光蛋白多肽的方法。
11.一種肽，其具有大于5個連續(xù)氨基酸，其被針對抗發(fā)光蛋白mtClytin的抗體免疫識別。
12.一種肽，其具有大于5個連續(xù)氨基酸，其被針對抗發(fā)光蛋白clytin-2的抗體免疫識別。
13.一種肽，具有大于5個連續(xù)氨基酸，其被針對SEQ ID NO3所示信號肽或前導肽的抗體免疫識別。
14.如權利要求1-5所述的核酸作為標記基因或報道基因的用途。
15.如權利要求8所述的發(fā)光蛋白作為標記物或報道分子的用途。
16.包含SEQ ID NO4所示序列的核酸作為信號序列或前導序列的用途。
17.包含SEQ ID NO3所示序列的肽作為信號肽或前導肽的用途。
18.如權利要求16或17所述的用途，用于將與信號肽或前導肽融合的蛋白轉(zhuǎn)運至細胞器中。
19.如權利要求18所述的用途，其中細胞器是線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)。
20.如權利要求8所述的多肽作為報道蛋白在尋找藥理學活性化合物中的用途。
21.如權利要求1-3所述的核酸作為報道基因在尋找藥理學活性化合物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及發(fā)光蛋白mtClytin，其核苷酸和氨基酸序列，以及發(fā)光蛋白mtClytin的活性和用途。
文檔編號C12N15/12GK1882608SQ200480033782
公開日2006年12月20日 申請日期2004年9月3日 優(yōu)先權日2003年9月16日
發(fā)明者S·戈爾茨, S·馬科瓦, L·布拉科瓦, L·弗蘭克, E·維索特斯基 申請人:拜耳醫(yī)藥保健股份公司