專利名稱：包含非抗生素抗性選擇標(biāo)志物的選擇系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的選擇系統(tǒng)，其基于araD基因、araD基因的突變形式、其互補(bǔ)序列或其催化活性片段作為選擇標(biāo)志物的使用，并且涉及araD基因缺陷的細(xì)菌菌株的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含araD基因、araD基因的突變形式、其互補(bǔ)序列或其催化活性片段的新載體，并且涉及araD基因缺陷的新的細(xì)菌菌株。本發(fā)明另外涉及選擇用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的方法，所述質(zhì)粒包含目標(biāo)基因。
背景技術(shù)：
對(duì)于在細(xì)胞培養(yǎng)物中增殖的細(xì)菌和其它細(xì)胞的有效遺傳工程改造的必需要求是選擇具有特定基因型改變的細(xì)胞的能力。在重組DNA技術(shù)中最普遍的選擇策略是在克隆載體或質(zhì)粒中包括選擇標(biāo)志物。選擇標(biāo)志物可以是克隆的基因或DNA序列，其允許包含選擇標(biāo)志物的宿主細(xì)胞從不包含它的細(xì)胞中分離出來(lái)。選擇標(biāo)志物與合適的選擇培養(yǎng)基一起將克隆載體保持在細(xì)胞中。另外，由于質(zhì)粒的復(fù)制對(duì)于細(xì)菌宿主來(lái)說(shuō)是一種能量負(fù)擔(dān)，在細(xì)菌的生長(zhǎng)培養(yǎng)物中，已經(jīng)丟失了質(zhì)粒的細(xì)菌將比具有質(zhì)粒的細(xì)胞具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。
對(duì)于大多數(shù)目的來(lái)說(shuō)，抗生素抗性基因是一種常用的選擇標(biāo)志物。不過(guò)，對(duì)于重組治療劑的生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，其中目標(biāo)是以高產(chǎn)量產(chǎn)生一種產(chǎn)物，諸如DNA疫苗用于患者中的施用，使用抗生素抗性基因出現(xiàn)問(wèn)題抗生素抗性病原體的蔓延是嚴(yán)重的世界范圍問(wèn)題[Levy，S.B.，J.Antimicrob.Chemother.49(2002)25-30]。所以抗生素抗性基因不能在藥物工業(yè)中具有廣泛的用途，并且例如，按照美國(guó)食品與藥物管理局的規(guī)定，在進(jìn)入三期的實(shí)驗(yàn)性DNA疫苗中不允許抗生素抗性基因。
備選地，無(wú)抗生素的選擇系統(tǒng)已經(jīng)得到建議。這些無(wú)抗生素的選擇系統(tǒng)包括細(xì)菌毒素-抗毒素系統(tǒng)[Engelberg-Kulka，H.和Glaser，G.，Annu RevMicrobiol 53(1999)43-70]，負(fù)責(zé)對(duì)抗重金屬，諸如碲的基因[Silver，S.和Phung，L.T.，Annu Rev Microbiol 50(1996)753-789]，和其中質(zhì)粒編碼補(bǔ)足宿主營(yíng)養(yǎng)缺陷型的基因的系統(tǒng)[Wang，M.D.等，J.Bacteriol.169(1987)5610-5614]。
美國(guó)專利申請(qǐng)2000/0014476 A1一般性地公開(kāi)了，特別是，非抗生素選擇標(biāo)志物的使用，所述標(biāo)志物可以是一種基因，其產(chǎn)物在某些培養(yǎng)條件下對(duì)于細(xì)胞的代謝是必需的，如異化作用基因，它使得細(xì)胞同化存在于培養(yǎng)基中的某些物質(zhì)(特定的碳或氮源)等成為可能。沒(méi)有給出這些合適基因的具體實(shí)例。這種方法并不一定可以用于商業(yè)生產(chǎn)，因?yàn)閺纳L(zhǎng)培養(yǎng)基中缺失一種必需組分，諸如氨基酸或碳源減少了產(chǎn)量，這是不希望的。另外，就刪掉一種必需養(yǎng)分來(lái)說(shuō)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的處理可能會(huì)相當(dāng)?shù)靥岣呱L(zhǎng)培養(yǎng)基的成本，因?yàn)樯虡I(yè)上現(xiàn)有的養(yǎng)分混合物必須由個(gè)別養(yǎng)分所替換。
對(duì)于商業(yè)治療的目的而言，使用并非宿主生長(zhǎng)所必需但其操作仍然影響在選定環(huán)境中生長(zhǎng)的基因?qū)⑹怯欣?。另外，考慮到治療用途，使用這樣一種基因?qū)⑹怯欣?，所述基因的缺失?dǎo)致對(duì)宿主細(xì)胞有毒性但對(duì)哺乳動(dòng)物，包括人無(wú)毒性的化合物的積聚。使用較小的基因也將是有利的，其又將允許構(gòu)建較小的質(zhì)粒，對(duì)于所述質(zhì)粒復(fù)制的能量消耗更小，因而細(xì)菌培養(yǎng)物生長(zhǎng)速率和質(zhì)粒產(chǎn)量得以提高。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的目的是提供新的無(wú)抗生素選擇系統(tǒng)，其避免了以往公開(kāi)的用于生產(chǎn)重組治療性產(chǎn)品的選擇系統(tǒng)的問(wèn)題。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供新的無(wú)抗生素選擇系統(tǒng)，其在環(huán)境和患者安全方面能夠安全地用于重組治療性產(chǎn)品的生產(chǎn)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供新的無(wú)抗生素選擇系統(tǒng)，其能夠利用標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基在成本上有效地用于重組治療性產(chǎn)品的生產(chǎn)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供新的無(wú)抗生素選擇系統(tǒng)，其提供增長(zhǎng)的生長(zhǎng)速率和提高的產(chǎn)量。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供新的包含選擇標(biāo)志物的載體，其對(duì)于環(huán)境和人是無(wú)毒性的并且其能夠長(zhǎng)期保持在宿主中。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供新的包含基因缺陷的宿主細(xì)胞，其對(duì)環(huán)境無(wú)害本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供選擇攜帶目標(biāo)基因的細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)重組治療性產(chǎn)品的方法。
令人驚訝地發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用araD基因、araD基因的突變形式、其互補(bǔ)序列或其催化活性片段作為選擇標(biāo)志物和使用特異性的araD基因缺陷的細(xì)菌宿主可以達(dá)到本發(fā)明的目的。
因此，本發(fā)明提供包含araD基因缺陷的細(xì)菌細(xì)胞的新選擇系統(tǒng)，將攜帶araD基因、其互補(bǔ)序列或其催化活性片段的載體添加到所述細(xì)胞中作為選擇標(biāo)志物。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種選擇系統(tǒng)，其中所述araD基因是araD基因或L-5-磷酸-核酮糖4-差向異構(gòu)酶(EC 5.1.3.4.)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種選擇系統(tǒng)，其中所述araD基因是突變的。
本發(fā)明進(jìn)一步提供新的載體，其包含araD基因、araD基因的突變形式、其互補(bǔ)序列或其催化活性片段作為選擇標(biāo)志物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供新的細(xì)菌菌株，其是araD基因缺陷的。
本發(fā)明進(jìn)一步提供選擇用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的方法，所述質(zhì)粒包含1)araD基因、araD基因的突變形式、其互補(bǔ)序列或其催化活性片段作為選擇標(biāo)志物和2)目標(biāo)基因，該方法包括將所述質(zhì)粒插入到araD缺陷的宿主細(xì)胞中并且在含有阿拉伯糖的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。
附1顯示大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞使用阿拉伯糖作為碳源(Lin，1987)。
圖2顯示S6wtd1 EGFP的圖譜。通過(guò)箭頭表示d1 EGFP，E2和卡那霉素抗性標(biāo)志物氨基糖苷-3′-O-磷酸轉(zhuǎn)移酶(kana)的編碼序列。通過(guò)實(shí)心盒表示另外的特征10E2BS-十個(gè)具有高度親和性的BPV E2結(jié)合位點(diǎn)；CMV-tk-人巨細(xì)胞病毒即刻早期啟動(dòng)子和HSV Th基因引導(dǎo)序列；內(nèi)含子-具有優(yōu)化的SD和SA位點(diǎn)的兔β-珠蛋白基因內(nèi)含子；tkpa-HSV Tk基因多聚腺苷化信號(hào)；RSV LTR-勞氏肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)；bgh pA-牛生長(zhǎng)激素基因多聚腺苷化信號(hào)；pUCori-源自pUC18質(zhì)粒的細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)。
圖3顯示S6wtd1EGFPkana/araD1的圖譜。通過(guò)箭頭表示d1 EGFP，E2，卡那霉素抗性標(biāo)志物氨基糖苷-3′-O-磷酸轉(zhuǎn)移酶(kana)和L-5-磷酸-核酮糖4-差向異構(gòu)酶(araD)的編碼序列。通過(guò)實(shí)心盒表示另外的特征10E2BS-十個(gè)具有高度親和性的BPV E2結(jié)合位點(diǎn)；CMV-tk-人巨細(xì)胞病毒即刻早期啟動(dòng)子和HSV Th基因引導(dǎo)序列；內(nèi)含子-具有優(yōu)化的SD和SA位點(diǎn)的兔β-珠蛋白基因內(nèi)含子；tkpa-HSV Tk基因多聚腺苷化信號(hào)；RSVLTR-勞氏肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)；bgh pA-牛生長(zhǎng)激素基因多聚腺苷化信號(hào)；pUCori-源自pUC18質(zhì)粒的細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)。
圖4顯示S6wtd1EGFPkana/araD2的圖譜。通過(guò)箭頭表示d1 EGFP，E2，卡那霉素抗性標(biāo)志物氨基糖苷-3′-O-磷酸轉(zhuǎn)移酶(kana)和L-5-磷酸-核酮糖4-差向異構(gòu)酶(araD)的編碼序列。通過(guò)實(shí)心盒表示另外的特征10E2BS-十個(gè)具有高度親和性的BPV E2結(jié)合位點(diǎn)；CMV-tk-人巨細(xì)胞病毒即刻早期啟動(dòng)子和HSV Th基因引導(dǎo)序列；內(nèi)含子-具有優(yōu)化的SD和SA位點(diǎn)的兔β-珠蛋白基因內(nèi)含子；tkpa-HSV Tk基因多聚腺苷化信號(hào)；RSVLTR-勞氏肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)；bgh pA-牛生長(zhǎng)激素基因多聚腺苷化信號(hào)；pUCori-源自pUC18質(zhì)粒的細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)。
圖5顯示S6wtd1EGFP/araD1的圖譜。通過(guò)箭頭表示d1EGFP，E2和L-5-磷酸-核酮糖4-差向異構(gòu)酶(araD)的編碼序列。通過(guò)實(shí)心盒表示另外的特征10E2BS-十個(gè)具有高度親和性的BPV E2結(jié)合位點(diǎn)；CMV-tk-人巨細(xì)胞病毒即刻早期啟動(dòng)子和HSV Th基因引導(dǎo)序列；內(nèi)含子-具有優(yōu)化的SD和SA位點(diǎn)的兔β-珠蛋白基因內(nèi)含子；tkpa-HSV Tk基因多聚腺苷化信號(hào)；RSV LTR-勞氏肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)；bgh pA-牛生長(zhǎng)激素基因多聚腺苷化信號(hào)；pUCori-源自pUC18質(zhì)粒的細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)。
圖6顯示S6wtd1EGFP/araD2的圖譜。通過(guò)箭頭表示d1 EGFP，E2和L-5-磷酸-核酮糖4-差向異構(gòu)酶(araD)的編碼序列。通過(guò)實(shí)心盒表示另外的特征10E2BS-十個(gè)具有高度親和性的BPV E2結(jié)合位點(diǎn)；CMV-tk-人巨細(xì)胞病毒即刻早期啟動(dòng)子和HSV Th基因引導(dǎo)序列；內(nèi)含子-具有優(yōu)化的SD和SA位點(diǎn)的兔β-珠蛋白基因內(nèi)含子；tkpa-HSV Tk基因多聚腺苷化信號(hào)；RSV LTR-勞氏肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)；bgh pA-牛生長(zhǎng)激素基因多聚腺苷化信號(hào)；pUCori-源自pUC18質(zhì)粒的細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)。
圖7A和7B顯示由生長(zhǎng)于不同培養(yǎng)基中大腸桿菌菌株AG1δaraD中提取的S6wtd1EGFP/araD1(7A)和S6wtd1EGFP/araD2(7B)的質(zhì)粒DNA的電泳分析。
圖8顯示由大腸桿菌菌株AG1δaraD中提取的S6wtd1EGFP/araD1和S6wtd1EGFP/araD2的質(zhì)粒DNA的限制性酶切圖譜分析。
圖9顯示在穩(wěn)定性測(cè)定中S6wtd1EGFP/araD2的電泳分析。


圖10A和10B顯示在穩(wěn)定性測(cè)定中S6wtd1 EGFP/araD2的限制性酶切圖譜分析。
圖11顯示在發(fā)酵期間測(cè)量和登記的AG1ΔaraD S6wtd1EGFP/araD2的補(bǔ)料分批發(fā)酵的生長(zhǎng)參數(shù)。縮寫(xiě)如下sPump＝進(jìn)料速率；pO2＝氧濃度；Temp＝生長(zhǎng)溫度；mys＝理想的生長(zhǎng)速率；OD＝于600nm上的光密度。
圖12顯示AG1ΔaraD S6wtd1EGFP/araD2的裂解和純化方案。
圖13顯示克隆#13的araD基因座序列。
圖14顯示質(zhì)粒p3hCG的圖譜。
圖15顯示質(zhì)粒paraDMgB的圖譜。
圖16顯示質(zhì)粒p3araD1hCG的圖譜。
圖17顯示質(zhì)粒p3araD2hCG的圖譜。
圖18顯示具有被破壞的araD的大腸桿菌菌株的L-阿拉伯糖靈敏性的分析結(jié)果。
圖19顯示在具有不同葡萄糖濃度和阿拉伯糖濃度的M9和酵母提取物培養(yǎng)基中L-阿拉伯糖靈敏性的分析結(jié)果。
圖20顯示質(zhì)粒p2MG C#11的圖譜。
圖21顯示質(zhì)粒paraD MG C#145的圖譜。
圖22顯示含有sgbE基因的大腸桿菌基因組片段。
圖23顯示含有ulaF基因的大腸桿菌基因組片段。
發(fā)明詳述本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)備選的，無(wú)抗生素的選擇系統(tǒng)的努力，所述系統(tǒng)可以用于生產(chǎn)體內(nèi)施用的重組治療性產(chǎn)品，尤其是用于生產(chǎn)DNA疫苗。令人吃驚地發(fā)現(xiàn)所述araD基因涉及原核和真核生物，如包括人類的哺乳動(dòng)物的磷酸戊糖途徑，可以成功地用作營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主細(xì)胞中對(duì)于質(zhì)粒的選擇標(biāo)志物。使用營(yíng)養(yǎng)缺陷型具有不涉及使用或產(chǎn)生毒性物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，所述毒性物質(zhì)以后能夠污染質(zhì)粒制品。
基于araD/araC基因已經(jīng)構(gòu)建了一種有效的選擇系統(tǒng)[Ariza，R.R.等，Carcinogenesis 14(1993)303-305]。不過(guò)，這種選擇系統(tǒng)已經(jīng)用于誘變機(jī)制的研究但在以前未用作質(zhì)粒保持的選擇標(biāo)志物。Ariza等使用一種菌株，其中araC基因包含終止密碼子并且araD基因被滅活。將編碼抑制劑tRNA的supF基因的產(chǎn)物引入到質(zhì)粒上。在活性抑制劑tRNA存在的情況下，產(chǎn)生來(lái)自araC的有酶學(xué)活性的產(chǎn)物，引發(fā)細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯(因?yàn)閍raD基因是失活的)。這種系統(tǒng)允許通過(guò)supF tRNA研究突變的抑制在supF被突變所滅活時(shí)，細(xì)胞能夠在阿位伯糖的基礎(chǔ)-上生長(zhǎng)。所以，這種選擇系統(tǒng)是基于araC基因上的并且不是基于araD基因上的。araD基因并未導(dǎo)入質(zhì)粒中，系統(tǒng)也不是為質(zhì)粒生產(chǎn)的目的而進(jìn)行設(shè)計(jì)或賦予特征的。
araD基因編碼負(fù)責(zé)將5-磷酸核酮糖差向異構(gòu)為5-磷酸木酮糖的酶(圖1)，所以允許將在磷酸戊糖途徑中使用阿位伯糖[Engelsberg，E.等，J.Bacteriol.84(1962)137-146]。如果araD被滅活，5-磷酸核酮糖在細(xì)菌細(xì)胞中積聚導(dǎo)致生長(zhǎng)阻滯。
如果araD的染色體拷貝在宿主細(xì)胞中被滅活，將完整拷貝的araD基因、araD基因的突變形式、其互補(bǔ)序列或其催化活性片段插入質(zhì)粒中，作為來(lái)自兩種效應(yīng)的結(jié)果實(shí)現(xiàn)在含有L-阿拉伯糖的培養(yǎng)基中含有質(zhì)粒的細(xì)胞的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。首先，含有質(zhì)粒的細(xì)胞可以利用阿拉伯糖作為碳源，其次，毒性的5-磷酸核酮糖未積聚。這允許使用補(bǔ)充了阿拉伯糖的豐富生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在豐富培養(yǎng)基中大腸桿菌細(xì)胞快速生長(zhǎng)并且質(zhì)粒產(chǎn)量高。便宜的細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基標(biāo)準(zhǔn)組分，如酵母提取物，可以用作氨基酸源。當(dāng)體內(nèi)施用所述制品時(shí)，理論上能夠污染質(zhì)粒制品的痕量5-磷酸核酮糖并不是問(wèn)題，因?yàn)?-磷酸核酮糖能夠有效地被人細(xì)胞代謝并且是無(wú)毒的。
使用araD基因的突變形式提供特別的優(yōu)點(diǎn)。包含araD基因缺陷細(xì)菌細(xì)胞的本發(fā)明的選擇系統(tǒng)產(chǎn)生最佳濃度的araD基因產(chǎn)物L(fēng)-5-磷酸核酮糖4-差向異構(gòu)酶以提供細(xì)菌的快速不受抑制的生長(zhǎng)，向所述細(xì)胞中導(dǎo)入攜帶araD基因突變形式的載體作為選擇標(biāo)志物。通過(guò)使用選擇系統(tǒng)獲得類似的優(yōu)點(diǎn)，所述系統(tǒng)含有攜帶完整的araD基因，但在araD基因座的其它地方包含缺失或突變的載體。
本發(fā)明的選擇系統(tǒng)包含1)攜帶araD基因、araD基因的突變形式、其互補(bǔ)序列或其催化活性片段作為選擇標(biāo)志物的載體和2)araD基因缺陷的特定細(xì)菌菌株，所述菌株中加入了載體。當(dāng)在存在阿拉伯糖的情況下培養(yǎng)araD基因缺陷的特定宿主時(shí)，唯一存活的細(xì)胞是含有載體的細(xì)胞，其含有araD基因、araD基因的突變形式、其互補(bǔ)序列或其催化活性片段。
在本發(fā)明的選擇系統(tǒng)中可以采用任何普遍用于生產(chǎn)治療性產(chǎn)品的表達(dá)載體，其中利用本領(lǐng)域公知的方法將araD基因、araD基因的突變形式、其互補(bǔ)序列或其催化活性片段插入到載體中。在本發(fā)明的上下文中，araD基因優(yōu)選包含由SEQ ID NO.1，由SEQID NO.19所標(biāo)識(shí)的序列，或其可雜交的序列。不過(guò)，還希望包括任何可應(yīng)用的araD基因。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“araD基因的催化活性片段”是任何編碼能夠?qū)?-磷酸核酮糖差向異構(gòu)為D-5-磷酸木酮糖的多肽或蛋白質(zhì)的基因片段。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中將araD基因、其互補(bǔ)序列，或其催化活性片段插入載體中，所述載體能夠長(zhǎng)期保持并且由此能夠提供所需抗原的穩(wěn)定表達(dá)。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中將araD基因的突變形式、其互補(bǔ)序列，或其催化活性片段插入載體中，所述載體能夠長(zhǎng)期保持并且由此能夠提供所需抗原的穩(wěn)定表達(dá)。
在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的載體是一種表達(dá)載體，其包含(a)與異源啟動(dòng)子操作性連接的編碼核錨定蛋白的DNA序列，所述核錨定蛋白包含(i)結(jié)合特異性DNA序列的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和(ii)結(jié)合核組分的功能性結(jié)構(gòu)域，或其功能等同物；和(b)形成核錨定蛋白結(jié)合位點(diǎn)的多聚的(multimerized)DNA序列，其中所述載體缺失乳頭狀瘤病毒復(fù)制起點(diǎn)，和(c)araD基因、araD基因的突變形式、其互補(bǔ)序列或其催化活性片段。
這些載體已經(jīng)在國(guó)際專利申請(qǐng)WO02/090558中進(jìn)行過(guò)詳細(xì)描述，在此將其并入作為參考。
最優(yōu)選地用于本發(fā)明的選擇方法中的載體是一種表達(dá)載體，其包含
(a)1型牛乳頭狀瘤病毒(BPV)的E2蛋白，和(b)作為簇并入載體中的多個(gè)BPV E2蛋白結(jié)合位點(diǎn)，其中所述位點(diǎn)可以是頭-尾結(jié)構(gòu)或者可以通過(guò)間隔定位包括入載體中，其中所述載體缺失乳頭狀瘤病毒復(fù)制起點(diǎn)，和(c)araD基因、其互補(bǔ)序列或其催化活性片段。
在本發(fā)明的選擇系統(tǒng)中原則上可以采用任何已知的araD基因缺陷并且適用于生產(chǎn)治療性產(chǎn)品的宿主。在本文中術(shù)語(yǔ)“缺陷的”表示一種宿主，其中araD基因被完全缺失或通過(guò)任何已知的方法滅活。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用大腸桿菌菌株，優(yōu)選可商購(gòu)的已經(jīng)用公知方法缺失了araD基因的大腸桿菌菌株DH5α-T1，AG1或JM109，如在下面的實(shí)施例所述的那些。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，已經(jīng)對(duì)大腸桿菌菌株，優(yōu)選大腸桿菌菌株DH5α-T1，AG1或JM109進(jìn)行聯(lián)合缺失，以便缺失其它編碼具有L-5-磷酸核酮糖4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白的基因?；蛘?，可以采用可商購(gòu)的大腸桿菌菌株，優(yōu)選大腸桿菌菌株DH5α-T1，AG1或JM109，其中已經(jīng)通過(guò)任何已知方法對(duì)araD基因和/或其它編碼具有L-5-磷酸核酮糖4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白的基因進(jìn)行滅活。在選擇生產(chǎn)重組治療性產(chǎn)品的攜帶目標(biāo)基因的細(xì)胞的方法中，利用本領(lǐng)域眾所周知的方法將所述目標(biāo)基因插入araD基因和/或其它編碼具有L-5-磷酸核酮糖4-差向異構(gòu)酶活性的蛋白的基因缺陷的宿主細(xì)胞中，將所述細(xì)胞在培養(yǎng)性培養(yǎng)基和適于所述(in question)宿主的條件下培養(yǎng)于含有阿拉伯糖的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。
可以使用任何適于培養(yǎng)大腸桿菌細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。對(duì)于商業(yè)生產(chǎn)來(lái)說(shuō)將自然地根據(jù)產(chǎn)量對(duì)生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的實(shí)例是可商購(gòu)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，諸如M9和LB(可以獲自幾個(gè)生產(chǎn)商，諸如Fermentas，Lithuania)。加在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的阿拉伯糖的量不是關(guān)鍵的，但自然地阿拉伯糖應(yīng)當(dāng)以對(duì)于整個(gè)培養(yǎng)時(shí)期充足的量而存在。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)低至0.1％的量足以進(jìn)行選擇。典型地以大約0.1％到大約2.0％的量，優(yōu)選以大約0.2％到大約1.0％的量，最優(yōu)選以大約0.2％到大約0.5％的量向培養(yǎng)基中加入阿拉伯糖。不過(guò)在低至0.01％的濃度上觀察到L-阿拉伯糖的效應(yīng)并且L-阿拉伯糖可以在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加到高達(dá)5％。在特別的實(shí)施方案中，其中L-阿拉伯糖被用作選擇劑和用作有限的碳源，0.2％的L-阿拉伯糖是加入到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的合適量。
本發(fā)明的選擇系統(tǒng)適用于任何表達(dá)系統(tǒng)。它特別適用于意欲體內(nèi)使用的重組治療性產(chǎn)品，如DNA疫苗的表達(dá)，因?yàn)楸苊饬伺c使用抗生素抗性基因相關(guān)聯(lián)的問(wèn)題。同樣地本發(fā)明的選擇系統(tǒng)適用于重組蛋白的生產(chǎn)。
源自制備過(guò)程的阿拉伯糖在最終產(chǎn)物中的可能污染是不重要的，因?yàn)榘⒗鞘翘烊缓妥鳛樘砑觿┐嬖谟谑澄镏械目墒秤锰遣⑶乙虼藢?duì)哺乳動(dòng)物包括人類無(wú)毒。
此外，araD基因比常用的抗，例如，氨芐青霉素和四環(huán)素的抗生素抗性基因的大小更小，并且與卡那霉素和氯霉素抗性基因的大小相似。這提供了另外的好處，因?yàn)樗试S構(gòu)建小的質(zhì)粒，其復(fù)制的能量消耗比大質(zhì)粒更小。由此提高了細(xì)菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng)速率和質(zhì)粒產(chǎn)量。
可以通過(guò)參照下列非限制性實(shí)施例更好地理解本發(fā)明，所述實(shí)施例作為本發(fā)明的示例而提供。給出下列實(shí)施例以便更加充分地闡釋本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。不過(guò)，它們無(wú)論如何不應(yīng)當(dāng)被理解為限制本發(fā)明的廣泛范圍。
實(shí)施例1araD選擇質(zhì)粒的克隆為了克隆araD選擇構(gòu)建體，使用質(zhì)粒S6wtd1 EGFP(圖2)。它具有pMB1復(fù)制起點(diǎn)和卡那霉素抗性標(biāo)志物作為質(zhì)粒主鏈的功能元件。此質(zhì)粒中的卡那霉素抗性是由源自大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn903的基因賦予的。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)由大腸桿菌DH5α染色體擴(kuò)增araD基因。將PCR產(chǎn)物用引物對(duì)s6araDL1+s6araDR1或s6araDL1+s6araDR1在兩種不同的方向克隆入選定的質(zhì)粒中，分別生成命名為araD1和araD2的產(chǎn)物s6araDL1CGCCATGGTTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTAGCACGAAGGAGTCAACATG(SEQ ID NO.2)；s6araDR1CGCCATGGACTAGTAAAAAAAAGCCCGCTCATTAGGCGGGCTGTCAT
TACTGCCCGTAATATGC(SEQ ID NO.3)；s6araDL2CGCCATGGACTAGTTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTAGCACGAAGGAGTCAACATG(SEQ ID NO.4)；s6araDR2CGCCATGGAAAAAAAAGCCCGCTCATTAGGCGGGCTGTCATTACTGCCCGTAATATGC(SEQ ID NO.5)；對(duì)引物進(jìn)行這樣的設(shè)計(jì)，從而使得來(lái)自質(zhì)粒pBR322的P2啟動(dòng)子(用于在pBR322中驅(qū)動(dòng)四環(huán)素抗性基因)和來(lái)自大腸桿菌trp操縱子的終止序列在PCR過(guò)程中分別加入到araD編碼序列的上游和下游。
將814和815bp的PCR產(chǎn)物克隆入用HincII(Fermentas，Lithuania)線性化的pUC18載體中并通過(guò)利用通用測(cè)序引物M13F22GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA(SEQ ID NO.6)和M13R24GAGCGGATAACAATTTCACACAGG(SEQ ID NO.7)和araD特異性引物araDF311CCAACTCACCGGCTGCTCTATC(SEQ ID NO.8)，araD F614AATGCCGAAGATGCGGTGCATAAC(SEQ ID NO.9)，araD R700TAACTGCGGCGCTAACTGAC(SEQ ID NO.10)，和araD R421GGTTGCTGGAATCGACTGAC(SEQ ID NO.11)進(jìn)行測(cè)序來(lái)驗(yàn)證正確的序列。
通過(guò)不同克隆的重組來(lái)修復(fù)擴(kuò)增序列中的突變。
為了將araD克隆入S6wtd1EGFP中，通過(guò)用限制性酶PagI(位置4761)(Fermentas，Lithuania)部分消化將載體線性化并用牛小腸堿性磷酸酶(CIAP；Fermentas，Lithuania)將DNA 5’-末端去磷酸化。用NcoI(Fermentas，Lithuania)將araD1和araD2片段從pUC18中切出并連接到S6wtd1EGFP/PagI上。
將兩種連接混合物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中并接種到包含含有50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基的皿上并于37℃溫育過(guò)夜。首先用菌落PCR分析菌落，其后分離DNA并用不同的限制性酶消化。
所述克隆得到質(zhì)粒S6wtd1EGFPkana/araD1，S6wtd1 EGFPkana/araD2，其顯示于圖3和4中。
為了將卡那霉素抗性標(biāo)記基因從質(zhì)粒中除去，用限制性內(nèi)切酶BcuI(Fermentas，Lithuania)消化S6wtd1EGFPkana/araD1和S6wtd1EGFPkana/araD2并將6473bp的載體片段進(jìn)行自連接。
將連接混合物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌AG1ΔaraD菌株中(見(jiàn)實(shí)施例3)并接種到包含添加了2％L-阿拉伯糖的M9培養(yǎng)基的皿上并于37℃溫育36小時(shí)。首先用菌落PCR分析菌落，其后分離DNA并用不同的限制性酶消化。所述克隆分別得到質(zhì)粒S6wtd1EGFP/araD1，S6wtd1EGFP/araD2，顯示于圖5和圖6中。
將含有S6wtd1 EGFP/araD1和S6wtd1 EGFP/araD2的細(xì)菌菌落于37℃培養(yǎng)在兩種不同的培養(yǎng)基中添加了2.5％L-阿拉伯糖的LB和添加了0.2％L-阿拉伯糖的M9，伴隨著劇烈搖動(dòng)。收集細(xì)胞并利用QIAprep Spin小量制備試劑盒(QIAGEN)從細(xì)胞中抽提質(zhì)粒DNA并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析(分別為圖7A和7B)。
在用限制性內(nèi)切酶PagI(Fermentas，Lithuania)消化之前和之后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析來(lái)自LB和M9培養(yǎng)基中培養(yǎng)物的質(zhì)粒DNA樣品(圖8)。在PagI消化物中獲得的片段的預(yù)測(cè)大小對(duì)于S6wtd1EGFP/araD1是3954和2519bp而對(duì)于S6wtd1EGFP/araD2是4315和2157bp。使用以Eco91I消化的λDNA(圖8C中的M15)和EcoRI/HindIII(Fermentas，Lithuania)消化的λDNA(圖8C中的M3)作為分子量標(biāo)志物。在限制性酶分析中所有分析的細(xì)菌克隆都含有正確的質(zhì)粒，但是當(dāng)質(zhì)粒生長(zhǎng)于LB培養(yǎng)基中時(shí)DNA產(chǎn)量非常低。當(dāng)生長(zhǎng)于添加了0.2％L-阿拉伯糖的M9培養(yǎng)基中時(shí)來(lái)自四個(gè)S6wtd1EGFP/araD2克隆中的兩個(gè)被分析的細(xì)菌克隆(圖8B中的#13和#14)具有較高的生長(zhǎng)速率(圖7和8)，這導(dǎo)致每個(gè)培養(yǎng)物更高的質(zhì)粒產(chǎn)量。
對(duì)這些兩個(gè)具有提高的生長(zhǎng)的克隆實(shí)施進(jìn)一步分析。如通過(guò)限制性分析所判定的，這兩種質(zhì)粒具有與其它質(zhì)粒相同的結(jié)構(gòu)。從細(xì)菌中抽提質(zhì)粒并通過(guò)對(duì)araD基因座測(cè)序作進(jìn)一步特征鑒定?？寺?13的araD基因座序列(SEQ ID NO.18；SEQ ID NO.19)顯示araD基因編碼序列在L-5-磷酸核酮糖4-差向異構(gòu)酶的位置8中攜帶終止密碼子而不是谷氨酰胺的密碼子。這一突變產(chǎn)生自在L-5-磷酸核酮糖4-差向異構(gòu)酶(araD編碼序列)的密碼子8(5′-CAG-3′)中胞嘧啶被胸腺嘧啶所替換，導(dǎo)致一個(gè)終止密碼子(5′-TAG-3′)。在araD基因中攜帶這種突變的質(zhì)粒有效地提供在L-阿拉伯糖存在時(shí)生長(zhǎng)于選擇性培養(yǎng)基中的能力，盡管所述編碼序列包含終止密碼子。已經(jīng)證明當(dāng)這種終止密碼子在編碼序列的起始處時(shí)，終止密碼子UAG被大腸桿菌的核糖體有效地閱讀通過(guò)[參見(jiàn)綜述Murgola，E.J.，Annu.Rev.Genet.19(1985)57-80]。未被理論所束縛，我們假設(shè)高產(chǎn)量的質(zhì)粒，其是細(xì)菌的快速、不受抑制的生長(zhǎng)的指征，需要araD基因產(chǎn)物L(fēng)-5-磷酸核酮糖4-差向異構(gòu)酶的最佳濃度。
克隆#14araD基因座序列的分析顯示araD編碼序列與預(yù)期的完全一致。不過(guò)，觀察到在araD啟動(dòng)子附近覆蓋E2蛋白結(jié)合位點(diǎn)的序列重排(見(jiàn)圖13，SEQ ID NO.18)。這些數(shù)據(jù)另外提示這些在啟動(dòng)子附近的重排可能會(huì)導(dǎo)致啟動(dòng)子活性的下調(diào)，因而導(dǎo)致araD產(chǎn)物水平的下調(diào)。
實(shí)施例2突變的araD選擇質(zhì)粒的克隆對(duì)于突變的araD選擇構(gòu)建體的克隆，用限制性核酸內(nèi)切酶BcuI和HindIII來(lái)切割攜帶卡那霉素抗性(轉(zhuǎn)座子Tn5衍生的卡那霉素抗性標(biāo)記(neo)基因)的質(zhì)粒p3hCG(圖14)，使用Klenow片段(Fermentas，Lithuania)填充末端并且在瓊脂糖凝膠電泳后，從凝膠中純化4647bp大小的片段。用限制性核酸酶BcuI和Eco52I將pMB1復(fù)制起點(diǎn)和攜帶C到T突變的araD序列從質(zhì)粒paraDMgB上切下來(lái)(圖15)，所述C到T突變導(dǎo)致在araD基因編碼序列的位點(diǎn)8的終止密碼子，所述末端使用Klenow片段(Fermentas，Lithuania)進(jìn)行填充，并且用牛小腸堿性磷酸酶(CIAP；Fermentas，Lithuania)對(duì)DNA 5′-末端進(jìn)行去磷酸化。在瓊脂糖凝膠電泳后從凝膠中純化1532bp大小的片段并且將其與上述獲得的4647bp片段進(jìn)行連接。用這種連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)AG1 araD缺陷型菌株并將其接種在包含選擇性M9培養(yǎng)基的瓊脂平板上，所述M9培養(yǎng)基具有0.5％的酵母提取物，2％的L-阿拉伯糖和25μg/ml的卡那霉素。在接種24小時(shí)后，檢查所述菌落，并顯示菌落的大小是均一的。從細(xì)菌中抽提質(zhì)粒并且通過(guò)對(duì)araD基因座位進(jìn)行測(cè)序來(lái)進(jìn)一步鑒定。
克隆得到了質(zhì)粒p3araD1hCG和p3araD2hCG，其分別顯示在圖16和17中。按照序列分析，細(xì)菌包含未重排的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒在密碼子8中具有突變C到T(p3araD1hCG；圖16；p3araD2hCG，圖17)。
當(dāng)用野生型序列重復(fù)該實(shí)驗(yàn)并在轉(zhuǎn)化24小時(shí)后檢查轉(zhuǎn)化的平板時(shí)，結(jié)果是不同的。觀察到兩種類型的菌落第一，大尺寸的菌落，和具有延遲生長(zhǎng)的小菌落。這些質(zhì)粒的序列分析顯示araD基因編碼序列攜帶終止密碼子取代谷氨酰胺的密碼子(質(zhì)粒#3A，araD2)或突變已經(jīng)發(fā)生在核糖體結(jié)合位點(diǎn)中的SD序列中(AGGAG被AGTAG所取代)(質(zhì)粒#2A，araD2)。質(zhì)粒#7(araD1)在所有的araD基因座位區(qū)域中具有正確的序列，然而，當(dāng)被培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)得非常緩慢并導(dǎo)致了低10倍的質(zhì)粒產(chǎn)量。
實(shí)施例3構(gòu)建阿拉伯糖敏感型的ΔaraD大腸桿菌菌株將三株大腸桿菌菌株，DH5αT1，AG1和JM109用于構(gòu)建ΔaraD突變體。使用Datsenko和Wanner[PNAS 97(2000)6640-6645]描述的方法來(lái)斷裂大腸桿菌基因組中的araD基因。這種方法使用噬菌體λRed重組系統(tǒng)。簡(jiǎn)而言之，該系統(tǒng)的策略是用可選擇的抗生素抗性基因取代染色體序列，其通過(guò)使用具有同源延伸的引物以PCR產(chǎn)生。這可以在這些旁側(cè)同系物中通過(guò)Red-介導(dǎo)的重組實(shí)現(xiàn)。
對(duì)于編碼噬菌體λ重組系統(tǒng)的pKD46(Datsenko和Wanner，見(jiàn)上文)的轉(zhuǎn)化，使用下列RF1和RF2溶液來(lái)用化學(xué)方法使大腸桿菌，細(xì)胞處于感受態(tài)RF1 100ml
RF2 100ml
將細(xì)胞培養(yǎng)在2ml的LB培養(yǎng)基中到OD6000.2-0.5。將培養(yǎng)物進(jìn)行離心并將沉淀重懸于1ml的RF1中。將混合物置于冰上10分鐘并進(jìn)行離心。將沉淀懸浮在100μl的RF2中并將混懸液置于冰上達(dá)30-45分鐘。加入約50ng的pKD43并將細(xì)胞保持在冰上另外30分鐘，隨后于37℃熱休克5分鐘。在冰上溫育10分鐘后，將900μl的SOB培養(yǎng)基加入轉(zhuǎn)化的細(xì)胞并將混和物于37℃溫育1小時(shí)。將細(xì)胞接種在包含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基上。從轉(zhuǎn)化的平板上選擇菌落并將其培養(yǎng)在2ml的相同培養(yǎng)基中到OD600約為1并制備甘油貯存液(2ml培養(yǎng)物+0.6ml 50％甘油)。將所述貯存液貯存于-80℃。
對(duì)于araD基因的斷裂，產(chǎn)生了包含卡那霉素抗性基因的線性PCR產(chǎn)物。將質(zhì)粒pKD 13(Datsenko和Wanner，PNAS vol.97，no 12，June 2000)用作PCR模板。使用的引物是ara(pr1)和ara(pr4)ara(pr1)5′-CTCAAACGCCCAGGTATTAGAAGCCAACCTGGCGCTGCC-AAAACACGTGTAG GCTGGAGCTGCTTC 3′(SEQ ID NO.12)ara(pr4)5′-GGTTTGATCACAAAGACGCCGCGCTCGCGATCAACGGCGC-ATTCCGGGGAT CCGTCGACC 3′(SEQ ID NO.13)這些引物與pKD13具有互補(bǔ)序列以在PCR中進(jìn)行退火，與araD基因具有互補(bǔ)序列以進(jìn)行同源重組。
所述PCR反應(yīng)混合物如下PFU天然緩沖液(5μl)，10mM dNTP(5μl)，引物ara(pr1)10μM(1μl)，引物ara(pr4)10μM(1μl)，pKD13 100ng(2μl)，DMSO(4μl)，PFU 2.5U(1μl)，和mQ水補(bǔ)到50μl。
PCR程序如下變性45s，96℃，退火45s，50℃，合成2min 30s，72℃，25個(gè)循環(huán)。獲得的PCR產(chǎn)物是1.4kb。
同時(shí)進(jìn)行5個(gè)反應(yīng)；使用超純純化試劑盒(MoBio Laboratories Inc.)從2％的瓊脂糖凝膠上純化DNA并用60μl的水進(jìn)行洗脫。用乙醇沉淀濃縮DNA并將其溶解在5μl水中。最終濃度是0.6μg/μl。將1.5μl的等份用在一次電穿孔中。
將PCR產(chǎn)物電穿孔到DH5α T1 pKD46，AG1 pKD46(Datsenko和Wanner，見(jiàn)上文)，和JM109pKD46大腸桿菌細(xì)胞中。首先，用DH5αT1pKD46，AG1 pKD46，和JM109 pKD46大腸桿菌細(xì)胞的過(guò)夜培養(yǎng)物接種包含用于誘導(dǎo)重組系統(tǒng)的10mM L-阿拉伯糖和100μg/ml的氨芐青霉素的200ml YENB培養(yǎng)基。將培養(yǎng)物培養(yǎng)在30℃直到OD600為0.8(DH5αT1和JM109)和0.6(AG1)。通過(guò)于4℃在4000g離心10分鐘來(lái)收集細(xì)菌，用20ml無(wú)菌水來(lái)洗滌2次用包含10％甘油的20ml的無(wú)菌水來(lái)洗滌1次。將細(xì)胞懸浮在包含10％甘油的300μl中。將40μl感受態(tài)細(xì)胞用在一次電穿孔中。
使用0.2cm的比色杯和2.5kV以BioRad大腸桿菌脈沖發(fā)生器來(lái)進(jìn)行電穿孔。將純化的PCR產(chǎn)物(1.5μl)加入感受態(tài)細(xì)胞中，保持在冰上1分鐘，在電穿孔后立即將2ml的溫SOB培養(yǎng)基加入細(xì)胞并將混和物于37℃溫育1小時(shí)。將細(xì)胞接種到包含卡那霉素(25μg/ml)的LB培養(yǎng)基上。將100pg的大卡那霉素抗性質(zhì)粒(GTU-MultiHIV C-分化單位)用作陽(yáng)性對(duì)照，不加入質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照，轉(zhuǎn)化效率對(duì)于AG1是106，對(duì)于JM109是107。在陰性對(duì)照板上沒(méi)有菌落，在JM109+PCR產(chǎn)物板上獲得215個(gè)菌落，在AG1+PCR產(chǎn)物板上獲得70個(gè)菌落并且在DH5αT1+PCR產(chǎn)物板上獲得50個(gè)菌落。
實(shí)施例4檢驗(yàn)大腸桿菌DH5αT1ΔaraD，AG1ΔaraD和JM109ΔaraD菌株通過(guò)使用引物araVlisF(5′CGGCACGAAGGAGTCAACAT3′；SEQ IDNO.14)和araVlisR(5′TGATAGAGCAGCCGGTGAGT3′；SEQ ID NO.15)進(jìn)行菌落PCR來(lái)檢驗(yàn)從如實(shí)施例2所述的電穿孔中獲得的菌落的卡那霉素抗性基因的存在，所述引物在靠近插入位點(diǎn)包含araD基因上的退火位點(diǎn)。在沒(méi)有插入araD的情況下，在大腸桿菌DH5αT1，AG1和JM109菌株中預(yù)期272bp的PCR產(chǎn)物，如果PCR產(chǎn)物已經(jīng)被插入araD基因中，預(yù)期1545bp的產(chǎn)物。檢查了DH5αT1ΔaraD的3個(gè)菌落和AG1ΔaraD的9個(gè)菌落和JM109ΔaraD的15個(gè)菌落中的14個(gè)菌落，并且每個(gè)都給出了1545bp的產(chǎn)物。因此得出結(jié)論這些菌株包含卡那霉素抗性基因的插入。
為了證實(shí)卡那霉素基因的插入，使用引物kanaSF(5′TCAGATCCTTGGCGGCAAGA3′；SEQ ID NO.16)和araVR(5′TGTAATCGACGCCGGAAGGT3′；SEQ ID NO.17)進(jìn)行另一個(gè)菌落PCR。如果卡那霉素抗性基因已經(jīng)被插入araD基因，這些引物產(chǎn)生435bp的產(chǎn)物。檢驗(yàn)了來(lái)自AG1ΔaraD和JM109ΔaraD菌株的6個(gè)菌落和來(lái)自DH5αT1ΔaraD菌株的3個(gè)菌落，并且都給出了正確的產(chǎn)物。
將AG1ΔaraD和JM109ΔaraD的6個(gè)菌落，和DH5αT1ΔaraD的3個(gè)菌落接種在包含25μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基上并在37℃溫育過(guò)夜以消除pKD46質(zhì)粒，所述質(zhì)粒具有溫度敏感型的復(fù)制起點(diǎn)。通過(guò)重復(fù)接種在LB培養(yǎng)基上和包含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上來(lái)檢驗(yàn)細(xì)胞的氨芐青霉素靈敏性。沒(méi)有菌落生長(zhǎng)在包含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上并且得出結(jié)論細(xì)菌不再包含pKD46質(zhì)粒。
在產(chǎn)生的AG1ΔaraD和JM109ΔaraD菌株上檢驗(yàn)阿拉伯糖靈敏性。將AG1ΔaraD的一個(gè)菌落和JM109ΔaraD的一個(gè)菌落每個(gè)都接種在2mlLB中。將培養(yǎng)物培養(yǎng)8小時(shí)，以1∶100稀釋到包含0.2％甘油，25μg/ml卡那霉素，0.01％維生素B1(對(duì)于JM109ΔaraD，0.05％脯氨酸)的M9培養(yǎng)基中，并將不同濃度的L-阿拉伯糖加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)物在37℃于振蕩恒溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)并測(cè)量OD600(表1)。
表1檢驗(yàn)阿拉伯糖的靈敏性
如可在表1中所見(jiàn)，低到0.1％的L-阿拉伯糖的量足以抑制本發(fā)明的ΔaraD菌株的生長(zhǎng)。
如上，進(jìn)一步在AG1ΔaraD，DH5αT1ΔaraD和JM109ΔaraD上檢驗(yàn)阿拉伯糖的靈敏性，但是使用更低濃度的L-阿拉伯糖。在圖18中給出結(jié)果。如在圖18中可見(jiàn)，低到0.0005％的L-阿拉伯糖的量足以抑制本發(fā)明的ΔaraD菌株的生長(zhǎng)。
另外，在具有不同葡萄糖和阿拉伯糖濃度(0.2％葡萄糖，0.2％阿拉伯糖，2％阿拉伯糖)的M9和酵母提取物培養(yǎng)基中檢驗(yàn)L-阿拉伯糖的靈敏性。將所述培養(yǎng)物在振蕩恒溫箱中于37℃進(jìn)行溫育過(guò)夜。接著，測(cè)量OD600從而對(duì)細(xì)胞密度進(jìn)行定量。在圖19中給出結(jié)果。
兩種濃度的阿拉伯糖(0,2％和2％)都抑制了本發(fā)明的ΔaraD菌株的生長(zhǎng)。然而，具有完整araD基因的菌株的生長(zhǎng)沒(méi)有受到抑制。
另外，檢驗(yàn)了ΔaraD菌株的質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量。將在實(shí)施例1中制備的質(zhì)粒S6wtd1EGFParaD2轉(zhuǎn)化到AG1ΔaraD和JM109ΔaraD菌株中。如實(shí)施例3所述用RF1和RF2溶液制備感受態(tài)細(xì)胞。
將來(lái)自轉(zhuǎn)化平板的菌落接種到包含0.5％酵母提取物和25μg/ml卡那霉素+0.01％維生素B1+L-阿拉伯糖(2％和0.2％)的2ml的M9培養(yǎng)基中。
將所述培養(yǎng)物在37℃培養(yǎng)17小時(shí)。接著測(cè)量OD600來(lái)量化細(xì)胞密度并用Qiagen小量制備試劑盒來(lái)抽提質(zhì)粒DNA。將系數(shù)2.8(OD600/ml)用于小量制備分離從而得到可比較的結(jié)果。將結(jié)果顯示于表2。
將DNA濃度用分光光度計(jì)測(cè)量為在260nm處的OD。對(duì)于顯微鏡分析，將一滴細(xì)菌培養(yǎng)物施用在玻璃載玻片上并用蓋玻片覆蓋。用油浸物鏡以100倍放大來(lái)肉眼檢查培養(yǎng)物。
表2ΔaraD菌株的質(zhì)粒DNA產(chǎn)量
按照這些結(jié)果，0.2％的L-阿拉伯糖足以獲得與2％阿拉伯糖相同水平的質(zhì)粒拷貝數(shù)。
對(duì)于該質(zhì)粒AG1ΔaraD似乎更好，因?yàn)橘|(zhì)粒產(chǎn)量稍微更高些，并且細(xì)胞密度也是如此。
實(shí)施例5具有在潛在地編碼L-5-磷酸核酮糖4-差向異構(gòu)酶的基因中的另外突變的大腸桿菌菌株的產(chǎn)生大腸桿菌染色體在不同的操縱子中包含兩個(gè)另外的L-5-磷酸核酮糖4-差向異構(gòu)酶的編碼序列。來(lái)自L-維生素C降解途徑的ulaF和sgbE基因編碼具有差向異構(gòu)酶活性的基因(Wen Shan Yew，Jhon A.Gerlt，J.Bacteriol.184(2002)302-306。為了增加選擇的嚴(yán)謹(jǐn)性并且為了避免或敲除由于具有差向異構(gòu)酶活性的其它基因的大腸桿菌菌株的可能適應(yīng)機(jī)制，大腸桿菌基因組中的UlaF和SgbE基因的編碼序列被打斷。這些適應(yīng)機(jī)制可以在適合條件下，在長(zhǎng)期的質(zhì)粒產(chǎn)生過(guò)程中發(fā)生。
使用如實(shí)施例3所描述的噬菌體λRed重組系統(tǒng)，在大腸桿菌菌株DH5αT1ΔaraD和AG1ΔaraD中打斷UlaF和SgbE基因。
首先，消除在大腸桿菌AG1ΔaraD和DH5αT1ΔaraD菌株中的卡那霉素抗性基因。FLP重組酶表達(dá)質(zhì)粒pKD20(Datsenko和Wanner，見(jiàn)上文)是氨芐青霉素抗性和溫度敏感型的。用pCP20(卡那霉素抗性基因在FRT側(cè)翼)轉(zhuǎn)化卡那霉素-抗性突變體，并且在30℃選擇氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體(48小時(shí))，其后在42℃非選擇性地純化相同的菌落(24小時(shí)兩次)。接著，對(duì)它們測(cè)試卡那霉素和氨芐青霉素抗性的丟失。
使用引物ulaFylem和ulaFalumulaFylemCAGCAGGTATTTGAAGCCAACATGGAGCTGCCGCGCTACG-GGCTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.21)ulaFalumAAACGGCTGCGGAATTAGACCAGTTATCTCCCGAGGAAGGAAATTAATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.22)，來(lái)進(jìn)行噬菌體λRed重組系統(tǒng)對(duì)染色體ula F基因(SEQ ID NO.20)的滅活。
在兩種轉(zhuǎn)化板上都觀察到了許多菌落。使用引物ulaFvalisR和ulaFvalisFulaFvalisRAAACGGCTGCGGAATTAGACC(SEQ ID NO.23)ulaFvalisFGCCGTACCTGATTGAGATGTGGAG(SEQ ID NO.24)通過(guò)菌落PCR檢驗(yàn)了通過(guò)電穿孔獲得的15個(gè)菌落的卡那霉素抗性基因的存在。
這些引物在靠近插入位點(diǎn)包含UlaF基因上的退火位點(diǎn)。在沒(méi)有插入U(xiǎn)laF的情況下，在大腸桿菌DH5αT1ΔaraD和AG1ΔaraD菌株中預(yù)期864bp的PCR產(chǎn)物，如果PCR產(chǎn)物已經(jīng)被插入U(xiǎn)laF基因中，預(yù)期1527bp的產(chǎn)物。為了證實(shí)卡那霉素基因的插入，使用引物ulaFvalisR(SEQ ID NO23)和kanaSF(SEQ ID NO 16)進(jìn)行了另一個(gè)菌落PCR。
如果卡那霉素抗性基因已經(jīng)被插入U(xiǎn)laF基因中，這些引物產(chǎn)生428bp的產(chǎn)物。檢驗(yàn)了來(lái)自AG1ΔaraDΔulaF和DH5αT1ΔaraDΔulaF菌株的四個(gè)菌落并且所有的都給出了正確的產(chǎn)物。來(lái)自每個(gè)菌株的一個(gè)菌落被進(jìn)一步使用。
如上述進(jìn)行在大腸桿菌AG1ΔaraDΔulaF和DH5αT1ΔaraDΔulaF菌株中的卡那霉素抗性基因的消除。如實(shí)施例3中所述進(jìn)行通過(guò)噬菌體λRed重組系統(tǒng)對(duì)噬菌體sgbE基因(SEQ ID NO.25)的滅活。所用的引物是sgbEalum和sgbEylemsgbEalumCGTTACAGCAAGGAACATATCAATTCGTAGTGCCGGGGCGATGAAGAATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.26)sgbEylemGCAGGAGGCTGGATTTATATGTTAGAGCAACTGAAAGCCG-ACGTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.27)在兩種轉(zhuǎn)化板上都觀察到了許多菌落。通過(guò)使用引物sgbEvalisR和sgbEvalisFsgbEvalisRCGGCGTTACAGCAAGGAACATATC(SEQ ID NO.28)SgbEvalisFATTGAAGCGCGTATGCAGGAGG(SEQ ID NO.29)進(jìn)行菌落PCR來(lái)檢驗(yàn)通過(guò)電穿孔獲得的15個(gè)菌落的卡那霉素抗性基因的存在。
在沒(méi)有插入sgbE的情況下，在大腸桿菌DH5αT1ΔaraDΔulaFΔsgbE和AG1ΔaraDΔulaFΔsgbE菌株中預(yù)期792bp的PCR產(chǎn)物，如果PCR產(chǎn)物已經(jīng)被插入SgbE基因中，預(yù)期1413bp的產(chǎn)物。為了證實(shí)卡那霉素基因的插入，使用引物sgbEvalisR(SEQ ID NO.28)和kanaSF(SEQ ID NO.16)進(jìn)行了另一個(gè)菌落PCR檢驗(yàn)了兩株菌株的15個(gè)菌落并且有4個(gè)給出了正確的產(chǎn)物。
在產(chǎn)生的大腸桿菌DH5αT1ΔaraDΔulaFΔsgbE和AG1ΔaraDΔulaFΔsgbE菌株上檢驗(yàn)了阿拉伯糖的靈敏性并且將它們與大腸桿菌DH5αT1ΔaraD和AG1ΔaraD菌株的那些進(jìn)行了比較。將每株菌株的一個(gè)菌落接種到2ml的M9培養(yǎng)基中，所述M9培養(yǎng)基分別包含0.5％酵母提取物，25μg/ml的卡那霉素，僅0.2％葡萄糖或0.2％或2％L-阿拉伯糖。結(jié)果顯示與表3。
表3阿拉伯糖靈敏性的檢驗(yàn)
如從表3中可見(jiàn)，在本發(fā)明菌株中的阿拉伯糖靈敏性中沒(méi)有實(shí)質(zhì)上的不同。相似地，當(dāng)如實(shí)施例3所述檢驗(yàn)ΔaraD和ΔaraDΔulaFΔsgbE菌株的質(zhì)粒DNA產(chǎn)量時(shí)(結(jié)果沒(méi)有顯示)，在大腸桿菌AG1ΔaraD和AG1ΔaraDΔulaFΔsgbE或DH5αT1ΔaraD和DH5αT1ΔaraDΔulaFΔsgbE菌株間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)不同。
實(shí)施例6S6wtd1 EGFP/araD2的穩(wěn)定性疫苗接種載體的一個(gè)重要特點(diǎn)是在細(xì)菌細(xì)胞增殖中的穩(wěn)定性。為了檢驗(yàn)細(xì)菌中S6wtd1EGFP/araD2的穩(wěn)定性，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到在實(shí)施例3中制備的大腸桿菌AG1ΔaraD和JM109ΔaraD菌株中并且在四代過(guò)程中，通過(guò)質(zhì)粒DNA分析載體仍保持完整性。
將質(zhì)粒S6wtd1 EGFP/araD2與感受態(tài)大腸桿菌AG1ΔaraD和JM109ΔaraD細(xì)胞混合，并將其在冰上溫育30分鐘。隨后，將細(xì)胞混懸液在于冰上迅速冷卻后，在37℃熱休克3分鐘。將1毫升LB培養(yǎng)基加入樣品并且將混合物于37℃溫育45分鐘，伴隨劇烈振蕩。最終，將細(xì)胞的一部分接種到M9培養(yǎng)基皿上，所述M9培養(yǎng)基包含0.5％的酵母提取物，2％L-阿拉伯糖和25μg/ml的卡那霉素。次日，將來(lái)自一個(gè)菌落的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到包含相同培養(yǎng)基的新皿上。重復(fù)該過(guò)程直到細(xì)菌已經(jīng)傳代4次。將來(lái)自兩個(gè)細(xì)菌菌株的每代的兩個(gè)菌落用于接種2ml的包含0.5％的酵母提取物，2％L-阿拉伯糖和25μg/ml的卡那霉素的M9培養(yǎng)基中，并于37℃過(guò)夜培養(yǎng)，伴隨劇烈振蕩。收集細(xì)胞并使用QIAprep Spin小量制備試劑盒(QIAGEN)從細(xì)菌中抽提質(zhì)粒DNA。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，與用于轉(zhuǎn)化的起始的S6wtd1 EGFP/araD2 DNA(如在圖9和圖10中的對(duì)照)比較分析，用限制性核酸酶HindIII(Fermentas，Lithuania)消化之前(圖9)和之后(圖10)的質(zhì)粒DNA樣品。將EcoRI/HindIII(Fermentas，Lithuania)消化的λDNA用作分子量標(biāo)志物(在圖10中的M3)。
對(duì)于大腸桿菌AG1ΔaraD用HindIII消化的樣品顯示于圖10A中，對(duì)于JM109ΔaraD菌株用HindIII消化的樣品顯示于圖10B中，觀察到圖譜與起始的S6wtd1EGFP/araD2質(zhì)粒DNA的相似。由HindIII消化所得到的片段的預(yù)期大小是3274，1688和1510bp?？梢缘贸鼋Y(jié)論當(dāng)在大腸桿菌AG1ΔaraD和JM109ΔaraD菌株中增殖時(shí)，接種疫苗的載體S6wtd1EGFP/araD2是穩(wěn)定的。
實(shí)施例7抗生素選擇系統(tǒng)與本發(fā)明的L-阿拉伯糖選擇系統(tǒng)的比較在抗生素選擇系統(tǒng)與本發(fā)明的L-阿拉伯糖選擇系統(tǒng)的比較中，使用下列培養(yǎng)基對(duì)于攜帶質(zhì)粒p2MG C#11的大腸桿菌AG1培養(yǎng)基1M9培養(yǎng)基加0.5％酵母提取物，0.2％葡萄糖和25μg/ml的卡那霉素(選擇培養(yǎng)基)；培養(yǎng)基2M9培養(yǎng)基加0.5％酵母提取物和0.2％葡萄糖(非選擇培養(yǎng)基)；培養(yǎng)基3M9培養(yǎng)基加0.5％酵母提取物，0.2％L-阿拉伯糖和25μg/ml的卡那霉素(選擇培養(yǎng)基)；和培養(yǎng)基4M9培養(yǎng)基加0.5％酵母提取物和0.2％L-阿拉伯糖(非選擇培養(yǎng)基)。
對(duì)于攜帶paraD MG C#145的大腸桿菌AG1ΔaraD
培養(yǎng)基5M9培養(yǎng)基加0.5％酵母提取物，0.2％L-阿拉伯糖和25μg/ml的卡那霉素(選擇性培養(yǎng)基)；和培養(yǎng)基6M9培養(yǎng)基加0.5％酵母提取物，0.2％葡萄糖和25μg/ml的卡那霉素(非選擇培養(yǎng)基)。
將質(zhì)粒p2MG C#11(圖20)和paraD MG C#145(圖21)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌AG1和在密碼子8位上具有突變C-T的大腸桿菌AG1ΔaraD中。將被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌菌落在恒溫箱中于37℃過(guò)夜培養(yǎng)。次日早晨，如上所示，將菌落接種到選擇性和非選擇性液體培養(yǎng)基中。將接種的培養(yǎng)物于搖床中培養(yǎng)于2ml各自的培養(yǎng)基中直到它們達(dá)到穩(wěn)定階段，并且在OD600測(cè)量培養(yǎng)物的密度。將質(zhì)粒抽提自培養(yǎng)物中并且通過(guò)在260nm測(cè)量質(zhì)粒DNA來(lái)確定質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量。質(zhì)粒的產(chǎn)量以50μg產(chǎn)量對(duì)應(yīng)于在260nm處為1的光密度的基礎(chǔ)進(jìn)行計(jì)算。
接著，將來(lái)自穩(wěn)定培養(yǎng)物的20μl等份接種到新鮮培養(yǎng)基中(稀釋100倍)，并將培養(yǎng)物進(jìn)行培養(yǎng)直到穩(wěn)定階段(8-12小時(shí))。在OD600測(cè)量培養(yǎng)物的密度，抽提質(zhì)粒并測(cè)定產(chǎn)量，并再次將等份接種到2μl的液體培養(yǎng)基中。將該過(guò)程重復(fù)7次(制品(preparation)1-7)。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在下面的表5中進(jìn)行提供。
表5.抗生素選擇系統(tǒng)與本發(fā)明的L-阿拉伯糖選擇系統(tǒng)的比較
由這些數(shù)據(jù)可以推斷攜帶卡那霉素抗性基因并在卡那霉素存在時(shí)賦予大腸桿菌抗性的質(zhì)粒在非選擇性以及在選擇性條件下的培養(yǎng)物的連續(xù)稀釋/生長(zhǎng)步驟中丟失。在第七個(gè)稀釋循環(huán)上來(lái)自1ml培養(yǎng)物的質(zhì)粒產(chǎn)量在選擇性條件下降低3倍而在非選擇性條件下降低10倍(在表5中，分別為制品1/1對(duì)1/7和2/1對(duì)2/7)。當(dāng)攜帶具有卡那霉素抗性的質(zhì)粒的大腸桿菌的碳源是L-阿拉伯糖而不是葡萄糖時(shí)，獲得相同的基本結(jié)果(在表5中，分別為制品3/1對(duì)3/7和4/1對(duì)4/7)。不過(guò)，當(dāng)將本發(fā)明的araD選擇系統(tǒng)用于質(zhì)粒中時(shí)，質(zhì)粒DNA產(chǎn)量在選擇性(在表5中制品5/1對(duì)5/7)和非選擇性(在表5中制品6/1對(duì)6/7)條件下都高。在7個(gè)世代上在選擇性和非選擇性條件下質(zhì)粒DNA產(chǎn)量都降低大約20％。這清楚地顯示攜帶本發(fā)明的araD選擇系統(tǒng)的質(zhì)粒在選擇性以及非選擇性條件下要穩(wěn)定地多并且有效地生長(zhǎng)。
實(shí)施例8AG1ΔaraD S6wtd1EGFP/araD2的補(bǔ)料分批(fed-batch)發(fā)酵為了生產(chǎn)含有質(zhì)粒的細(xì)菌的目的，還在補(bǔ)料分批發(fā)酵中對(duì)基于araD基因的選擇系統(tǒng)進(jìn)行檢驗(yàn)。從AG1ΔaraD S6wtd1EGFP/araD2平板上挑取單個(gè)菌落并接種入250ml含有0.5％酵母提取物，0.2％L-阿拉伯糖和25μg/ml卡那霉素的M9培養(yǎng)基中并于37℃以劇烈振蕩溫育過(guò)夜。18小時(shí)后接種物的OD600為6.4。將160ml的接種物加入到含有5L FermenterStarting培養(yǎng)基(8g/l KH2PO4；10h/l NaCl；5g/l NH4Cl；5g/l酵母提取物；2g/l L-阿拉伯糖；2g/l MgSO4，25mg/l卡那霉素和0.1g/l維生素B1；用NH4OH調(diào)節(jié)至pH 6.7)的發(fā)酵罐中。在生長(zhǎng)5.5小時(shí)后用發(fā)酵罐進(jìn)料培養(yǎng)基(300g/l L-阿拉伯糖；150h/l酵母提取物；50mg/l卡那霉素；0.2g/l維生素B1)以0.15h-1的給定生長(zhǎng)速度(允許碳源有限的生長(zhǎng))起始生長(zhǎng)自動(dòng)進(jìn)料。根據(jù)公式F(t)＝myS*Sin/Sf通過(guò)計(jì)算機(jī)控制進(jìn)料速度，其中myS是理想的生長(zhǎng)速率，Sin是加到時(shí)間點(diǎn)上的碳源量而Sf是進(jìn)料培養(yǎng)基中的碳源濃度。生長(zhǎng)后測(cè)量OD600并為了質(zhì)粒DNA取樣品。在發(fā)酵期間記錄的數(shù)據(jù)在表11中給出。當(dāng)消耗了1L的進(jìn)料培養(yǎng)基時(shí)終止發(fā)酵。最后的OD600為45。通過(guò)離心收集細(xì)菌團(tuán)塊并用2L STE緩沖液洗滌一次。細(xì)菌生物量的產(chǎn)量為410g濕重。質(zhì)粒DNA含量的數(shù)據(jù)顯示在表6中。
表6在AG1ΔaraD S6wtd1EGFP/araD2發(fā)酵過(guò)程中的質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量
表6中的數(shù)據(jù)顯示L-阿拉伯糖選擇系統(tǒng)在高細(xì)胞密度時(shí)工作地非常好?？赡苁且?yàn)橥ㄟ^(guò)使細(xì)菌更快地使用糖，在L-阿拉伯糖限制條件下，存在于細(xì)菌中的更多的質(zhì)?？截惤o出的優(yōu)勢(shì)。
實(shí)施例9AG1ΔaraD S6wtd1EGFP/araD2的純化如下進(jìn)行AG1ΔaraD S6wtd1EGFP/araD2的純化(圖12)a)進(jìn)料制備按照Qiagen′s質(zhì)粒純化手冊(cè)來(lái)制備清亮的裂解物，除了沒(méi)有使用核糖核酸酶。
將200g的大腸桿菌細(xì)胞團(tuán)重懸于2000ml的重懸緩沖液中，然后使用用于裂解和中和的等體積的P2和P3。通過(guò)于4℃在6000g離心30分鐘來(lái)去除細(xì)胞碎片。通過(guò)紙巾，清亮的裂解物流出，加入1/10的10％TritonX-114(Sigma)，并將溶液置于冰上1小時(shí)(TritonX-114已經(jīng)顯示有效減少蛋白質(zhì)中的內(nèi)毒素的水平，Liu et al.，Clinical Biochemistry，1997)。一小時(shí)后，用0,6體積的冷異丙醇來(lái)沉淀核酸。將上清液傾去，并將沉淀過(guò)夜貯存于-20℃。
b)質(zhì)粒DNA純化按照Amersham Pharmacia的三步超螺旋質(zhì)粒純化方法來(lái)進(jìn)行質(zhì)粒DNA的純化，其中采取了少部分的修改。
步驟1.將沉淀物再溶解于1500ml TE中(10mM Tris-Cl，1mM EDTA；pH 8.0)并加載于Sepharose 6FF(Amersham Pharmacia)上進(jìn)行RNA去除和緩沖液交換，所述Sepharose 6FF之前用緩沖液A-2M(NH4)2SO4，100mMTris Cl，10mM EDTA，pH 7.5進(jìn)行平衡。
步驟2.空體積被定向于質(zhì)粒選擇(Amersham Pharmacia)柱(用緩沖液A平衡)并且在用緩沖液B2(1,6M NaCl，2M (NH4)2SO4，100mM Tris Cl，10mM EDTA，pH 7.5)洗滌和洗脫后，捕獲了超螺旋質(zhì)粒DNA。
步驟3.用5體積的蒸餾的去離子水稀釋被洗脫的質(zhì)粒并將其加載于用緩沖液C1(0,4M NaCl，100mM Tris Cl，10mM EDTA，pH 7.5)平衡過(guò)的SOURCE 30Q(Amersham Pharmacia)。洗滌后，用緩沖液C2(1M NaCl，100mM Tris Cl，10mM EDTA，pH 7.5)洗脫純化的質(zhì)粒并收集洗脫峰。級(jí)分大小是150ml并且其包含100mg的無(wú)內(nèi)毒素(＜10EU/mg)的S6wtd1EGFP/araD2質(zhì)粒。
序列表<110>非特生物技術(shù)有限責(zé)任公司<120>新選擇系統(tǒng)<130>2031002<160>29<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>780<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>1gtttcgtttg attggctgtg gttttataca gtcattactg cccgtaatat gccttcgcgc60catgcttacg cagatagtgt ttatccagca gcgtttgctg catatccggt aactgcggcg120ctaactgacg gcagaatatc cccatataag cgacctcttc cagcacgatg gcgttatgca180ccgcatcttc ggcatttttg ccccatgcaa acgggccgtg ggaatggacc agaacgccgg240gcatttgcgc tgcatcgata ccctgttttt caaaggtttc tacgatgacg ttaccggttt300cccactcata ttcgccgttg atttctgcgt cggtcatttt gcgggtgcag ggaatggtgc360cgtagaaata gtcggcgtgg gtggtgccgg ttgctggaat cgactgaccc gcctgcgccc420agatggtggc gtggcgcgag tgcgtatgca caatgccgcc aatggagggg aatgcctgat480agagcagccg gtgagttggc gtgtcggagg agggcttttt cgtaccttca accacttcac540cggtttcgat gctaaccacg accatatcgt cagcggtcat gacgctgtaa tcgacgccgg600aaggtttgat cacaaagacg ccgcgctcgc gatcaacggc gctgacgttg ccccatgtga660gcgtgaccag gttgtgtttt ggcagcgcca ggttggcttc taatacctgg cgtttgagat720cttctaacat gttgactcct tcgtgccgga tgcgctttgc ttatccggcc tacaaaatcg780<210>2
<211>76<212>DNA<213>人工序列<220>引物<223>
<400>2cgccatggtt ctcatgtttg acagcttatc atcgataagc tttaatgcgg tagtttagca60cgaaggagtc aacatg76<210>3<211>64<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3cgccatggac tagtaaaaaa aagcccgctc attaggcggg ctgtcattac tgcccgtaat60atgc 64<210>4<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4cgccatggac tagttctcat gtttgacagc ttatcatcga taagctttaa tgcggtagtt60tagcacgaag gagtcaacat g 81<210>5<211>58<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5cgccatggaa aaaaaagccc gctcattagg cgggctgtca ttactgcccg taatatgc58<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6gccagggttt tcccagtcac ga 22<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7gagcggataa caatttcaca cagg24<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8ccaactcacc ggctgctcta tc 22
<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9aatgccgaag atgcggtgca taac 24<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10taactgcggc gctaactgac 20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>11ggttgctgga atcgactgac 20<210>12<211>66<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>12ctcaaacgcc caggtattag aagccaacct ggcgctgcca aaacacgtgt aggctggagc60tgcttc 66<210>13<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>13ggtttgatca caaagacgcc gcgctcgcga tcaacggcgc attccgggga tccgtcgacc60<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>14cggcacgaag gagtcaacat 20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>15tgatagagca gccggtgagt 20
<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>16tcagatcctt ggcggcaaga20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>17tgtaatcgac gccggaaggt20<210>18<211>1030<212>DNA<213>人工的<400>18ggatccgacc ggcaacggta cagatccgac cggcaacggt acagatccga ccggcaacgg60tcagatccga ccggcaacgg tacagatccg accggcaacg gtacagatcc gaccggcaac120ggtacagatc cgaccggcaa cggtacagat ccgaccggca acggtacaga tccgaccggc180aacggtacag atccgaccgg caacggtaca gatcccccta gcgaattgac tagttctcat240gtttgacagc ttatcatcga taagctttaa tgcggtagtt tagcacgaag gagtcaacat300gttagaagat ctcaaacgcc aggtattaga agccaacctg gcgctgccaa aacacaacct360ggtcacgctc acatggggca acgtcagcgc cgttgatcgc gagcgcggcg tctttgtgat420caaaccttcc ggc9tcgatt acagcgtcat gaccgctgac gatatggtcg tggttagcat480
cgaaaccggt gaagtggttg aaggtacgaa aaagccctcc tccgacacgc caactcaccg540gctgctctat caggcattcc cctccattgg cggcattgtg catacgcact cgcgccacgc600caccatctgg gcgcaggcgg gtcagtcgat tccagcaacc ggcaccaccc acgccgacta660tttctacggc accattccct gcacccgcaa aatgaccgac gcagaaatca acggcgaata720tgagtgggaa accggtaacg tcatcgtaga aacctttgaa aaacagggta tcgatgcagc780gcaaatgccc ggcgttctgg tccattccca cggcccgttt gcatggggca aaaatgccga840agatgcggtg cataacgcca tcgtgctgga agaggtcgct tatatgggga tattctgccg900tcagttagcg ccgcagttac cggatatgca gcaaacgctg ctggataaac actatctgcg960taagcatggc gcgaaggcat attacgggca gtaatgacag cccgcctaat gagcgggctt1020ttttttccat 1030<210>19<211>696<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>19atgttagaag atctcaaacg ccaggtatta gaagccaacc tggcgctgcc aaaacacaac60ctggtcacgc tcacatgggg caacgtcagc gccgttgatc gcgagcgcgg cgtctttgtg120atcaaacctt ccggcgtcga ttacagcgtc atgaccgctg acgatatggt cgtggttagc180atcgaaaccg gtgaagtggt tgaaggtacg aaaaagccct cctccgacac gccaactcac240cggctgctct atcaggcatt cccctccatt ggcggcattg tgcatacgca ctcgcgccac300gccaccatct gggcgcaggc gggtcagtcg attccagcaa ccggcaccac ccacgccgac360tatttctacg gcaccattcc ctgcacccgc aaaatgaccg acgcagaaat caacggcgaa420tatgagtggg aaaccggtaa cgtcatcgta gaaacctttg aaaaacaggg tatcgatgca480gcgcaaatgc ccggcgttct ggtccattcc cacggcccgt ttgcatgggg caaaaatgcc540gaagatgcgg tgcataacgc catcgtgctg gaagaggtcg cttatatggg gatattctgc600cgtcagttag cgccgcagtt accggatatg cagcaaacgc tgctggataa acactatctg660cgtaagcatg gcgcgaaggc atattacggg cagtaa 696<210>20<211>687<212>DNA
<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>20atgcaaaagc taaaacagca ggtatttgaa gccaacatgg agctgccgcg ctacgggctg60gtgaccttta cctggggcaa cgtcagcgct atcgaccgcg aacgcgggct ggtggtgatc120aagcccagcg gcgttgccta cgaaaccatg aaagcggccg atatggtggt ggttgatatg180agcggcaagg tggtggaagg ggagtatcgc ccatcttccg acactgcgac gcatctcgaa240ctctaccgtc gttacccgtc gcttggtggc attgtccata cccactccac tcatgccacc300gcatgggcgc aggcggggct ggcgatcccg gcgttaggca ccacgcacgc cgactacttc360tttggcgaca ttccgtgtac gcgcgggtta agcgaagaag aggtgcaggg cgagtatgaa420ctgaacaccg gcaaagtgat tatcgaaacg ctgggcaacg ccgagccgct gcatacgccg480ggaattgtgg tgtatcagca cgggccgttc gcctggggga aagatgctca cgatgcggtg540cataacgcgg tggtgatgga agaagtggcg aaaatggcgt ggattgcccg cggcattaac600ccacaactca atcacatcga cagcttcctg atgaataaac acttcatgcg taaacacggt660cctaacgctt attacgggca gaagtag687<210>21<211>65<212>DNA<213>人工的<400>21cagcaggtat ttgaagccaa catggagctg ccgcgctacg ggctggtgta ggctggagct60gcttc65<210>22<211>66<212>DNA<213>人工的<400>22aaacggctgc ggaattagac cagttatctc ccgaggaagg aaattaattc cggggatccg60tcgacc 66<210>23
<211>21<212>DNA<213>人工的<400>23aaacggctgc ggaattagac c 21<210>24<211>24<212>DNA<213>人工的<400>24gccgtacctg attgagatgt ggag 24<210>25<211>696<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>25atgttagagc aactgaaagc cgacgtgctg gcggcgaatc tggcgcttcc cgctcaccat60ctggtgacgt tcacctgggg caatgtcagc gcggtagacg aaacgcggca atggatggta120atcaaacctt ccggcgtcga gtacgacgtg atgaccgccg acgatatggt ggtggttgag180atagccagcg gtaaggtggt ggaaggcagc aaaaaaccct cttccgatac accaacgcat240ctggcgctct accgtcgcta tgccgaaatt ggcggtattg tgcataccca ctcgcgccac300gccaccatct ggtcacaggc cgggctggat ctccccgcct ggggcaccac ccacgccgat360tatttttacg gtgccatccc ctgcacgcga cagatgaccg cagaggagat taacggcgaa420tatgaatatc agaccggcga agtgatcatt gaaaccttcg aagaacgtgg caggagtccg480gcacaaatcc cggcggtgct ggtgcattct cacggcccgt tcgcatgggg taaaaacgcc540gccgatgccg tgcataacgc cgtagtactc gaagaatgcg cctatatggg tctattctcg600cgccagcttg cgccgcagct ccctgcgatg caaaacgaac tgctggataa gcactacctg660cgtaagcatg gggccaatgc ctattacggg cagtaa 696<210>26
<211>67<212>DNA<213>人工的<400>26cgttacagca aggaacatat caattcgtag tgccggggcg atgaagaatt ccggggatcc60gtcgacc 67<210>27<211>65<212>DNA<213>人工的<400>27gcaggaggct ggatttatat gttagagcaa ctgaaagccg acgtggtgta ggctggagct60gcttc65<210>28<211>24<212>DNA<213>人工的<400>28cggcgttaca gcaaggaaca tatc 24<210>29<211>22<212>DNA<213>人工的<400>29attgaagcgc gtatgcagga gg 2權(quán)利要求
1.一種選擇系統(tǒng)，其包括araD基因缺陷的細(xì)菌細(xì)胞，將攜帶araD基因、其互補(bǔ)序列或其催化活性片段的載體添加到所述細(xì)胞中作為選擇標(biāo)志物。
2.按照權(quán)利要求1的選擇系統(tǒng)，其中所述araD基因是L-5-磷酸核酮糖4差向異構(gòu)酶基因(EC 5.1.3.4.)。
3.按照權(quán)利要求1的選擇系統(tǒng)，其中所述araD基因是突變的。
4.按照權(quán)利要求3的選擇系統(tǒng)，其中所述突變將終止密碼子引入所述araD基因的位點(diǎn)8中。
5.按照權(quán)利要求1的選擇系統(tǒng)，其中所述細(xì)菌細(xì)胞是大腸桿菌(Escherichia coli)細(xì)胞。
6.按照權(quán)利要求5的選擇系統(tǒng)，其中所述大腸桿菌是大腸桿菌菌株JM109。
7.按照權(quán)利要求5的選擇系統(tǒng)，其中所述大腸桿菌是大腸桿菌菌株DH5α。
8.一種載體，其包含作為選擇標(biāo)志物的araD基因，其互補(bǔ)序列或其催化活性片段。
9.按照權(quán)利要求8的載體，其中所述載體是表達(dá)載體，其包括(a)與異源啟動(dòng)子操作性連接的編碼核錨定蛋白的DNA序列，所述核錨定蛋白包含(i)結(jié)合特異性DNA序列的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和(ii)結(jié)合核組分的功能性結(jié)構(gòu)域，或它們的功能等同物；和(b)形成所述核錨定蛋白結(jié)合位點(diǎn)的多聚的DNA序列，其中所述載體缺失乳頭狀瘤病毒復(fù)制起點(diǎn)，和(c)作為選擇標(biāo)志物的araD基因、其互補(bǔ)序列或其催化活性片段。
10.按照權(quán)利要求9的載體，其中所述載體是表達(dá)載體，其包括(a)與異源啟動(dòng)子操作性連接的編碼核錨定蛋白的DNA序列，其中所述核錨定蛋白是1型牛乳頭狀瘤病毒(BPV)的E2蛋白，和(b)形成所述核錨定蛋白結(jié)合位點(diǎn)的多聚的DNA序列，是作為簇結(jié)合入載體中的BPV E2蛋白的多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其中所述位點(diǎn)可以是頭-尾結(jié)構(gòu)或者可以通過(guò)間隔定位包括入載體中，其中所述載體缺失乳頭狀瘤病毒復(fù)制起點(diǎn)，和(c)作為選擇標(biāo)志物的araD基因、araD基因的突變形式、其互補(bǔ)序列或其催化活性片段。
11.權(quán)利要求10的載體，其另外包含在多聚的DNA序列中的缺失。
12.權(quán)利要求10的載體，其另外包含在SD序列中的突變。
13.araD基因缺陷型的大腸桿菌菌株AG1。
14.araD基因缺陷型的大腸桿菌菌株JM 109。
15.araD基因缺陷型的大腸桿菌菌株DH5α-T1。
16.araD基因和ulaF基因缺陷型的大腸桿菌菌株DH5α-T1。
17.araD基因和sgbE基因缺陷型的大腸桿菌菌株DH5α-T1。
18.araD基因，ulaF基因和sgbE基因缺陷型的大腸桿菌菌株DH5α-T1。
19.araD基因和ulaF基因缺陷型的大腸桿菌菌株AG1。
20.araD基因和sgbE基因缺陷型的大腸桿菌菌株AG1。
21.araD基因，ulaF基因和sgbE基因缺陷型的大腸桿菌菌株AG1。
22.一種選擇用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的方法，所述質(zhì)粒包含作為選擇標(biāo)志物的araD基因、其互補(bǔ)序列或其催化活性片段和目標(biāo)基因，所述方法包括將所述質(zhì)粒插入到araD缺陷的宿主細(xì)胞中并且在含有阿拉伯糖的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述araD基因是L-5-磷酸核酮糖4差向異構(gòu)酶基因(EC 5.1.3.4.)。
24.權(quán)利要求22的方法，其中所述araD基因是突變的。
全文摘要
一種不含抗生素抗性基因的選擇系統(tǒng)，其基于在載體上攜帶的作為選擇標(biāo)志物的araD基因的使用，所述載體被插入araD基因缺陷型的細(xì)菌菌株中。來(lái)自大腸桿菌的araD基因編碼L－5－磷酸核酮糖－4－差向異構(gòu)酶。一種選擇被質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)胞的方法，所述質(zhì)粒包含araD基因。非抗生素選擇標(biāo)志物使所述系統(tǒng)適合于產(chǎn)生治療劑。所述araD基因?qū)τ谒拗鞯纳L(zhǎng)不是必需的，但是對(duì)其的處理在某些選擇性條件下影響生長(zhǎng)。araD的缺失導(dǎo)致對(duì)于宿主具有毒性而對(duì)于人沒(méi)有毒性的物質(zhì)的積累。所述araD基因是相對(duì)小的并且因此可以構(gòu)建小質(zhì)粒，其需要更少的能量進(jìn)行復(fù)制，并導(dǎo)致生長(zhǎng)率和產(chǎn)量的增加。
文檔編號(hào)C12N15/61GK1882692SQ200480033694
公開(kāi)日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2004年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月15日
發(fā)明者T·滕森, S·拉特, M·阿多亞恩, A·門尼克, U·托茨, M·烏斯塔夫 申請(qǐng)人:非特生物技術(shù)有限責(zé)任公司