細(xì)胞培養(yǎng)方法和系統(tǒng)的制作方法
【專利說明】 細(xì)胞培養(yǎng)方法和系統(tǒng)
[0001]發(fā)明目的
[0002]本發(fā)明包括用于細(xì)胞培養(yǎng)的自動化設(shè)備(device)。本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)方法和系統(tǒng)，其允許以控制的方式來更改培養(yǎng)物中細(xì)胞的密度和數(shù)量。具體地，本發(fā)明涉及一種迭代方法，其迭代步驟的數(shù)量根據(jù)對培養(yǎng)期間必需的細(xì)胞密度和數(shù)量的需求而而更改。
[0003]發(fā)明背景
[0004]可以在現(xiàn)有技術(shù)水平中找到由公司諸如Caridian BCT、PAN-systech制造的自動化生物反應(yīng)器，或者通用電氣公司的“波動生物反應(yīng)器(wave b1reator) ”。
[0005]PAN-systech公司的國際專利申請WO 2010/121601 A2示出了用于多孔細(xì)胞培養(yǎng)的自動生物反應(yīng)器。
[0006]然而，在現(xiàn)有技術(shù)水平中已知的設(shè)備和方法存在在某種意義上不夠靈活的技術(shù)問題:它們不允許根據(jù)需要在一個(gè)和同一生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行多重細(xì)胞擴(kuò)增(multiples cellexpans1ns)，導(dǎo)致當(dāng)進(jìn)展到擴(kuò)增過程時(shí)不能控制和準(zhǔn)確更改細(xì)胞密度以及細(xì)胞的總數(shù)量，并且導(dǎo)致其中可以進(jìn)行工作的狹窄數(shù)值范圍。
[0007]這些限制使得用于細(xì)胞療法的生物反應(yīng)器的應(yīng)用極其復(fù)雜。
[0008]發(fā)明描述
[0009]已經(jīng)開發(fā)了根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞培養(yǎng)方法和根據(jù)權(quán)利要求10的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)以解決現(xiàn)有技術(shù)水平中考慮的問題。從屬權(quán)利要求對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行了限定。本發(fā)明的第一創(chuàng)造性方面包括所提到的細(xì)胞培養(yǎng)方法，并且特征在于其在這樣的系統(tǒng)中實(shí)施，所述系統(tǒng)包括:
[0010].至少一個(gè)適于培養(yǎng)細(xì)胞的設(shè)備(device)，該設(shè)備包括:
[0011]V至少一個(gè)生物反應(yīng)器室，其包括至少一個(gè)適于細(xì)胞培養(yǎng)的內(nèi)表面，
[0012]V流體入口 -出口裝置(means)，和
[0013]V與至少一個(gè)生物反應(yīng)器室連接的至少一個(gè)前室，其包括用于引入細(xì)胞的入口，
[0014]并且特征在于，其包括下列步驟:
[0015]a)在最初的物化條件下以預(yù)先確定的液體量用培養(yǎng)基填充前室，
[0016]b)通過用于引入前室細(xì)胞的細(xì)胞入口將細(xì)胞引入，
[0017]c)將具有細(xì)胞的培養(yǎng)基傳送至至少一個(gè)生物反應(yīng)器室，
[0018]d)使細(xì)胞沉降并且使它們靜置預(yù)定的時(shí)間，直到它們附著到至少一個(gè)適于細(xì)胞培養(yǎng)的內(nèi)表面，所述內(nèi)表面的物化性質(zhì)使其以在一個(gè)或幾個(gè)最初物化條件下有利于細(xì)胞附著的方式起作用，
[0019]e)通過設(shè)備和流體入口 -出口裝置循環(huán)培養(yǎng)基，
[0020]f) 一旦獲得細(xì)胞的目標(biāo)數(shù)量或者在至少一個(gè)用于培養(yǎng)的生物反應(yīng)器室中達(dá)到臨界密度，則將培養(yǎng)基的至少一個(gè)最初物化條件改變?yōu)楦牡奈锘瘲l件，在該條件下細(xì)胞附著被阻止，以使在更改的物化條件下設(shè)備內(nèi)剩余的量位于已用于細(xì)胞擴(kuò)增的生物反應(yīng)器室，
[0021]g)將具有細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至前室，和
[0022]如果已經(jīng)達(dá)到細(xì)胞的目標(biāo)數(shù)量，則通過出口裝置將額外量的培養(yǎng)基引入前室并且將具有懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)基抽出，或者
[0023]如果沒有達(dá)到細(xì)胞的目標(biāo)數(shù)量，則將額外的培養(yǎng)基引入前室中并從步驟c)開始重復(fù)步驟。
[0024]本發(fā)明方法的目的是為了允許以控制的方式來更改培養(yǎng)物中細(xì)胞的密度和數(shù)量。具體地，本發(fā)明涉及這樣的迭代方法，其迭代步驟的數(shù)量根據(jù)對培養(yǎng)期間必需的細(xì)胞密度和數(shù)量的需求而被更改。
[0025]具體地，該迭代方法以在設(shè)備的前室中引入培養(yǎng)基開始，以使培養(yǎng)基從至少一個(gè)生物反應(yīng)器室中分離。然后將擴(kuò)增的細(xì)胞對象引入，并隨后通過前室與室之間的連接將由培養(yǎng)基和細(xì)胞形成的全部混合物轉(zhuǎn)移至至少一個(gè)培養(yǎng)室。貫穿此文件，術(shù)語“細(xì)胞擴(kuò)增”和“細(xì)胞培養(yǎng)”被理解為同義詞。另一方面，當(dāng)提到的是物化條件時(shí)，則指的是至少一個(gè)參數(shù)的具體條件，如溫度、pH水平或者鹽濃度等。
[0026]為了成功地進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增過程，使細(xì)胞附著至細(xì)胞分裂過程開始的表面是方便的。為此，方法的下一個(gè)步驟包括使細(xì)胞停留(stand)，以便它們附著到在至少一個(gè)適于細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器室中設(shè)備內(nèi)表面。該表面適合于根據(jù)最初物化條件中的至少一個(gè)數(shù)值，例如:溫度、PH或鹽濃度對于改變其細(xì)胞附著的適應(yīng)性，是因?yàn)槠渲苽涞牟牧系男再|(zhì)，或者因?yàn)檫@樣的事實(shí):其用凝膠或者產(chǎn)物覆蓋，性質(zhì)隨著至少一個(gè)所選的最初物化條件，例如溫度而改變。選擇培養(yǎng)基的至少一個(gè)最初物化條件，例如，第一溫度Tl，以便在該溫度下內(nèi)表面的特性使其允許細(xì)胞附著。
[0027]當(dāng)細(xì)胞已附著至表面時(shí)，在最初的物化條件下開始培養(yǎng)基的連續(xù)流動。該連續(xù)流動以連續(xù)的和更新的方式為細(xì)胞提供了必需的營養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸和維生素，以使生長速率是恒定并且最優(yōu)的。因此，進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增直到獲得特定的細(xì)胞密度或者細(xì)胞的目標(biāo)數(shù)量，其中培養(yǎng)的質(zhì)量不是所必須的。
[0028]—旦已經(jīng)獲得細(xì)胞的該密度或該目標(biāo)數(shù)量，則將培養(yǎng)基的最初物化條件中的至少一個(gè)改變?yōu)楦牡奈锘瘲l件，為了使適于細(xì)胞培養(yǎng)的表面具有允許細(xì)胞再次在培養(yǎng)基中懸浮的物化特性。
[0029]在非限制性實(shí)施方式中，改變至少一個(gè)物化條件的方法是在溫度Tl下將培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器室排空，然后在溫度T2下用培養(yǎng)基將含有細(xì)胞的培養(yǎng)室充滿。在具體的實(shí)施例中，在更改的物化條件下引入到每個(gè)室中的培養(yǎng)基的量是在過程開始時(shí)引入到每個(gè)室中的量。因而，在這些更改的物化條件下的細(xì)胞從適于細(xì)胞附著的表面脫離。然后，將具有懸浮細(xì)胞的液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至前室。
[0030]一旦在更改的物化條件下的液體培養(yǎng)基和懸浮細(xì)胞處于前室中，則有兩種選擇:
[0031].需要大量的細(xì)胞，在這種情況下更多的培養(yǎng)基被添加至前室，并且從步驟c)開始重復(fù)所有的步驟直到達(dá)到細(xì)胞的目標(biāo)數(shù)量，或者
[0032].已經(jīng)達(dá)到細(xì)胞的目標(biāo)數(shù)量，在這種情況下具有懸浮細(xì)胞的液體培養(yǎng)基從前室提取出。
[0033]所述方法提供了能夠在整個(gè)方法中控制所要求的細(xì)胞的體內(nèi)數(shù)量的技術(shù)優(yōu)勢和隨后能夠根據(jù)所應(yīng)用方法的要求更改細(xì)胞的最終目標(biāo)數(shù)量的多功能性。
[0034]在第二個(gè)創(chuàng)造性方面，本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其包括:
[0035].至少一個(gè)適于培養(yǎng)細(xì)胞的設(shè)備，該設(shè)備包括:
[0036]V至少一個(gè)生物反應(yīng)器室，其包括至少一個(gè)適于細(xì)胞培養(yǎng)的內(nèi)表面，
[0037]V流體入口 -出口裝置，
[0038]V與至少一個(gè)生物反應(yīng)器室連接的至少一個(gè)前室，其包括用于引入細(xì)胞的入口。
[0039]系統(tǒng)還能夠以通用方式用于不同的用途，例如，通過交換可拆卸的設(shè)備一一其中的每一個(gè)都適于其進(jìn)行的工作的類型一一用于細(xì)胞重編程序或者細(xì)胞擴(kuò)增。
[0040]說明書(包括權(quán)利要求書、說明書和附圖)中描述的所有特征都能夠以任意組合方式進(jìn)行組合，除了此類相互排斥的特征的組合。
【附圖說明】
[0041]為了補(bǔ)充將在下面做出的說明并且為了根據(jù)其優(yōu)選的實(shí)踐實(shí)施方式來幫助更好地理解本發(fā)明的特征，附上一組附圖作為所述說明的組成部分，在其中以說明性和非限制性特征描述了下述:
[0042]圖1顯示根據(jù)本發(fā)明所述的系統(tǒng)的實(shí)施方式。
[0043]圖2.1,2.2、2.3和2.4顯示根據(jù)應(yīng)用于系統(tǒng)的具體實(shí)例的發(fā)明的方法的步驟順序的具體實(shí)例。
[0044]圖3顯示具有用于細(xì)胞附著(39)的額外表面的生物反應(yīng)器室(2)的具體實(shí)例。
[0045]發(fā)曰月詳沐
[0046]細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)
[0047]由本發(fā)明提出的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是這樣的系統(tǒng)，其包括:
[0048].至少一個(gè)適于培養(yǎng)細(xì)胞的設(shè)備(I)，該設(shè)備(I)包括:
[0049]V至少一個(gè)生物反應(yīng)器室(2)，其包括至少一個(gè)適于細(xì)胞培養(yǎng)的內(nèi)表面(22、3、39)，
[0050]V 流體入口 -出口裝置(13、14、15、17、18、19、23、24)，
[0051]V與至少一個(gè)生物反應(yīng)器室(2)連接的至少一個(gè)前室(4)，其包括用于引入細(xì)胞的入口(5)。
[0052]該培養(yǎng)基包含在用于包含細(xì)胞培養(yǎng)基的室(7)中，所述室(7)維持在期望的壓力條件、溫度條件、PH條件、氧水平和二氧化碳水平。為此，在一個(gè)實(shí)施方式中，用于包含培養(yǎng)基的室(7)被提供有用于這些條件的傳感器并且被連接至控制壓力的氧氣瓶、二氧化碳瓶、NaOH分配器、氮?dú)馄?所有這些連接都通過它們對應(yīng)的閥)并且，在具體實(shí)例中，連接至允許改變溫度一一實(shí)施例中的具體物化條件一一的熱交換器(11)。