一種艾滋病抗原檢測(cè)芯片制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種制備方法，尤其涉及一種艾滋病抗原檢測(cè)芯片制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，艾滋病的診斷方法有病毒檢測(cè)和抗體檢測(cè)兩大類。病毒檢測(cè)是診斷艾滋病的重要方法，由于艾滋病感染者，首先在體內(nèi)出現(xiàn)的是艾滋病病毒，只有過一段時(shí)間后再在體內(nèi)產(chǎn)生抗體，因此，病毒檢測(cè)是實(shí)現(xiàn)對(duì)HIV的早期診斷的有效方法。病毒檢測(cè)包括細(xì)胞培養(yǎng)(病毒分離)、抗原檢測(cè)和病毒核酸檢測(cè)。其中細(xì)胞培養(yǎng)的方法專一性強(qiáng)，但因?yàn)楸仨氂幸欢〝?shù)量的感染細(xì)胞存在才能培養(yǎng)和分離出病毒來，因而敏感性較差，而且操作時(shí)間長，操作復(fù)雜，不適用于臨床的快速檢測(cè)。核酸序列擴(kuò)增反應(yīng)既可擴(kuò)增RNA又可擴(kuò)增DNA，因此，病毒核酸檢測(cè)方法有較高的靈敏度，可用于艾滋病的早期診斷，但其最大的缺點(diǎn)是檢測(cè)的試劑與儀器昂貴，而且操作復(fù)雜、耗時(shí)長，難以在一般實(shí)驗(yàn)室推廣，不適合于對(duì)大量病人的快速檢測(cè)。P24抗原檢測(cè)是診斷艾滋病的一個(gè)有效方法，通常采用免疫分析方法進(jìn)行檢測(cè)，相對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)和病毒核酸檢測(cè)，該方法既達(dá)到早期檢測(cè)的目的，又操作簡單、快速、對(duì)試劑與儀器要求不高，成本低，容易推廣。而如果采用新型稀土熒光納米粒子作標(biāo)記物，通過蛋白質(zhì)芯片和時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)，則既能達(dá)到高靈敏度，又能達(dá)到高通量與快速檢測(cè)之效果。
[0003]國際國內(nèi)對(duì)p24抗原的檢測(cè)均采用ELISA方法的原理，即采用抗原-抗體高特異性免疫反應(yīng)的方法實(shí)現(xiàn)P24抗原的檢測(cè)，使用的標(biāo)記物為傳統(tǒng)的發(fā)射性同位素、酶、有機(jī)熒光染料、稀土配合物、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等，檢測(cè)用的載體材料多采用96孔板。這些方法在一定程度上能實(shí)現(xiàn)對(duì)HIV p24抗原的檢測(cè)，但存在的缺點(diǎn)明顯:一是由于使用的標(biāo)記物為傳統(tǒng)的標(biāo)記物，檢測(cè)靈敏度受到一定限制；二是由于通常都是在96孔板上或試紙條(卡)上進(jìn)行，因而不能實(shí)現(xiàn)高通量化，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)大量患者群體的高通量快速檢測(cè)，如對(duì)疫情較嚴(yán)重地區(qū)患者人群的HIV普查、監(jiān)測(cè)和獻(xiàn)血血源篩查等，而且試劑消耗量很大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就在于為了解決上述問題而提供一種艾滋病抗原檢測(cè)芯片制備方法。
[0005]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)上述目的:
[0006]本發(fā)明包括以下步驟:
[0007]步驟一，合成新型核殼型二氧化硅熒光納米粒子；
[0008]步驟二，標(biāo)記鏈親和素；
[0009]步驟三，制備基于檢測(cè)HIV p24抗原檢測(cè)的蛋白質(zhì)芯片。
[0010]根據(jù)步驟一，合成原料包括表面活性劑、助表面活性劑、環(huán)己烷和硝酸銀水溶液，將合成原料混合成微乳液，加入還原劑，將Ag+還原為單質(zhì)Ag，然后加入正硅酸乙酯與氨水使發(fā)生聚合反應(yīng)，在納米銀表面就包覆一層S12，加入帶有螯合基團(tuán)配位體的試劑，反應(yīng)后分尚出納米粒子，再將該納米粒子分散到Eu3+或Eu3+與Tb3+水溶液中充分反應(yīng),將納米粒子離心、洗滌、干燥即得到最終所需要的納米粒子。
[0011]進(jìn)一步，所述納米粒子中核為Ag核，殼為S12，發(fā)光來源于稀土配合物，Ag核對(duì)稀土配合物發(fā)光具有金屬增強(qiáng)熒光效應(yīng)。
[0012]進(jìn)一步，根據(jù)步驟二，采用戊二醛交聯(lián)法標(biāo)記鏈親和素。
[0013]進(jìn)一步，根據(jù)步驟三，所述芯片擬采用醛基或巰基修飾的玻片做片基，采用夾心法引入生物素鏈親和素放大系統(tǒng)，對(duì)P24抗原的分析擬采用兩株配對(duì)的抗p24單克隆抗體，或一種為單抗，另一種為多抗，其中一株抗體通過點(diǎn)樣固定在玻片上制成固相抗體，另一株抗體標(biāo)記生物素，在分析buffer中加入一種解離劑如甘氨酸與Tris-HCl混和試劑，以使血清中的p24從抗原-抗體復(fù)合物中解離出來，首先通過夾心法使待分析的p24抗原與芯片上的固定抗體及加入的與該抗體配對(duì)的標(biāo)記生物素的另一株單克抗體反應(yīng)，然后加入標(biāo)記鏈親和素的熒光納米粒子，利用生物素-鏈親和素高親和反應(yīng)，使熒光納米粒子固定到反應(yīng)復(fù)合物上，反應(yīng)完成后將芯片置于芯片掃描儀上掃描，測(cè)量熒光信號(hào)，獲取數(shù)據(jù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。
[0014]本發(fā)明的有益效果在于:
[0015]本發(fā)明依據(jù)抗原-抗體高特異性免疫反應(yīng)，采用稀土熒光納米粒子作標(biāo)記物來提高檢測(cè)信號(hào)和檢測(cè)靈敏度，在此基礎(chǔ)上制備微陳列蛋白質(zhì)芯片，這樣可以使用極少量的樣品，在極短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)大量病人高通量、高靈敏度和快速檢測(cè)，大大節(jié)省原料和人力物力和時(shí)間。
【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明所述的一種艾滋病抗原檢測(cè)芯片制備方法的流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明:
[0018]如圖1所示，本發(fā)明包括以下步驟:
[0019]步驟一，合成新型核殼型二氧化硅熒光納米粒子，合成原料包括表面活性劑、助表面活性劑、環(huán)己烷和硝酸銀水溶液，將合成原料混合成微乳液，加入還原劑，將Ag+還原為單質(zhì)Ag,然后加入正娃酸乙酯與氨水使發(fā)生聚合反應(yīng),在納米銀表面就包覆一層S12,加入帶有螯合基團(tuán)配位體的試劑，反應(yīng)后分離出納米粒子，再將該納米粒子分散到Eu3+或Eu3+與Tb3+水溶液中充分反應(yīng)，將納米粒子離心、洗滌、干燥即得到最終所需要的納米粒子，所述納米粒子中核為Ag核,殼為S12,發(fā)光來源于稀土配合物,Ag核對(duì)稀土配合物發(fā)光具有金屬增強(qiáng)熒光效應(yīng)；
[0020]步驟二，采用戊二醛交聯(lián)法標(biāo)記鏈親和素；
[0021 ] 步驟三，制備基于檢測(cè)HIV p24抗原檢測(cè)的蛋白質(zhì)芯片，所述芯片擬采用醛基或巰基修飾的玻片做片基，采用夾心法引入生物素鏈親和素放大系統(tǒng)，對(duì)P24抗原的分析擬采用兩株配對(duì)的抗p24單克隆抗體，或一種為單抗，另一種為多抗，其中一株抗體通過點(diǎn)樣固定在玻片上制成固相抗體，另一株抗體標(biāo)記生物素，在分析buffer中加入一種解離劑如甘氨酸與Tris-HCl混和試劑，以使血清中的p24從抗原-抗體復(fù)合物中解離出來，首先通過夾心法使待分析的P24抗原與芯片上的固定抗體及加入的與該抗體配對(duì)的標(biāo)記生物素的另一株單克抗體反應(yīng)，然后加入標(biāo)記鏈親和素的熒光納米粒子，利用生物素-鏈親和素高親和反應(yīng)，使熒光納米粒子固定到反應(yīng)復(fù)合物上，反應(yīng)完成后將芯片置于芯片掃描儀上掃描，測(cè)量熒光信號(hào)，獲取數(shù)據(jù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。
[0022]本領(lǐng)域技術(shù)人員不脫離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和精神，可以有多種變形方案實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，以上所述僅為本發(fā)明較佳可行的實(shí)施例而已，并非因此局限本發(fā)明的權(quán)利范圍，凡運(yùn)用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)變化，均包含于本發(fā)明的權(quán)利范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種艾滋病抗原檢測(cè)芯片制備方法，其特征在于:包括以下步驟: 步驟一，合成新型核殼型二氧化娃突光納米粒子； 步驟二，標(biāo)記鏈親和素； 步驟三，制備基于檢測(cè)HIV P24抗原檢測(cè)的蛋白質(zhì)芯片。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種艾滋病抗原檢測(cè)芯片制備方法，其特征在于:根據(jù)步驟一，合成原料包括表面活性劑、助表面活性劑、環(huán)己烷和硝酸銀水溶液，將合成原料混合成微乳液，加入還原劑，將Ag+還原為單質(zhì)Ag，然后加入正硅酸乙酯與氨水使發(fā)生聚合反應(yīng)，在納米銀表面就包覆一層S12，加入帶有螯合基團(tuán)配位體的試劑，反應(yīng)后分離出納米粒子，再將該納米粒子分散到Eu3+或Eu3+與Tb3+水溶液中充分反應(yīng)，將納米粒子離心、洗滌、干燥即得到最終所需要的納米粒子。3.根據(jù)權(quán)利要求2或所述的一種艾滋病抗原檢測(cè)芯片制備方法，其特征在于:所述納米粒子中核為Ag核,殼為S12,發(fā)光來源于稀土配合物，Ag核對(duì)稀土配合物發(fā)光具有金屬增強(qiáng)熒光效應(yīng)。4.根據(jù)權(quán)利要求1或所述的一種艾滋病抗原檢測(cè)芯片制備方法，其特征在于:根據(jù)步驟二，采用戊二醛交聯(lián)法標(biāo)記鏈親和素。5.根據(jù)權(quán)利要求4或所述的一種艾滋病抗原檢測(cè)芯片制備方法，其特征在于:根據(jù)步驟三，所述芯片擬采用醛基或巰基修飾的玻片做片基，采用夾心法引入生物素鏈親和素放大系統(tǒng)，對(duì)p24抗原的分析擬采用兩株配對(duì)的抗p24單克隆抗體，或一種為單抗，另一種為多抗，其中一株抗體通過點(diǎn)樣固定在玻片上制成固相抗體，另一株抗體標(biāo)記生物素，在分析buffer中加入一種解離劑如甘氨酸與Tris-HCl混和試劑，以使血清中的p24從抗原-抗體復(fù)合物中解離出來，首先通過夾心法使待分析的P24抗原與芯片上的固定抗體及加入的與該抗體配對(duì)的標(biāo)記生物素的另一株單克抗體反應(yīng)，然后加入標(biāo)記鏈親和素的熒光納米粒子，利用生物素-鏈親和素高親和反應(yīng)，使熒光納米粒子固定到反應(yīng)復(fù)合物上，反應(yīng)完成后將芯片置于芯片掃描儀上掃描，測(cè)量熒光信號(hào)，獲取數(shù)據(jù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種艾滋病抗原檢測(cè)芯片制備方法，包括以下步驟：步驟一，合成新型核殼型二氧化硅熒光納米粒子；步驟二，標(biāo)記鏈親和素；步驟三，制備基于檢測(cè)HIV p24抗原檢測(cè)的蛋白質(zhì)芯片。本發(fā)明依據(jù)抗原-抗體高特異性免疫反應(yīng)，采用稀土熒光納米粒子作標(biāo)記物來提高檢測(cè)信號(hào)和檢測(cè)靈敏度，在此基礎(chǔ)上制備微陳列蛋白質(zhì)芯片，這樣可以使用極少量的樣品，在極短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)大量病人高通量、高靈敏度和快速檢測(cè)，大大節(jié)省原料和人力物力和時(shí)間。
【IPC分類】G01N33/68
【公開號(hào)】CN104977413
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410127560
【發(fā)明人】戴天巖
【申請(qǐng)人】蟲洞(北京)衛(wèi)生科技有限公司
【公開日】2015年10月14日
【申請(qǐng)日】2014年4月1日