專利名稱：從發(fā)酵液中純化琥珀酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從積累琥珀酸的鹽的發(fā)酵液中純化琥珀酸的技術(shù)。
背景技術(shù)：
近年來，琥珀酸作為生物可降解聚合物的原料而引起人們的注意。而且，琥珀酸作為4-碳中間體被廣泛用作特殊化學(xué)產(chǎn)品的原料。為了使用琥珀酸作為生物可降解聚合物和特殊化學(xué)產(chǎn)品的原料，需要以低成本產(chǎn)生高純度的琥珀酸。這是因?yàn)樵乡晁嶂泻械碾s質(zhì)可抑制由琥珀酸產(chǎn)生最終產(chǎn)品的反應(yīng)或降低所述最終產(chǎn)品的質(zhì)量。
因此，為了通過發(fā)酵或酶法產(chǎn)生琥珀酸用作聚合物或特殊化學(xué)產(chǎn)品的原料，需要有效地從含有大量雜質(zhì)的發(fā)酵液或酶反應(yīng)混合物中除去雜質(zhì)并以低成本產(chǎn)生琥珀酸。
在通過發(fā)酵或酶法產(chǎn)生琥珀酸的過程中，通常將反荷離子(counter ion)加入培養(yǎng)基或酶反應(yīng)溶液以保持最適pH。因此，琥珀酸常常以鹽的形式存在于積累琥珀酸的培養(yǎng)液或酶反應(yīng)混合物中。因此，為了產(chǎn)生高純度的琥珀酸，必須除去加入所述發(fā)酵培養(yǎng)基或酶反應(yīng)溶液的反荷離子。此外，所述發(fā)酵液含有大量的雜質(zhì)如其他有機(jī)酸和氨基酸，而這些雜質(zhì)也需要被有效地去除。
作為產(chǎn)生高純度琥珀酸的方法，到目前為止已經(jīng)報(bào)道了使用離子交換樹脂的方法，使用琥珀酸的難溶鹽的方法，使用電滲析(electrodialysis)的方法等等。
使用離子交換樹脂的方法概略地分類為使用陰離子交換樹脂的方法和使用弱酸性陽離子交換樹脂的方法。
作為使用陰離子交換樹脂的方法，已經(jīng)報(bào)道了包括將含有琥珀酸的鹽的原料液體與陰離子交換樹脂進(jìn)行接觸以允許所述樹脂吸附琥珀酸，然后用有機(jī)溶劑，氨水等洗脫琥珀酸的方法(參考專利文獻(xiàn)1和2)。然而，在此方法中，必須除去并收集所述洗脫物中包含的有機(jī)溶劑或堿如氨，而這使所述過程變得復(fù)雜。
此外，已經(jīng)報(bào)道了包括使陽離子交換樹脂吸附琥珀酸的反荷離子并收集琥珀酸作為通流溶液(through-flow solution)的方法(參考專利文獻(xiàn)3)。然而，此方法遇到這樣的問題，由于所使用的離子交換樹脂是弱酸性的陽離子交換樹脂，所述原料液體中琥珀酸的反荷離子限制為氨，該方法不能應(yīng)用于具有其他反荷離子的琥珀酸的鹽。
作為使用琥珀酸的難溶鹽的方法，已知包括將鈣離子加入含有琥珀酸的鹽的原料液體和收集琥珀酸鈣作為沉淀的方法(專利文獻(xiàn)4)。然而，此方法遇到這樣的問題，在從所述沉淀中除去鈣時(shí)產(chǎn)生的副-產(chǎn)物鈣鹽的去除是復(fù)雜的。
專利文獻(xiàn)5和6公開了使用電滲析的方法。然而，這些方法遇到這樣的問題，難以除去所述原料液體中包含的其他有機(jī)酸(乙酸)，因?yàn)樗@示與琥珀酸相同的行為。
同時(shí)，作為從含有有機(jī)酸的水溶液中收集有機(jī)酸如琥珀酸的方法，已經(jīng)報(bào)道了通過使用H-型離子交換樹脂將水溶液中氫離子濃度調(diào)節(jié)到結(jié)合有機(jī)酸的陰離子所需的水平或更高的方法(專利文獻(xiàn)7)。該文獻(xiàn)描述了在此方法中，當(dāng)將氫離子的濃度調(diào)節(jié)到結(jié)合有機(jī)酸的陰離子所需的水平時(shí)，優(yōu)選比所述相當(dāng)物濃度高1％至大約10％的濃度。然而，即使將氫離子的濃度調(diào)節(jié)到這樣的濃度，也難以基本上完全地除去發(fā)酵液中含有的作為琥珀酸的反荷離子的陽離子，并因此出現(xiàn)琥珀酸純度降低的問題。
JP 62-238231A[專利文獻(xiàn)2]美國專利No.5,132,456[專利文獻(xiàn)3]JP 62-238232A[專利文獻(xiàn)4]JP 62-294090A[專利文獻(xiàn)5]JP 02-283289A[專利文獻(xiàn)6]JP 03-151884A[專利文獻(xiàn)7]WO01/66508發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供從積累琥珀酸的鹽的發(fā)酵液或酶反應(yīng)混合物中以高收率純化高純度的琥珀酸的方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了勤勉的研究。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)含琥珀酸的液體中的雜質(zhì)可通過將使用一定量或更多的H-型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂的離子交換與琥珀酸的結(jié)晶相結(jié)合而有效地去除，并由此能以高純度和良好的收率產(chǎn)生琥珀酸，并由此完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供了下列各項(xiàng)。
(1)從含琥珀酸的液體中純化琥珀酸的方法，所述含琥珀酸的液體中含有通過發(fā)酵或酶法獲得的陽離子，該方法包括將所述含琥珀酸的液體與H-型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂進(jìn)行接觸，所述樹脂的量等于或大于含琥珀酸的液體中包含的除氫離子之外的陽離子的量，和從得到的經(jīng)離子交換處理的液體中沉淀琥珀酸的晶體以得到純化的琥珀酸。
(2)(1)的方法，其中所述含琥珀酸的液體含有琥珀酸的鹽。
(3)(2)的方法，其中所述琥珀酸的鹽選自琥珀酸鈉、琥珀酸鉀、琥珀酸鎂、琥珀酸鈣和琥珀酸銨。
(4)(3)的方法，其中所述含琥珀酸的液體含有碳酸的鹽，并將酸加入所述含琥珀酸的液體以調(diào)節(jié)為pH 5.0或更低，然后與所述H-型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂進(jìn)行接觸。
(5)(4)的方法，其中所述經(jīng)離子交換處理的液體用作所述的酸。
(6)(4)的方法，其中已經(jīng)去除沉淀的琥珀酸的經(jīng)離子交換處理的液體用作所述的酸。
(7)產(chǎn)生琥珀酸的方法，其包括將微生物細(xì)胞或經(jīng)過處理的細(xì)菌細(xì)胞作用于含水反應(yīng)溶液中的有機(jī)原料以獲得含琥珀酸的液體，將所述含琥珀酸的液體與H-型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂進(jìn)行接觸，所述樹脂的量等于或大于含琥珀酸的液體中包含的除氫離子之外的陽離子的量，和從得到的經(jīng)離子交換處理的液體中沉淀琥珀酸的晶體以得到純化的琥珀酸。
(8)(7)的方法，其中所述含水反應(yīng)溶液用碳酸鎂或氫氧化鎂進(jìn)行中和。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的方法是從含琥珀酸的液體中純化琥珀酸的方法，所述含琥珀酸的液體含有通過發(fā)酵或酶法得到的陽離子，所述方法包括使所述含琥珀酸的液體與H-型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂進(jìn)行接觸，所述樹脂的量等于或大于含琥珀酸的液體中包含的除氫離子之外的陽離子的量，和從得到的經(jīng)離子交換處理的液體中沉淀琥珀酸的晶體以得到純化的琥珀酸。
以下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。
<1>制備含琥珀酸的液體對(duì)本發(fā)明應(yīng)用的含琥珀酸的液體無具體的限制，所述含琥珀酸的液體含有通過發(fā)酵或酶法得到的陽離子，只要它含有琥珀酸和除氫離子以外的陽離子。其具體實(shí)例包括含琥珀酸的發(fā)酵液和通過使用催化反應(yīng)以由碳源或琥珀酸合成的原料或中間體產(chǎn)生琥珀酸的細(xì)菌、經(jīng)過處理的細(xì)菌細(xì)胞和酶等等得到的反應(yīng)混合物。
所述含琥珀酸的液體優(yōu)選含有琥珀酸的鹽，優(yōu)選琥珀酸的中性鹽。所述鹽的具體實(shí)例包括琥珀酸鈉、琥珀酸鉀、琥珀酸鎂、琥珀酸鈣、琥珀酸銨等等。
對(duì)用于產(chǎn)生本發(fā)明的含琥珀酸的液體的方法無具體的限制，并例如，可應(yīng)用JP 05-68576A和JP11-196888A中描述的方法。具體地，含琥珀酸的液體可通過使屬于短桿菌屬(Brevibacterium)并具有琥珀酸-產(chǎn)生能力的細(xì)菌細(xì)胞或經(jīng)過處理的細(xì)菌細(xì)胞作用于含有有機(jī)原料如延胡索酸或其鹽的反應(yīng)水溶液來獲得。
上述的微生物的實(shí)例包括需氧的棒狀桿菌細(xì)菌如黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)MJ-233菌株、黃色短桿菌MJ-233-AB-41菌株等等。
所述黃色短桿菌MJ-233已于1975年4月28日保藏在國立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology)，工業(yè)科技機(jī)構(gòu)(Agency of Industrial Science and Technology)，國際貿(mào)易與工業(yè)部(Ministry of International Trade and Industry)(Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，日本)，并給以登記入藏號(hào)(accession number)FERM P-3068。然后在1981年5月1日根據(jù)布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)的規(guī)定轉(zhuǎn)為國際保藏物(intemational deposition)，并給以登記入藏號(hào)FERMBP-1497。所述MJ-233-AB-41菌株于1976年11月17日保藏在國立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科技機(jī)構(gòu)，國際貿(mào)易與工業(yè)部(Central 6，1-1，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，日本)，并給以登記入藏號(hào)FERMP-3812。然后，在1981年5月1日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定轉(zhuǎn)為國際保藏物，并給以登記入藏號(hào)FERM BP-1498。
用于本發(fā)明的微生物不具體地局限于屬于短桿菌屬的細(xì)菌，只要它產(chǎn)生琥珀酸。這樣的微生物的實(shí)例包括屬于假絲酵母屬(genus Candida)的微生物(JP 56-17077B)、產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)等。
可將還原的和/或氧化的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adeninedinucleotide)加入上述的反應(yīng)溶液。加入的濃度為0.1至50mM，優(yōu)選1至40mM。
可修飾所述微生物如需氧的棒狀桿菌細(xì)菌以使細(xì)胞內(nèi)的丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase)(PC)活性增加。例如，所述PC活性可通過用編碼PC的基因轉(zhuǎn)化微生物來增加。使用的所述PC基因的實(shí)例包括源自微生物、動(dòng)物或植物的基因，而且更具體地，源自人、小鼠、大鼠、酵母或?qū)儆诎魻顥U菌屬(Corynebacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、根瘤菌屬(Rhizobium)或埃希氏桿菌屬(Escherichia)的微生物的基因。獲取PC基因和導(dǎo)入所述PC基因的琥珀酸-產(chǎn)生細(xì)菌在JP 11-196888A中描述。此外，也預(yù)期所述的琥珀酸-產(chǎn)生能力通過增強(qiáng)微生物的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenol pyruvatecarboxylase)活性來提高(JP 07-83714B、JP 09-121872A)。
所述的PC基因和含有該基因的質(zhì)粒的具體實(shí)例包括pPC-PYC2和此質(zhì)粒中含有的PC基因(PYC2)，其源自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)如JP11-196888A中所述。也可以使用源自釀酒酵母的其他PC基因(PYC1)。
當(dāng)使用需氧的棒狀桿菌細(xì)菌，尤其是，導(dǎo)入所述PC基因的細(xì)菌，而且允許這樣的細(xì)菌或其經(jīng)過處理的細(xì)胞作用于含有有機(jī)原料的含水反應(yīng)溶液時(shí)，所述反應(yīng)溶液優(yōu)選含有碳酸根離子、碳酸氫根離子或二氧化碳?xì)?。此外，此反?yīng)更優(yōu)選在厭氧條件下進(jìn)行。
為了將需氧的棒狀桿菌細(xì)菌用于本發(fā)明的方法中，可在通常的需氧條件下培養(yǎng)之后使用細(xì)菌細(xì)胞。作為用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可采用用于微生物常規(guī)培養(yǎng)的培養(yǎng)基。例如，可以使用通過將天然營養(yǎng)物如肉浸出物、酵母提取物和蛋白胨加入包含無機(jī)鹽如硫酸銨、磷酸鉀和硫酸鎂的組合物得到的普通培養(yǎng)基。
培養(yǎng)之后，通過離心、膜分離等收集細(xì)菌細(xì)胞，并作為原樣或作為經(jīng)過處理的細(xì)菌細(xì)胞用于下述的反應(yīng)。本文中使用的術(shù)語“經(jīng)過處理的細(xì)菌細(xì)胞”指，例如，用丙烯酰胺、角叉菜膠(carrageenan)等固定的細(xì)菌細(xì)胞、破壞的細(xì)胞、其離心上清或通過用硫酸銨等進(jìn)行處理來部分純化所述上清而得到的具有PC活性的級(jí)分。
對(duì)于反應(yīng)溶液而言，使用水、緩沖液、培養(yǎng)基等，而且含有合適的無機(jī)鹽的培養(yǎng)基是特別優(yōu)選的。
用于本發(fā)明的有機(jī)原料無具體的限制，只要它能在發(fā)酵中被轉(zhuǎn)化為琥珀酸，而且所述有機(jī)原料可選擇普通的有機(jī)原料。具體地，優(yōu)選使用葡萄糖和乙醇，它們價(jià)廉并提供琥珀酸的高產(chǎn)生速率。在此情況中，加入的葡萄糖的濃度優(yōu)選為0.5至500g/L，而乙醇的濃度優(yōu)選為0.5至30g/L。
此外，用于酶法的有機(jī)原料的實(shí)例包括延胡索酸或其鹽，如延胡索酸鈉和延胡索酸銨。
當(dāng)將活的微生物細(xì)胞用于產(chǎn)生含琥珀酸的液體時(shí)，難以嚴(yán)格地區(qū)分琥珀酸是通過發(fā)酵產(chǎn)生的，還是通過酶反應(yīng)產(chǎn)生的。只要能得到含有陽離子和琥珀酸的液體作為結(jié)果，在本發(fā)明中琥珀酸是通過發(fā)酵產(chǎn)生還是通過酶反應(yīng)產(chǎn)生不是問題。
通常優(yōu)選加入陽離子作為琥珀酸的反荷離子以保持反應(yīng)溶液的最適pH。然而，這樣的反荷離子可以不是必需添加的。所述琥珀酸的反荷離子無具體的限制，只要所述陽離子不抑制發(fā)酵或酶反應(yīng)。作為琥珀酸的反荷離子，通常使用鈉離子、鉀離子、鎂離子、鈣離子、銨離子或其組合，并優(yōu)選使用鈉離子、鉀離子、鎂離子、銨離子或其組合。
所述反應(yīng)溶液優(yōu)選用碳酸鎂和/或氫氧化鎂進(jìn)行中和，因?yàn)槟芴岣哏晁岬漠a(chǎn)生速率和收率。所述反應(yīng)溶液優(yōu)選保持在pH 5至10，更優(yōu)選pH 6至9.5。
當(dāng)含有碳酸根離子或碳酸氫根離子或二氧化碳?xì)獾姆磻?yīng)溶液用于制備所述含琥珀酸的液體時(shí)，碳酸根離子或碳酸氫根離子以1至500mM，優(yōu)選2至300mM，更優(yōu)選3至200mM的濃度加入。當(dāng)含有二氧化碳?xì)鈺r(shí)，每1L所述溶液中含有50mg至25g，優(yōu)選100mg至15g，更優(yōu)選150mg至10g的二氧化碳?xì)狻?br>
此外，上述提及的厭氧條件指在進(jìn)行所述反應(yīng)的同時(shí)，在所述溶液中保持低濃度的溶氧。所述反應(yīng)優(yōu)選在0至2ppm，更優(yōu)選0至1ppm，還更優(yōu)選0至0.5ppm的溶氧濃度進(jìn)行。上述反應(yīng)的方法的實(shí)例包括在密閉容器中無通風(fēng)的條件下的反應(yīng)，供應(yīng)惰性氣體如氮?dú)獾姆磻?yīng)，使用含有二氧化碳?xì)獾亩栊詺怏w通風(fēng)的方法等等。
所述反應(yīng)通常在15至45℃，優(yōu)選25至37℃的溫度進(jìn)行。所述反應(yīng)在5至9，優(yōu)選6至8的pH范圍進(jìn)行。所述反應(yīng)通常進(jìn)行5至120小時(shí)。用于所述反應(yīng)的細(xì)菌細(xì)胞的量無具體的限制，而且它們以1至700g/L，優(yōu)選10至500g/L，更優(yōu)選20至400g/L的量使用。當(dāng)使用經(jīng)過處理的細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，它們優(yōu)選以對(duì)應(yīng)于上述細(xì)菌細(xì)胞量的量使用。
前面提及的經(jīng)過處理的細(xì)菌細(xì)胞的實(shí)例包括用丙烯酰胺、角叉菜膠等固定的細(xì)菌細(xì)胞、破壞的細(xì)菌細(xì)胞、其離心上清，通過用硫酸銨等進(jìn)行處理來純化所述上清而得到的級(jí)分，等等。
如上所述得到的含琥珀酸的液體通常含有陽離子作為琥珀酸的反荷離子、除琥珀酸外的有機(jī)酸、氨基酸、無機(jī)鹽、蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)、細(xì)菌細(xì)胞，等等。
<2>離子交換在本發(fā)明中，將如上所述得到的含琥珀酸的液體與H-型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂以等于或大于含琥珀酸的液體中包含的除氫離子之外的陽離子的量進(jìn)行接觸，并從得到的經(jīng)離子交換處理的液體中沉淀琥珀酸的晶體以得到純化的琥珀酸。
在離子交換或結(jié)晶過程之前，優(yōu)選從發(fā)酵液或酶反應(yīng)混合物中分離細(xì)菌細(xì)胞或經(jīng)過處理的細(xì)菌細(xì)胞。通常優(yōu)選在所述離子交換之前進(jìn)行此步驟，但它可以在所述離子交換之后和所述結(jié)晶過程之前進(jìn)行。從所述含琥珀酸的液體中分離細(xì)菌細(xì)胞或經(jīng)過處理的細(xì)菌細(xì)胞的方法無具體的限制，而且可以使用通常用于分離細(xì)菌細(xì)胞的任何方法，如過濾、離心和其組合。
此外，如果將含有碳酸根離子、碳酸氫根離子或二氧化碳?xì)獾暮晁岬囊后w與H-型強(qiáng)酸性離子交換樹脂接觸，作為氫離子和陽離子的交換的結(jié)果，所述液體的pH降低，而且碳酸根離子和碳酸氫根離子接受氫離子并作為二氧化碳被釋放。因?yàn)樗鲆后w在此時(shí)可強(qiáng)烈地起泡(sparkle)，離子交換的過程可變得非常困難。因此，優(yōu)選將酸在所述離子交換之前加入所述含琥珀酸的液體以使該液體呈酸性，并由此引起脫羰作用(decarbonylation)。
上述的酸性條件優(yōu)選為pH 5.0或更低，更優(yōu)選為pH 4.8或更低。雖然加入的酸無具體的限制，但通常使用廉價(jià)的酸如氫氯酸和硫酸。此外，作為待加入的酸，可以使用如下文所述的離子交換操作之后的含琥珀酸的液體(經(jīng)離子交換處理的液體)，或其中已除去沉淀的琥珀酸的經(jīng)離子交換處理的液體(除去結(jié)晶的琥珀酸后的母液(mother liquor))。由于這些經(jīng)離子交換處理的液體和母液具有低pH，它們有效地降低了發(fā)酵液的pH。此外，因?yàn)樗尤氲囊后w能通過重復(fù)本發(fā)明方法的過程來循環(huán)利用，所以它們具有既不降低收率又不增加處理廢酸的成本的優(yōu)點(diǎn)。
將含琥珀酸的液體，優(yōu)選經(jīng)過細(xì)胞去除處理和(如果需要的話)脫羰處理的含琥珀酸的液體，與H-型陽離子交換樹脂進(jìn)行接觸。通過此離子交換步驟，所述含琥珀酸的液體中的陽離子和氨基酸被吸附在所述離子交換樹脂上并由此被除去。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)不僅堿性氨基酸而且中性和酸性氨基酸已通過此步驟去除。發(fā)酵液通常具有大約中性的pH。在此pH區(qū)域，堿性氨基酸帶正電荷，中性氨基酸不解離，而酸性氨基酸帶負(fù)電荷。因此，酸性和中性氨基酸不吸附在所述陽離子交換樹脂上。然而，如果將含有琥珀酸的鹽的原料液體與H-型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂進(jìn)行接觸，所述陽離子作為琥珀酸的反荷離子從所述原料液體中被去除并被氫離子代替，導(dǎo)致pH的降低。認(rèn)為，結(jié)果是使中性和酸性氨基酸也帶有正電荷，并吸附在所述陽離子交換樹脂上。
用于本發(fā)明的H-型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂無具體的限制，并可使用低或高的交聯(lián)度的那些。此外，可以使用凝膠型或多孔型的那些。其具體實(shí)例包括，但不限于，商業(yè)上可得到的DIAION SK1B、SK104、SK110、PK212、PK216(Mitsubishi Chemical Corporation)，其他等級(jí)的這些產(chǎn)品等等。
在本發(fā)明中，使用之前必須將強(qiáng)酸性離子交換樹脂轉(zhuǎn)化為H-型。所述轉(zhuǎn)化為H-型的方法無具體的限制，并可使用通常采用的方法?？梢允褂瞄g歇式方法(bach type method)、單柱式方法(single column type method)和多柱式方法(multiple column type)方法中的任一種(Kagaku Kogaku Binran(化學(xué)工程手冊(cè))，修訂的第4版，The Society of Chemical Engineers，Japan，Maruzen編輯)。此外，將酸用于向H-型的轉(zhuǎn)化，而且選擇pKa低于強(qiáng)酸性離子交換樹脂的pK的的酸。此外，所述的酸優(yōu)選不具有氧化能力，其導(dǎo)致所述離子交換樹脂的降解。本發(fā)明可使用任何酸，只要滿足這些要求。通常，使用氫氯酸、稀硫酸等作為所述的酸，但并不局限于這些。
將含琥珀酸的液體與H-型強(qiáng)酸性離子交換樹脂進(jìn)行接觸的方法無具體的限制，并可以使用上述的通常采用的方法?？梢允褂瞄g歇式方法、單柱式方法和多柱式方法中的任一種(Kagaku Kogaku Binran，修訂的第4版，TheSociety of Chemical Engineers，Japan，Maruzen編輯)。通常使用柱方法，其中將含琥珀酸的液體通過以H-型強(qiáng)酸性離子交換樹脂填充的柱子，雖然也可以使用間歇式方法。
在本發(fā)明中，通過將含琥珀酸的液體與H-型強(qiáng)酸性離子交換樹脂進(jìn)行接觸而得到的液體被定義為通流液體(through-flow liquid)。
在本發(fā)明中，H-型強(qiáng)酸性離子交換樹脂的交換容量(exchange capacity)等于或大于含琥珀酸的液體中包含的除氫離子之外的陽離子的量是必要的。本文中使用的術(shù)語“除氫離子之外的陽離子”包括如上所述在離子交換處理的過程中帶負(fù)電荷的氨基酸以及金屬陽離子?？赏ㄟ^使用具有等于或大于陽離子量的交換容量的H-型強(qiáng)酸性離子交換樹脂有效地除去含琥珀酸的液體中的雜質(zhì)。具體地，可有效地除去離子如鈉離子、鉀離子、鎂離子和銨離子，和氨基酸如絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸，其難以通過單獨(dú)的結(jié)晶完全地去除。通流液體中除氫離子之外的陽離子的總濃度相對(duì)于琥珀酸理想地為1.0％或更低，優(yōu)選0.5％或更低。
含琥珀酸的液體或通流液體中包含的除氫離子之外的陽離子中，金屬陽離子的濃度可通過，例如，離子電極(ion electrode)方法、原子吸收(atomicabsorption)方法、離子色譜法(ion chromatography)等進(jìn)行測(cè)量，而且氨基酸的濃度可通過使用氨基酸分析儀(Analytical Instrument Guide，9th Edition，September 5，2001，Japan Analytical Instruments Manufacturers Association)等進(jìn)行測(cè)量。
<3>結(jié)晶琥珀酸的晶體從已經(jīng)過離子交換的含琥珀酸的液體中沉淀。沉淀晶體的方法的實(shí)例包括濃縮(concentration)、冷卻經(jīng)離子交換處理的液體，或?qū)⒂袡C(jī)溶劑加入經(jīng)離子交換處理的液體，或其組合。純化的琥珀酸可通過此步驟獲得。具體地，通過此步驟有效地去除不能通過結(jié)晶、脫羰或離子交換完全去除的除琥珀酸之外的有機(jī)酸以及碳酸根離子、銨離子等等。
所述濃縮步驟的條件無具體的限制，并通常使用真空濃縮(vacuumconcentration)。然而，不限于此方法，而且也可以應(yīng)用使用反滲透膜的濃縮(Kagaku Kogaku Binran，Revised 4th Edition，1978，Maruzen)，使用電滲析的濃縮(Food Membrane Technology，1999，Korin)等等。
真空濃縮優(yōu)選在50kPa或更低，優(yōu)選25kPa或更低，特別優(yōu)選15kPa或更低的壓力下進(jìn)行。
為了通過濃縮步驟來沉淀琥珀酸的晶體，將所述液體濃縮至高于琥珀酸的溶解度的濃度。
琥珀酸的溶解度在，例如，Kagaku Binran Basic Part II，Revised 2nd Edition(The Chemical Society of Japan，1975，Maruzen)等中描述。
為了通過冷卻來沉淀琥珀酸的晶體，進(jìn)行所述的冷卻以將液體冷卻到該液體中琥珀酸的濃度低于琥珀酸溶解度的溫度。
琥珀酸的溶解度在，例如，Kagaku Binran Basic Part II，Revised 2nd Edition(The Chemical Society of Japan，1975，Maruzen)等中描述。
為了通過加入有機(jī)溶劑來沉淀琥珀酸的晶體，加入有機(jī)溶劑，如甲醇或乙醇。
有機(jī)溶劑中琥珀酸的溶解度在，例如，Kagaku Binran Basic Part，II Revised2nd Edition(The Chemical Society of Japan，1975，Maruzen)等中描述。
琥珀酸可通過單獨(dú)的濃縮、冷卻或加入有機(jī)溶劑，或這些的組合來結(jié)晶。
沉淀的晶體從母液中以常規(guī)方式進(jìn)行分離。所述分離方法的實(shí)例包括，但不限于，過濾、離心過濾(centrifugal filtration)、離心沉降(centrifugalsedimentation)等等。
實(shí)施例參考如下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明。
參考實(shí)施例1構(gòu)建PC基因-擴(kuò)增的菌株<1>克隆含有源自酵母釀酒酵母的PC基因(PYC2)的DNA片段(A)提取釀酒酵母的總DNA將釀酒酵母W303-1A菌株(Yeast，Vol.2，pp.163-167(1986))使用白金環(huán)(platinum loop)接種于1L的酵母生長培養(yǎng)基(YPAD)[組成10g酵母提取物，20g蛋白胨，20g葡萄糖，100mg腺嘌呤(adenine)和1000ml蒸餾水]，在30℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長后期，并收集細(xì)胞。
將得到的細(xì)胞以10mg/ml的濃度懸浮于15ml含10mg/ml溶菌酶(lysozyme)、10mM NaCl、20mM Tris緩沖液(pH 8.0)和1mM EDTA·2Na(每種組分的濃度為終濃度)的溶液。然后，將蛋白酶K以100μg/ml的終濃度加入所述懸浮液，并在37℃保溫1小時(shí)。然后，將十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate(SDS))以0.5％的終濃度加入所述溶液，并在50℃保溫6小時(shí)用于裂解。向此裂解物中加入等量的酚/氯仿溶液并在室溫緩慢地振蕩10分鐘，然后離心(5,000×g，20分鐘，10至12℃)以分離上清級(jí)分。將乙酸鈉以0.3M的濃度加入所述上清并緩慢地加入2-倍體積的乙醇。用玻璃棒取出水層和乙醇層之間存在的DNA，以70％乙醇洗滌，并風(fēng)干。將5ml的10mM Tris緩沖液(pH 7.5)/1mM EDTA·2Na溶液加入所得的DNA中，在4℃保持靜置過夜并用于下面的實(shí)驗(yàn)。
(B)克隆含有源自釀酒酵母的PC基因(PYC2)的DNA片段和構(gòu)建重組菌株通過使用上面提及的(A)中制備的染色體DNA作為模板來進(jìn)行PCR。對(duì)于PCR而言，通過使用由Applied Biosystems制造的“394DNA/RNA合成儀”合成如下的引物對(duì)，并使用。
(a-1)5’-TTT CAT ATG AGC AGT AGC AAG AAA TTG-3’(SEQ ID NO1)(b-1)5’-TTT CCT GCA GGT TAA CGA GTA AAA ATT ACT TT-3’(SEQID NO2)在下列條件下通過使用由Perkin Elmer Cetus制造的“DNA熱循環(huán)儀”并將重組TaqDNA聚合酶TaKaRa Taq(Takara Shuzo)作為反應(yīng)試劑來進(jìn)行PCR。
反應(yīng)混合物(10x)PCR緩沖液 10μl1.25mM dNTP混合物16μl模板DNA 10μl(DNA含量1μM或更低)上述的a-1和b-1引物 每種1μl(終濃度0.25μM)重組TaqDNA聚合酶 0.5μl滅菌的蒸餾水 61.5μl混合上述組分，并將100μl的反應(yīng)混合物用于PCR。
PCR循環(huán)變性步驟94℃進(jìn)行60秒退火步驟52℃進(jìn)行60秒延伸步驟72℃進(jìn)行120秒將上述循環(huán)作為一個(gè)循環(huán)重復(fù)25次。
使用0.8％瓊脂糖凝膠將10μl由上述反應(yīng)得到的反應(yīng)混合物進(jìn)行電泳，并由此可檢測(cè)大約3.56kb的DNA片段。
<2>使用PC基因制備重組棒狀桿菌細(xì)菌(A)構(gòu)建穿梭載體基于在棒狀桿菌細(xì)菌中穩(wěn)定質(zhì)粒所需的區(qū)域的序列，其存在于JP03-210184A中描述的質(zhì)粒pCRY30中，通過使用由Applied Biosystems制造的“394DNA/RNA合成儀”合成如下的引物對(duì)。
(a-2)5’-TTT CTC GAG CGC ATT ACC TCC TTG CTA CTG-3’(SEQ IDNO3)(b-2)5’-TTT GAA TTC GAT ATC AAG CTT GCA CAT CAA-3’(SEQ IDNO4)所述質(zhì)粒pCRY30是如下所述構(gòu)建的質(zhì)粒。即，質(zhì)粒pBY503的DNA(此質(zhì)粒的詳細(xì)說明參考JP 01-95785A)提取自停滯短桿菌(brevibacteriumstationis)IFO12144，其于1988年7月18日以登記號(hào)FERM P-10136保藏在國立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科技機(jī)構(gòu)(目前為，International PatentOrganism Depositary，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken305-8566，日本))，然后根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定轉(zhuǎn)為國際保藏物，并給以登記號(hào)FERM BP-2515。然后，所述質(zhì)粒的具有大約4.0kb大小并含有負(fù)責(zé)復(fù)制的基因(復(fù)制區(qū))的DNA片段用限制性內(nèi)切酶XhoI切除，而且所述質(zhì)粒的具有大約2.1kb大小并含有負(fù)責(zé)穩(wěn)定的基因(穩(wěn)定區(qū))的DNA片段用限制性內(nèi)切酶EcoRI和KpnI切除。通過將這兩段DNA片段并入所述質(zhì)粒pHSG298(Takara Shuzo)的每個(gè)EcoRI-KpnI位點(diǎn)和SalI位點(diǎn)，可制備質(zhì)粒載體pCRY30。
在下列條件下通過使用由Perkin Elmer Cetus制造的“DNA熱循環(huán)儀”并將重組TaqDNA聚合酶TaKaRa Taq(Takara Shuzo)作為反應(yīng)試劑來進(jìn)行PCR。
反應(yīng)混合物(10x)PCR緩沖液10μl1.25mM dNTP混合物 16μl模板DNA 10μl(DNA含量1μM或更低)上述的a-2和b-2引物每種1μl(終濃度0.25μM)
重組TaqDNA聚合酶0.5μl滅菌的蒸餾水61.5μl混合上述組分，并將100μl此反應(yīng)混合物用于PCR。
PCR循環(huán)變性步驟94℃進(jìn)行60秒退火步驟52℃進(jìn)行60秒延伸步驟72℃進(jìn)行120秒將上述循環(huán)作為一個(gè)循環(huán)重復(fù)25次。
使用0.8％瓊脂糖凝膠將10μl由上述反應(yīng)得到的反應(yīng)混合物進(jìn)行電泳，并由此可檢測(cè)大約1.1kb的DNA片段。
將10μl的其中擴(kuò)增產(chǎn)物已在上面得到確認(rèn)的反應(yīng)混合物，和1μl質(zhì)粒pBluescriptIISK+分別用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI完全消化，并在70℃處理10分鐘以失活所述限制性內(nèi)切酶，然后將這些混合，加入1μl T4 DNA連接酶10×緩沖液和1單位的T4 DNA連接酶，和滅菌的蒸餾水以達(dá)到10μl，并在15℃反應(yīng)3小時(shí)以連接所述片段。
使用所得到的含質(zhì)粒的溶液，通過氯化鈣方法[Journal of MolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(Takara Shuzo)，并鋪于含50mg氨芐青霉素的培養(yǎng)基[10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl和16g瓊脂溶于1L蒸餾水]。
能在此培養(yǎng)基上生長的菌株以常規(guī)的方法進(jìn)行液體培養(yǎng)，并從該培養(yǎng)溶液中提取質(zhì)粒DNA，并將該質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(EcoRI、XhoI)消化以確認(rèn)插入的片段。結(jié)果，除具有3.0kb長度的質(zhì)粒pBluescriptIISK+的DNA片段之外，鑒定了具有1.1kb長度的插入的DNA片段。將此質(zhì)粒命名為pBSpar。
基于在棒狀桿菌細(xì)菌中復(fù)制質(zhì)粒所需的區(qū)域的序列，其存在于美國專利No.5,185,262中描述的質(zhì)粒pCRY31中，通過使用由Applied Biosystems制造的“394 DNA/RNA合成儀”合成如下的1對(duì)引物。
(a-3)5’-TTT GGT ACC GAC TTA GAT AAA GGT CTA-3’(SEQ ID NO5)(b-3)5’-TTT CTC GAG TGC TGG TAA AAC AAC TTT-3’(SEQ ID NO6)上述的質(zhì)粒pCRY31是如下構(gòu)建的質(zhì)粒。即，通過將上述源自pBY503的復(fù)制區(qū)連接到質(zhì)粒pHSG398(Takara Shuzo)而獲得的質(zhì)粒pCRY3(攜帶此質(zhì)粒的黃色短桿菌MJ233 GE102于1988年1月8日作為FERM P-9802的登記號(hào)保藏在國立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科技機(jī)構(gòu)(目前為，International Patent Organism Depositary，National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，日本))，然后在1988年1月8日根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定轉(zhuǎn)為國際保藏物，并給以登記號(hào)FERM BP-2513)，用KpnI部分消化以得到DNA片段。pBY503由乳發(fā)酵短桿菌IFO12144(FERMBP-2515)制備并用KpnI完全消化以產(chǎn)生大約7-kb的DNA片段。通過連接上面的DNA片段和選擇當(dāng)用限制性內(nèi)切酶消化時(shí)顯示下表所述的消化模式(digestion pattern)的質(zhì)粒，可得到pCRY31。
表1
在下列條件下通過使用由Perkin Elmer Cetus制造的“DNA熱循環(huán)儀”，并以重組TaqDNA聚合酶TaKaRa Taq(Takara Shuzo)作為反應(yīng)試劑來進(jìn)行PCR。
反應(yīng)混合物(10×)PCR緩沖液 10μl1.25mM dNTP混合物16μl模板DNA 10μl(DNA含量1μM或更低)上述的a-3和b-3引物 每種1μl(終濃度0.25μM)重組TaqDNA聚合酶 0.5μl滅菌的蒸餾水 61.5μl混合上述組分，并將100μl此反應(yīng)混合物用于PCR。
PCR循環(huán)變性步驟94℃進(jìn)行60秒退火步驟52℃進(jìn)行60秒延伸步驟72℃進(jìn)行120秒將上述循環(huán)作為一個(gè)循環(huán)重復(fù)25次。
使用0.8％瓊脂糖凝膠將10μl由上述反應(yīng)得到的反應(yīng)混合物進(jìn)行電泳，并由此可檢測(cè)大約1.8kb的DNA片段。
將10μl的其中擴(kuò)增產(chǎn)物已在上面得到確認(rèn)的反應(yīng)混合物，和1μl質(zhì)粒pBSpar用限制性內(nèi)切酶XhoI和KpnI完全消化，并在70℃處理10分鐘以失活所述限制性內(nèi)切酶，然后將這些混合，加入1μl T4DNA連接酶10×緩沖液和1單位的T4DNA連接酶，和滅菌的蒸餾水以達(dá)到10μl，并在15℃反應(yīng)3小時(shí)以連接所述片段。
使用所得到的含質(zhì)粒的溶液，通過氯化鈣方法[Journal of MolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(Takara Shuzo)，并鋪于含50mg氨芐青霉素的培養(yǎng)基[10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl和16g瓊脂溶于1L蒸餾水]。
能在此培養(yǎng)基上生長的菌株以常規(guī)的方法進(jìn)行液體培養(yǎng)，并從該培養(yǎng)溶液中提取質(zhì)粒DNA，并將該質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(XhoI、KpnI)消化以確認(rèn)插入的片段。結(jié)果，除具有4.1kb長度的質(zhì)粒pBSpar的DNA片段之外，鑒定了具有1.8kb長度的插入的DNA片段。將此質(zhì)粒命名為pBSpar-rep。
將1μl如上所述制備的質(zhì)粒pBSpar-rep和1μl pHSG298(Takara Shuzo)用限制性內(nèi)切酶KpnI和EcoRI完全消化，并在70℃處理10分鐘以失活所述的限制性內(nèi)切酶。然后將這些混合，加入1μl T4 DNA連接酶10×緩沖液和1單位T4 DNA連接酶，和滅菌的蒸餾水以達(dá)到10μl，并在15℃反應(yīng)3小時(shí)以連接所述片段。
使用所得到的含質(zhì)粒的溶液，通過氯化鈣方法[Journal of MolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(Takara Shuzo)，并鋪于含50mg卡那霉素的培養(yǎng)基[10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl和16g瓊脂溶于1L蒸餾水]。
能在此培養(yǎng)基上生長的菌株以常規(guī)的方法進(jìn)行液體培養(yǎng)，并從該培養(yǎng)溶液中提取質(zhì)粒DNA，并將該質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶消化以確認(rèn)插入的片段。結(jié)果，除具有2.6kb長度的質(zhì)粒pHSG298的DNA片段之外，鑒定了具有2.9kb長度的插入的DNA片段。將此質(zhì)粒命名為pHSG298par-rep。
(B)插入tac啟動(dòng)子為了使用含tac啟動(dòng)子的質(zhì)粒pTrc99A(Pharmacia)作為模板通過PCR擴(kuò)增tac啟動(dòng)子片段，通過由Applied Biosystems制造的“394 DNA/RNA合成儀”合成如下的1對(duì)引物。
(a-4)5’-TTT GGT ACC GAT AGC TTA CTC CCC ATC CCC-3’(SEQ IDNO7)(b-4)5’-TTT GGA TCC CAA CAT ATG AAC ACC TCC TTT TTA TCCGCT CAC AAT TCC ACA CAT-3’(SEQ ID NO8)在下列條件下通過使用由Perkin Elmer Cetus制造的“DNA熱循環(huán)儀”，并以重組TaqDNA聚合酶TaKaRa Taq(Takara Shuzo)作為反應(yīng)試劑來進(jìn)行PCR。
反應(yīng)混合物(10x)PCR緩沖液10μl1.25mM dNTP混合物 16μl模板DNA 10μl(DNA含量1μM或更低)上述的a-4和b-4引物每種1μl(終濃度0.25μM)重組TaqDNA聚合酶 0.5μl滅菌的蒸餾水 61.5μl混合上述組分，并將100μl此反應(yīng)混合物用于PCR。
PCR循環(huán)變性步驟94℃進(jìn)行60秒退火步驟52℃進(jìn)行60秒延伸步驟72℃進(jìn)行120秒將上述循環(huán)作為一個(gè)循環(huán)重復(fù)25次。
使用3％瓊脂糖凝膠將10μl由上述反應(yīng)得到的反應(yīng)混合物進(jìn)行電泳，并由此可檢測(cè)大約100bp的DNA片段。
將10μl的其中擴(kuò)增產(chǎn)物已在上面得到確認(rèn)的反應(yīng)混合物，和5μl在上述(A)中制備的質(zhì)粒pHSG298par-rep用限制性內(nèi)切酶BamHI和KpnI完全消化，并在70℃處理10分鐘以失活所述限制性內(nèi)切酶，然后將這些混合，加入1μlT4 DNA連接酶10×緩沖液和1單位的T4 DNA連接酶，和滅菌的蒸餾水以達(dá)到10μl，并在15℃反應(yīng)3小時(shí)以連接所述片段。
使用所得到的含質(zhì)粒的溶液，通過氯化鈣方法[Journal of MolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(Takara Shuzo)，并鋪于含50mg卡那霉素的培養(yǎng)基[10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl和16g瓊脂溶于1L蒸餾水]。
能在此培養(yǎng)基上生長的菌株以常規(guī)的方法進(jìn)行液體培養(yǎng)，并從該培養(yǎng)溶液中提取質(zhì)粒DNA，并將該質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶消化以確認(rèn)插入的片段。結(jié)果，除具有5.5kb長度的在上述(A)中制備的質(zhì)粒的DNA片段之外，鑒定了具有0.1kb長度的插入的DNA片段。將此質(zhì)粒命名為pHSG298tac。
(C)將所述PC基因插入穿梭載體將10μl的其中擴(kuò)增產(chǎn)物已在上述(B)中得到確認(rèn)的反應(yīng)混合物，和5μl在上述(B)中制備的質(zhì)粒pHSG298tac用限制性內(nèi)切酶BglII和SseI或BamHI和SseI消化，并在70℃處理10分鐘以失活所述限制性內(nèi)切酶，然后將這些混合，加入1μl T4 DNA連接酶10×緩沖液和1單位的T4 DNA連接酶，和滅菌的蒸餾水以達(dá)到10μl，并在15℃反應(yīng)3小時(shí)以連接所述片段。
使用所得到的含質(zhì)粒的溶液，通過氯化鈣方法[Journal of MolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(Takara Shuzo)，并鋪于含50mg卡那霉素的培養(yǎng)基[10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl和16g瓊脂溶于1L蒸餾水]。
能在此培養(yǎng)基上生長的菌株以常規(guī)的方法進(jìn)行液體培養(yǎng)，并從該培養(yǎng)溶液中提取質(zhì)粒DNA，并將該質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(SseI、NdeI)消化以確認(rèn)插入的片段。結(jié)果，除具有5.6kb長度的在上述(B)中制備的質(zhì)粒的DNA片段之外，鑒定了具有3.56kb長度的插入的DNA片段。
將此質(zhì)粒命名為pPC-PYC2。
(D)轉(zhuǎn)化黃色短桿菌MJ-233-AB-41菌株根據(jù)美國專利No.5,185,262中描述的方法，將上述質(zhì)粒導(dǎo)入黃色短桿菌MJ-233-AB-41(FERM BP-1498)。
實(shí)施例1
從積累琥珀酸二銨鹽的發(fā)酵液中純化琥珀酸制備H-型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂如下制備H-型陽離子交換樹脂。
將1.6L的Na-型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂SK1BL(Mitsubishi ChemicalCorporation)填充于柱中。將5L 1mol/L氫氯酸以1.6L/hr的流速通過所述柱子以將所述樹脂轉(zhuǎn)變?yōu)镠-型。隨后，將20L純水通過該柱子以洗滌所述樹脂，并將所述樹脂用于如下的實(shí)驗(yàn)。
通過發(fā)酵產(chǎn)生琥珀酸根據(jù)如下的方法通過發(fā)酵產(chǎn)生琥珀酸。
制備400mL的培養(yǎng)基，其中每1升中含有100g葡萄糖、0.5g七水合硫酸鎂、0.65g正磷酸(orthophosphoric acid)、14.3mL大豆蛋白水解溶液(總氮含量35g/L)、1.0g硫酸銨、20mg七水合硫酸亞鐵、20mg水合硫酸錳、1mgD-生物素、1mg鹽酸硫胺素和0.05mL消泡劑(GD-113，NOF Corporation)，用1N KOH調(diào)節(jié)到pH 6.5，將所述培養(yǎng)基傾倒入1-L發(fā)酵缸(jar fermenter)并通過加熱在120℃滅菌20分鐘。將所述培養(yǎng)基冷卻后，將用所述質(zhì)粒pPC-PYC2轉(zhuǎn)化的黃色短桿菌MJ-233-AB-41菌株接種到所述培養(yǎng)基中，并將該培養(yǎng)基保持在30℃。在每分鐘通氣300ml和在700rpm攪拌的條件下進(jìn)行20小時(shí)培養(yǎng)，同時(shí)用氨氣將pH調(diào)節(jié)為7.6。將100ml得到的培養(yǎng)溶液用于如下的琥珀酸發(fā)酵。
制備79ml的糖(succharide)溶液，其每1升含有520g葡萄糖和2.6g七水合硫酸鎂，并通過加熱在120℃將所述糖溶液滅菌20分鐘。制備221ml的培養(yǎng)基，其每1升含有1.21g正磷酸、5.39mL大豆蛋白水解溶液(總氮含量35g/L)、1.86g硫酸銨、37.14mg七水合硫酸亞鐵、37.14mg水合硫酸錳、1.86mg的D-生物素、1.86mg鹽酸硫胺素和0.09mL消泡劑(GD-113)，用1NKOH調(diào)節(jié)到pH 6.5，然后通過加熱在120℃滅菌20分鐘。將滅菌的糖溶液和滅菌的培養(yǎng)基注入1-L發(fā)酵缸，冷卻，然后加入100mL上述的培養(yǎng)液以使總體積為400mL，然后保持在30℃。在每分鐘通氣20ml和在400rpm攪拌的條件下進(jìn)行24小時(shí)琥珀酸發(fā)酵，同時(shí)用氨氣將所述培養(yǎng)基調(diào)節(jié)到pH 7.6。
將上述的琥珀酸發(fā)酵進(jìn)行9次以獲得3.6L的培養(yǎng)液，其具有25g/L的琥珀酸濃度。
從積累琥珀酸的鹽的發(fā)酵液中純化琥珀酸的晶體將得到的培養(yǎng)液通過加熱在120℃滅菌20分鐘，然后在5000×g離心20分鐘以得到3.5L的上清。
將得到的上清經(jīng)過上述的H-型陽離子交換樹脂以得到2.2L的通流液體。通過使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(rotary evaporator)將得到的通流液體濃縮直到琥珀酸的濃度為19.2％以沉淀琥珀酸的晶體并得到琥珀酸漿液。將得到的琥珀酸漿液冷卻到10℃以沉淀所述的琥珀酸的晶體。分離所述晶體和所述母液。將所得到的琥珀酸的晶體重懸于飽和的琥珀酸水溶液以洗滌該晶體，該水溶液的體積為所述晶體重量的15倍，然后分離該晶體。
對(duì)比實(shí)施例1將以與實(shí)施例1同樣的方式積累琥珀酸的發(fā)酵液滅菌(120℃，20分鐘)，并除去所述細(xì)胞(5000×g，20分鐘)。通過使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮此發(fā)酵液以使琥珀酸濃度變?yōu)?34g/L。通過加入硫酸將得到的濃縮的液體調(diào)節(jié)到pH 2.2并冷卻到10℃以沉淀琥珀酸的晶體。然后，以如實(shí)施例1中同樣的方式分離所述晶體，并通過用飽和的琥珀酸水溶液重調(diào)漿(reslurry)來洗滌以得到洗滌的晶體。
實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例1中得到的琥珀酸晶體的分析值顯示于表2中。
表2實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例1中得到的琥珀酸晶體的分析值(單位＝重量％)
<p>
如表3所示，可以看出，供給的液體中所含的各種氨基酸中的大部分在由H-型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂柱得到的通流液體中去除。這說明所述氨基酸已經(jīng)通過吸附于H-型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂而除去，結(jié)果，它們?cè)谧鳛槟繕?biāo)產(chǎn)物的所述琥珀酸晶體中幾乎檢測(cè)不到。
實(shí)施例2從琥珀酸二鈉和碳酸氫鈉同時(shí)積累的發(fā)酵液中純化琥珀酸的晶體。
制備H-型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂以如實(shí)施例1中同樣的方式制備4.7L的H-型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂。
通過發(fā)酵產(chǎn)生琥珀酸二鈉和碳酸氫鈉根據(jù)實(shí)施例1中描述的方法進(jìn)行同時(shí)積累琥珀酸二鈉和碳酸鈉的發(fā)酵，條件是通過使用2.5mol/L的碳酸鈉水溶液代替氨來調(diào)節(jié)pH。結(jié)果，得到3.1L的培養(yǎng)液，其具有70g/L的琥珀酸濃度。
從發(fā)酵液中純化琥珀酸的晶體使用MF膜組件(由Millipore制造的PELLICON-2膜組件，有效膜面積0.1m2，孔徑大小0.22μm)將3.1L所得的發(fā)酵液進(jìn)行錯(cuò)流過濾(cross flow<p>
如表4所示，即使當(dāng)積累琥珀酸鈉的發(fā)酵液用作原料時(shí)，可得到極高純度的琥珀酸。因此，本發(fā)明也可應(yīng)用于含有一價(jià)陽離子作為琥珀酸的反荷離子的發(fā)酵液。
對(duì)比實(shí)施例2以如實(shí)施例2中同樣的方式，通過使用同時(shí)積累琥珀酸二鈉和碳酸氫鈉的發(fā)酵液作為原料來純化琥珀酸的晶體。在此實(shí)施例中，將所述液體經(jīng)過H-型強(qiáng)酸性離子交換樹脂而不進(jìn)行脫羰。
將所述液體加載于H-型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂上從上述發(fā)酵液中去除所述細(xì)胞，將得到的已去除細(xì)胞的液體經(jīng)過H-型陽離子交換樹脂柱。結(jié)果，所述液體在陽離子交換樹脂柱的上表面發(fā)泡，并且不能進(jìn)行離子交換操作。因此，不能進(jìn)行結(jié)晶過程。
實(shí)施例3從含有琥珀酸鎂的發(fā)酵液中產(chǎn)生琥珀酸從含有琥珀酸鎂作為二價(jià)金屬鹽的發(fā)酵液中純化琥珀酸。
制備H-型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂并通過發(fā)酵產(chǎn)生琥珀酸以與實(shí)施例1中相同的方式，制備4.7L的H-型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂。
通過如實(shí)施例1中同樣的培養(yǎng)方法進(jìn)行琥珀酸鎂發(fā)酵，條件是使用氫氧化鎂代替氨作為中和劑。具體地，使用2.5mol/L氫氧化鎂漿液代替氨用于pH調(diào)節(jié)。將培養(yǎng)基保持在pH 7.5至7.7。結(jié)果，得到1L的培養(yǎng)液，其具有50g/L的琥珀酸濃度。
將所得的培養(yǎng)液通過在120℃加熱20分鐘而滅菌并以5000×g離心15分鐘以沉淀細(xì)菌細(xì)胞并由此得到上清。將所得的上清以如實(shí)施例1中同樣的方式經(jīng)過H-型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，并將得到的通流液體進(jìn)行真空濃縮以得到琥珀酸的晶體。
實(shí)施例3中得到的琥珀酸晶體的分析值顯示于表5中。
表5.實(shí)施例3中得到的琥珀酸晶體的分析值(單位重量％)
n.d.表示≤0.0001。
如表5所示，根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)高純度的琥珀酸也可以由琥珀酸的鎂鹽得到，所述琥珀酸的鎂鹽是二價(jià)陽離子的鹽。因此，本發(fā)明不僅可應(yīng)用于含有單價(jià)陽離子作為反荷離子的含琥珀酸的發(fā)酵液，而且可應(yīng)用于含有二價(jià)陽離子作為反荷離子的含琥珀酸的發(fā)酵液。
工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明，從通過發(fā)酵或酶法得到的含琥珀酸的液體中可容易地獲得高純度的琥珀酸。
序列表<110>味之素株式會(huì)社三菱化學(xué)株式會(huì)社<120>從發(fā)酵液中純化琥珀酸的方法<130>C2880PC4140<150>JP2003-340091<151>2003-09-30<160>8<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>1tttcatatga gcagtagcaa gaaattg27<210>2<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>2tttcctgcag gttaacgagt aaaaattact tt 32<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>3tttctcgagc gcattacctc cttgctactg 30<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>4tttgaattcg atatcaagct tgcacatcaa 30<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>5tttggtaccg acttagataa aggtcta 27<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>6tttctcgagt gctggtaaaa caacttt 27<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>7tttggtaccg atagcttact ccccatcccc 30<210>8<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>8tttggatccc aacatatgaa cacctccttt ttatccgctc acaattccac acat 5
權(quán)利要求
1.從含琥珀酸的液體中純化琥珀酸的方法，所述含琥珀酸的液體含有通過發(fā)酵或酶法獲得的陽離子，該方法包括將所述含琥珀酸的液體與H-型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂進(jìn)行接觸，所述樹脂的量等于或大于含琥珀酸的液體中包含的除氫離子之外的陽離子的量，和從得到的經(jīng)離子交換處理的液體中沉淀琥珀酸的晶體以得到純化的琥珀酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述含琥珀酸的液體含有琥珀酸的鹽。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述琥珀酸的鹽選自琥珀酸鈉、琥珀酸鉀、琥珀酸鎂、琥珀酸鈣和琥珀酸銨。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述含琥珀酸的液體含有碳酸的鹽，并將酸加入所述含琥珀酸的液體以調(diào)節(jié)為pH 5.0或更低，然后與H-型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂進(jìn)行接觸。
5.權(quán)利要求4的方法，其中經(jīng)離子交換處理的液體用作所述的酸。
6.權(quán)利要求4的方法，其中已經(jīng)去除沉淀的琥珀酸的經(jīng)離子交換處理的液體用作所述的酸。
7.產(chǎn)生琥珀酸的方法，其包括將細(xì)菌細(xì)胞或經(jīng)過處理的細(xì)菌細(xì)胞作用于含水反應(yīng)溶液中的有機(jī)原料以獲得含琥珀酸的液體，將所述含琥珀酸的液體與H-型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂進(jìn)行接觸，所述樹脂的量等于或大于含琥珀酸的液體中包含的除氫離子之外的陽離子的量，和從得到的經(jīng)離子交換處理的液體中沉淀琥珀酸的晶體以得到純化的琥珀酸。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述含水反應(yīng)溶液用碳酸鎂或氫氧化鎂進(jìn)行中和。
全文摘要
通過將含琥珀酸的液體與H－型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂進(jìn)行接觸，所述樹脂的量等于或大于含琥珀酸的液體中包含的除氫離子之外的陽離子的量，并從得到的經(jīng)離子交換處理的液體中沉淀琥珀酸的晶體以得到純化的琥珀酸來產(chǎn)生琥珀酸，所述含琥珀酸的液體中含有琥珀酸和通過發(fā)酵或酶法獲得的陽離子。
文檔編號(hào)C12N15/00GK1860237SQ20048002849
公開日2006年11月8日 申請(qǐng)日期2004年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月30日
發(fā)明者櫛來武, 藤原憲治, 佐藤武, 佐野千明 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社, 三菱化學(xué)株式會(huì)社