專利名稱：使造血干細胞移植后附著生長穩(wěn)定的組合物、用于獲取該組合物的試劑盒、使造血干細胞 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使造血干細胞移植后附著生長穩(wěn)定的組合物，該組合物可以用于改善造血干細胞移植中出現(xiàn)的附著生長不全、附著生長后誘發(fā)抗體產(chǎn)生、免疫應(yīng)答不適等問題，還可以用于防止各種感染并發(fā)癥和癌癥的復(fù)發(fā)。本發(fā)明還涉及為獲取該組合物而使用的試劑盒(kit)、使造血干細胞移植后附著生長穩(wěn)定的方法、以及用于治療各種人類疾病的單克隆抗體或多克隆抗體的制備方法。
背景技術(shù)：
細胞移植特別是造血干細胞移植患者有并發(fā)各種感染癥、癌癥復(fù)發(fā)等危險。到目前為止，人們針對上述情況進行了種種研究，本發(fā)明申請人之一的關(guān)根曾經(jīng)報道固定化的抗CD3抗體和白細胞介素2(IL-2)可以誘導(dǎo)淋巴細胞增殖，而且由此增殖產(chǎn)生的自源淋巴細胞具有抗腫瘤效果(特開平3-80076號公報)。
此外，我們還報道了由固定化的抗CD3抗體和IL-2誘導(dǎo)產(chǎn)生的自源淋巴細胞對先天性免疫缺陷患者的病毒感染癥具有療效(伊藤仁也、關(guān)根暉彬；醫(yī)學のあゆみ，181卷，第6期，426-427，1997年)。在造血干細胞移植研究領(lǐng)域，標志著患者和捐獻者白細胞血型的人類白細胞抗原(humanleukocyte antigen，HLA)與A、B、C、DR的四個基因位點以及被稱為DQ、DP的數(shù)種主要HLA分子一致時，才可以進行骨髓移植和輸血。
自1975年Kohler和Milstein創(chuàng)立細胞融合技術(shù)以來，人們制備了各種單克隆抗體，并將其應(yīng)用于分析、測定、診斷和治療。目前為止報道的單克隆抗體幾乎都是動物特別是小鼠來源的，利用細胞融合技術(shù)使免疫動物的抗體常生細胞免于死亡，即可獲得這些抗體。單克隆抗體在抗體子集(sub class)上是均一的，具有抗原結(jié)合特異性高、清除率極低等特點，被視為一種極富魅力的藥物載體。我們正致力于基于上述特點開發(fā)一種新型的藥物輸送系統(tǒng)(Drug Delivery System，DDS)。
專利文獻特開平3-80076號公報非專利文獻伊藤仁也、關(guān)根暉彬；醫(yī)學のぁゆみ，181卷，第6期，426-427，1997年發(fā)明內(nèi)容盡管已經(jīng)證實由抗CD3抗體和IL-2誘導(dǎo)產(chǎn)生的自源淋巴細胞具有抗腫瘤效果和防止先天性免疫缺陷患者病毒感染癥的功能，但僅就目前的水平，還遠遠達不到期望的良好療效。而且，即使在HLA主要分子一致的情況下進行骨髓移植和輸血，也可能由于HLA的不一致而給接受骨髓移植和劑量限制性毒性(dose limiting toxicity，DLT)治療的患者帶來致死的副作用，即有引發(fā)輸血移植后抗宿主病(Post Transfusion-Graft versus HostDisease，PT-GVHD)的危險。
關(guān)于單克隆抗體，它們?nèi)渴侨缜笆瞿菢佑每乖庖邉游锼@得的動物源抗體，在施用于人體時，抗體自身可能存在一定的免疫原性，因此很難作為常規(guī)的治療用藥。為了避免產(chǎn)生免疫原性，我們將研究如何采用雜合化或與人源抗體嵌合化(chimera)、人源化等方法處理動物源的單克隆抗體如Fab2、F(ab)’2等，以降低其免疫原性；還將研究如何利用由患者體內(nèi)篩選而得的抗體產(chǎn)生細胞或者體外(in vitro)免疫的人淋巴細胞創(chuàng)建人源抗體產(chǎn)生細胞株。
以上舉例的方法存在著抗原性殘留或者是人源抗體產(chǎn)生細胞株創(chuàng)建困難、培養(yǎng)細胞時抗體產(chǎn)生能力低等問題，因此人們非常渴望能夠建立基于其它生產(chǎn)工藝的簡便且高效的抗體制備方法。在多克隆抗體方面，面臨著與單克隆抗體相同的問題，我們正在致力于研究能夠?qū)⑵浒踩腋咝У貞?yīng)用于人類的各種方法。
本發(fā)明的發(fā)明人以開發(fā)可改善移植細胞特別是造血干細胞附著生長穩(wěn)定性的藥物、方法為目標，潛心研究的結(jié)果表明通過IL-2和抗CD3抗體刺激、增殖與移植造血干細胞HLA一致的細胞，可以制得HLA一致活性淋巴細胞，該一致活性淋巴細胞施用于患者后，可以改善移植患者的干細胞附著生長機能。
我們對移植了人造血干細胞的免疫缺陷小鼠給予HLA一致活性淋巴細胞，通過抗原致敏，成功地使所述免疫缺陷小鼠高效地產(chǎn)生了人源單克隆抗體。總之，我們的主要發(fā)明具體地說包括權(quán)利要求1中所述的發(fā)明涉及到一種使造血干細胞移植后附著生長穩(wěn)定的組合物，以HLA一致淋巴細胞為主要成分的該組合物是由從末梢血或臍帶血分離得到的單核球細胞中的HLA一致淋巴細胞經(jīng)增殖、活化后，再分離提純而制得的。
權(quán)利要求4中所述的發(fā)明涉及使造血干細胞移植后附著生長穩(wěn)定的組合物的制備方法，該制備方法包括從含有HLA一致淋巴細胞的末梢血或臍帶血中分離得到單核球細胞的步驟、增殖及活化分離所得的單核球細胞中的HLA一致淋巴細胞的步驟、分離經(jīng)增殖及活化的HLA一致淋巴細胞，制備以此為主要成分的制劑的步驟。
權(quán)利要求7中所述的發(fā)明涉及制備使造血干細胞移植后附著生長穩(wěn)定的組合物所需的試劑盒(kit)，該試劑盒包括由從末梢血或臍帶血采集而來的血液中分離獲得HLA一致淋巴細胞的器具、由含有IL-2的培養(yǎng)液以及固定有抗CD3抗體的培養(yǎng)瓶中的一種或兩種構(gòu)成的增殖、活化器具、以及從增殖、活化器具中取出培養(yǎng)的HLA一致淋巴細胞的器具。
權(quán)利要求8中所述的發(fā)明涉及一種用于產(chǎn)生人源單克隆抗體的細胞株，獲取該細胞株的方法為對哺乳類動物在移植前后給予HLA一致活性淋巴細胞，待附著生長穩(wěn)定后進行抗原致敏，再對該哺乳動物的抗原免疫細胞進行細胞株化或者是進行分離或者是進行基因的分離與表達。
權(quán)利要求9中所述的發(fā)明涉及用于產(chǎn)生人單克隆抗體的細胞株的制備方法，制備該細胞株的方法為將人造血干細胞移植入SCID小鼠等重癥復(fù)合免疫缺陷小鼠等哺乳動物體內(nèi)，通過在移植前和移植后給予HLA一致活性淋巴細胞促進其附著生長，然后進行抗原致敏，采用細胞株化、分離、基因的分離與表達等手段從該哺乳動物體內(nèi)獲取抗原致敏淋巴細胞。
如上所述，本發(fā)明是一種HLA一致增殖活性淋巴細胞，即以含有以增殖的捐獻者血細胞為主要成分的HLA一致活性淋巴細胞為明顯特征的、用于預(yù)防造血干細胞移植后附著生長不全及促進生長附著的制劑。因此可以廣泛應(yīng)用于移植時干細胞附著生長的促進等情況。除了用于促進干細胞的附著生長之外，本品還可用于促進各種器官的附著生長。而且對哺乳動物進行人造血干細胞移植，通過給予HLA一致增殖活性淋巴細胞和免疫原，可以獲得特異性的、高抗原結(jié)合力的抗體。進而，利用產(chǎn)所述抗體的細胞，可以高效地生產(chǎn)人源單克隆抗體。而且，移植了人造血干細胞并給予了HLA一致增殖活性淋巴細胞的哺乳動物，可以廣泛地應(yīng)用于抗病毒藥、抗癌藥、抗高血壓藥等藥物的篩選。
具體實施例方式
以下將依順序就上述發(fā)明的具體內(nèi)容加以說明。
HLA一致本發(fā)明所述的“HLA一致”是指在A、B、C、DR四個基因位點以及被稱為DQ、DP的數(shù)種主要HLA分子中，至少有三個位點以上是一致的。
淋巴細胞的采集通過下述方法采集用于增殖和活化的HLA一致淋巴細胞。本發(fā)明中所述的HLA一致活性淋巴細胞，是以從造血干細胞捐獻者的末梢血、淋巴節(jié)、骨髓、各種體液中采集的淋巴細胞為材料制備的。盡管通過造血干細胞培養(yǎng)的方法也可以獲得HLA一致活性淋巴細胞，但從效率的層面來講，以從捐獻者末梢血中獲得的淋巴細胞為材料是最令人期待的，而且采用這種方法可能獲得與造血干細胞捐獻者HLA至少三個位點一致的活性淋巴細胞。
關(guān)于采血方法，因腕靜脈采血簡便易行而較宜采用，實際上任何部位采集的含有淋巴細胞的血液均可作為材料，甚至可以以臍帶血為材料。
關(guān)于采血量，其范圍可以在0.001毫升至500毫升，優(yōu)選10毫升至100毫升。為了防止采集到的血液發(fā)生凝固，可向其中加入肝素或檸檬酸。
HLA一致淋巴細胞的培養(yǎng)增殖與活化采集的HLA一致淋巴細胞采用下述方法進行活化。在本發(fā)明的描述中對于采集的淋巴細胞來說，“培養(yǎng)”指將細胞組織切片置于含有細胞生長所必需的營養(yǎng)成分的培養(yǎng)液中，人工地使組織細胞增殖。所謂“增殖”是指通過上述的培養(yǎng)過程，在體外(in vitro)人工地使組織細胞的數(shù)量增加。所謂“活化”是指通過向上述的培養(yǎng)液中加入增殖因子、活性因子從而刺激細胞，調(diào)控其發(fā)揮沉滯已久的機能，具體地說就是使其具有預(yù)防附著生長不全、促進附著生長的特殊功能。
關(guān)于HLA一致活性淋巴細胞的增殖，可以采用公知的淋巴細胞培養(yǎng)方法，而且這種方法并非僅限于特定的情況。例如，據(jù)特開平3-80076號專利公報報道，在IL-2或抗CD3抗體單獨存在及上述兩者同時存在的情況下進行培養(yǎng)，均可進行細胞的增殖。在這種情況下，出于提高增殖效率的考慮，我們認為在IL-2和抗CD3抗體兩者同時存在的條件下進行培養(yǎng)最為適合。
在淋巴細胞的增殖及活化方面，除了上述的IL-2和抗CD3抗體外，還可以使用各種細胞分裂素(Cytokinin)、抗CD28抗體和各種促細胞分裂劑(mitogen)。此時，可以使用任何具有淋巴細胞增殖及活化功能的物質(zhì)。這種情況下所使用的IL-2可以為市售商品，其在培養(yǎng)液中的濃度以1-2000單位/毫升(U/ml)為宜。
IL-2可溶于水、生理鹽水、Dulbecco’s緩沖鹽溶液(Dulbecco’s bufferedSalt Solution，DPBS)以及RPMI-1640、DMED、IMDM、AIM-V等普遍使用的細胞培養(yǎng)液中。一個批次溶解的IL-2，為了防止其活力下降，最好冷藏保存。這種情況下使用的細胞培養(yǎng)液只要適于淋巴細胞培養(yǎng)即可，沒有特別限制。例如，血清等生物來源的培養(yǎng)液，向平衡鹽溶液中加入了氨基酸、維生素、核苷酸等物質(zhì)的合成培養(yǎng)液均是合適的。優(yōu)選培養(yǎng)液包括RPMI-1640、AIM-V、DMEM、IMDM等，最優(yōu)選RPMI-1640。
這種情況下所使用的細胞培養(yǎng)液可為市售商品，如果向其中添加正常人血清則增殖效果更加。除人血清外，還可使用小牛血清，也可以使用無血清培養(yǎng)液。培養(yǎng)方法采用通常的細胞培養(yǎng)方法即可，如可以在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。CO2濃度應(yīng)控制在1-10％，優(yōu)選3-7％為最佳；溫度應(yīng)控制在30℃-40℃，優(yōu)選35-38℃。
關(guān)于培養(yǎng)天數(shù)，沒有特別限定，但因需要保證抗CD3抗體的刺激信息傳達至細胞，故以2-30天為宜。當培養(yǎng)天數(shù)為3-21天時，不但細胞可以獲得穩(wěn)定的刺激信息，而且從提高培養(yǎng)效率的角度來講也較為理想。在培養(yǎng)期間可以根據(jù)在顯微鏡下觀察的細胞狀態(tài)及細胞計數(shù)的結(jié)果，適當?shù)匮a充營養(yǎng)液以提高培養(yǎng)效率。通常情況下，上述培養(yǎng)在開始的1-2天內(nèi)無明顯可見的細胞增殖現(xiàn)象，接下來隨細胞的繼續(xù)增殖，培養(yǎng)液將由橙色變?yōu)辄S色。
補加的培養(yǎng)液的量以初始培養(yǎng)液量的0.1-5倍為宜。補加培養(yǎng)液的頻率應(yīng)為每1-7天一次，優(yōu)選每3-5天一次，這樣可以有效防止培養(yǎng)液變質(zhì)和IL-2失活。在抗CD3抗體存在的條件下培養(yǎng)一段時間后，可以在無抗CD3抗體刺激的條件下繼續(xù)培養(yǎng)細胞，即可以轉(zhuǎn)移至未固定化抗CD3抗體的器具(如培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿)中進行培養(yǎng)。
在上述條件下的淋巴細胞培養(yǎng)，除無抗CD3抗體刺激外，其它條件均可與抗CD3抗體存在時的情況相同，而且，在人血清濃度、無血清培養(yǎng)液的適時使用等方面，更具有可操作性強、成本低廉、安全性高等優(yōu)勢。
在培養(yǎng)的過程中，可以使臍帶血或單核球細胞懸浮于含有IL-2的培養(yǎng)液中，并將所述細胞置于固定化有抗CD3抗體的容器內(nèi)而開始培養(yǎng)。這種情況下，可以根據(jù)需要向培養(yǎng)液中加入各種細胞分裂素和促細胞分裂劑，以提高增殖、活化細胞的效率。用于刺激淋巴細胞的抗CD3抗體，可由純化的CD3分子免疫動物或細胞制備，也可使用性質(zhì)穩(wěn)定、價格低廉的市售OKT3抗體(生產(chǎn)商ォ-ソフア-マス-テイカル)。
對于使用的抗體，只需該抗體具有促進淋巴細胞增殖、活化功能，其它沒有特別限定，比如還可以使用抗CD28抗體等。從淋巴細胞的增殖效率、操作的簡便程度等方面考慮，將抗CD3抗體固定化后再行利用較為妥當。固定化抗體的器具可以使用玻璃、聚氨酯、聚烯烴、聚苯乙烯等材料的細胞培養(yǎng)容器。從操作簡便的角度出發(fā)，通?？梢允褂檬惺鄣囊褱缇募毎囵B(yǎng)瓶，同時可根據(jù)需要選擇合適的尺寸。
所謂固定化，是將抗CD3抗體的稀溶液加入上述的用于固定化抗體的容器中靜置一段時間，比如在4-37℃下靜置2-24小時，即可完成。在固定化抗CD3抗體的過程中，需先用滅菌的Dulbecco’s緩沖鹽溶液(DPBS)等生理緩沖液對抗CD3抗體進行稀釋，使其濃度在0.1-30微克/毫升。容器在固定化后至使用前通常是保存在冷藏室或冰箱(4℃)中的，這種情況，在使用時應(yīng)先除盡液體，必要時可用常溫的Dulbecco’s緩沖鹽溶液等生理緩沖液洗凈容器。
上述方法增殖而得到的末梢血來源的HLA一致活性淋巴細胞，在經(jīng)加工或如后述進行制劑后，可以作為一種廣泛應(yīng)用的生物防御手段，比如用作移植后的防止附著生長不全、促進生長附著的治療藥物。
在移植時，為了避免發(fā)生輸血移植后抗宿主病(PT-GVHD)及其它副作用，可使用抗CD4抗體等進一步處理已制備的末梢血來源的活性淋巴細胞，使其成為以CD4陽性細胞為主的細胞群，該產(chǎn)品對預(yù)防上述副作用的發(fā)生效果較佳。
含有CD8陽性細胞的產(chǎn)品，可以有效減少GVHD等副作用的發(fā)生，或者在防止附著生長不全、促進附著生長的基礎(chǔ)上同時具有抗腫瘤和抗病毒的效果。這種情況下，可以制備適當CD8陽性細胞含量的細胞群用于疾病治療。
以HLA一致活性淋巴細胞為主要成分的制劑將以增殖細胞為主要成分的HLA一致活性淋巴細胞以一定形態(tài)制劑化，比如可以將其懸浮在含有人白蛋白的輸液用生理鹽水中，可以用作防止附著生長不全、促進附著生長的治療制劑；也可以通過添加各種醫(yī)藥成分(component)實現(xiàn)制劑化。這里所述的“制劑”是指以活性淋巴細胞為主要成分的具有生物防御功能的一切材料，只要其中含有HLA一致活性淋巴細胞，無論何種具體形態(tài)，均在所述之列。
例如，制劑的形態(tài)可以是將HLA一致活性淋巴細胞懸浮于適當?shù)娜芤褐?，這種情況下，優(yōu)選上述的將HLA一致活性淋巴細胞懸浮于含有人白蛋白的輸液用生理鹽水中的制劑形態(tài)，但并不僅限于此。
這種情況下，可以使末梢血或臍帶血直接在試管內(nèi)進行增殖，制備以HLA一致活性淋巴細胞為主要成分的制劑；也可以先從末梢血或臍帶血中分離出單核細胞，再使分離出的單核細胞在試管內(nèi)進行增殖，制備以HLA一致活性淋巴細胞為主要成分的制劑。此外，本發(fā)明所述的制劑中含有的HLA一致活性淋巴細胞，可以是導(dǎo)入了各種其它基因的細胞，也可以是缺失了某些原有基因或原有基因發(fā)生變異的細胞。
用于制備以HLA一致活性淋巴細胞為主要成分的制劑的試劑盒在制備本發(fā)明所述的以HLA一致活性淋巴細胞為主要成分的制劑時，除了可以使用單獨的試劑、器材之外，還可以將它們組合起來加以利用。例如，使用將含有IL-2的培養(yǎng)液和固定化有抗CD3抗體的培養(yǎng)瓶作為組成部分組合在一起而得到的試劑盒，可以比較容易地制備發(fā)明中所述的制劑。
這種情況下使用的培養(yǎng)液，可以預(yù)先分裝在固定化有抗CD3抗體的培養(yǎng)瓶中，從而進行冷凍保存。像這樣，將至少2個組成部分組合成試劑盒，必要時用于活性淋巴細胞的培養(yǎng)，可以較為容易地制備本發(fā)明中所述的制劑。
如上所述的所有可能用于本發(fā)明的HLA一致活性淋巴細胞或者含有該成分的制劑，均可冷凍保存，并可根據(jù)需要作為附著生長穩(wěn)定劑，起到預(yù)防附著生長不全、促進附著生長等作用。HLA一致活性淋巴細胞可以按如下方法冷凍保存。
需保存的HLA一致活性淋巴細胞，應(yīng)以其大小選擇適當?shù)臐舛葢腋∮诩毎４嬉褐?，冷凍保存時細胞懸浮在保存液中的濃度應(yīng)為1×103個/毫升至1×1010個/毫升，其中以1×105個/毫1至1×108個/毫升為宜。此外，這種情況下使用的細胞保存液的量沒有特別要求，從操作方便的角度考慮，應(yīng)控制在0.1毫升至1000毫升，其中以0.5毫升至100毫升為宜。
在進行冷凍保存時，不僅可以使用市售的細胞保存液，還可以自行配制細胞保存液。作為細胞保存液的成分，是在合適的緩沖液或基本培養(yǎng)基中加入血清或者蛋白質(zhì)、多糖等大分子，以及二甲基亞砜(DMSO)等化學物質(zhì)，但根據(jù)需保存的HLA一致活性淋巴細胞的要求，保存液中未必含有上述列舉的全部成分。實際使用的細胞保存液只要適于保存HLA一致活性淋巴細胞，不必僅限于上述組成成分。HLA一致活性淋巴細胞可懸浮于合適的細胞保存液中在低溫下冷凍保存。
給藥量關(guān)于以HLA一致活性淋巴細胞為主要成分的制劑的給藥量，應(yīng)視移植患者的狀態(tài)、治療對象等適當增減。通常情況下應(yīng)為每1千克體重給予淋巴細胞1×102個至1×109個。為提高療效，每1千克體重給予給藥量應(yīng)在1×103個以上，但如超過5×108個，療效未見有明顯提高，因此，給藥量以1×103至5×108個細胞/千克體重為最佳。
給藥形態(tài)和方式上述制劑的給藥形態(tài)以注射劑和點滴劑等液體制劑為宜，將前面所說的細胞分散至添加有0.01％-5％人血清白蛋白的生理鹽水中的注射劑和點滴劑較為理想。關(guān)于給藥方式，以靜脈點滴或靜脈、動脈、局部注射為宜。液體制劑的給藥量因給藥方式和給藥部位而異，優(yōu)選為1-500毫升，更優(yōu)選上述液體制劑中所含的細胞數(shù)與前述的淋巴細胞的給藥量要求相符。給藥頻率應(yīng)為每日1次至每月1次，給藥次數(shù)應(yīng)至少為1次。
人單克隆抗體的制備下面將說明一種使用動物高效地制備可用于細胞移植后的安全性高且附著生長良好的人單克隆抗體的方法。具體地說，就是針對免疫缺陷的動物在移植前和移植后分別給予HLA一致活性淋巴細胞，附著生長穩(wěn)定后，進行抗原致敏，通過細胞株化或者分離、基因的分離與表達等方法從該動物獲得抗原免疫淋巴細胞。
關(guān)于這里使用免疫缺陷動物，具體地講可以是牛、馬、綿羊、山羊、家兔、豚鼠、大鼠、家雞、家鴨等，從易于管理和操作簡便的角度出發(fā)，以小鼠最為適合。其中，SCID(severe combined immunodeficiency，以下簡稱SCID)小鼠是目前已知的血液免疫球蛋白濃度較BALB/c小鼠的免疫球蛋白(Ig)重鏈異型共有基因(allotype congenic)系小鼠——C.B-17小鼠更低的小鼠物種，患有重癥復(fù)合免疫不全癥，呈現(xiàn)嚴重的免疫缺陷狀態(tài)。
SCID小鼠缺少免疫系統(tǒng)的主要功能細胞——成熟T細胞及B細胞，這是因為表達某些特定分子必須具有特定的基因，而SCID小鼠的與合成這些特定基因相關(guān)的酶系(recombinase)異常，特別是酶系缺少基質(zhì)特異性。因此，SCID小鼠幾乎不產(chǎn)生自身抗體，因而不僅不受抗體依賴細胞的細胞毒作用(ADCC)影響，而且抗原呈遞細胞、NK細胞等的機能也不認定其為異常。
與裸鼠、Tc小鼠(Transchromo Mouse)或者經(jīng)放射線照射一次性喪失免疫功能的小鼠相比，SCID小鼠具有一定優(yōu)勢。利用SCID小鼠的優(yōu)勢，可以植入異種動物的各種組織和腫瘤以分析抗癌藥物的作用機制，或者建立獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)、愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染等人類特有疾病的研究模型。此外，將人胎兒胸腺或胎肝的切片在保持其組織學結(jié)構(gòu)的前提下植入SCID小鼠的腎皮膜下，這樣的小鼠稱為SCID-hu小鼠，將人末梢血淋巴細胞(PBL)植入腹腔內(nèi)，則稱為hu-PBL-SCID小鼠——這些已為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。
后者通過免疫小鼠可以誘導(dǎo)產(chǎn)生針對破傷風毒素、乙型肝炎病毒C等的人抗體。利用SCID小鼠，通過植入各種異種異系的組織，特別是人體組織，可以建立使用其它動物無法獲得的人類疾病模型，如此構(gòu)建的自身免疫疾病模型就相當值得人們期待。
在本發(fā)明中，還可以利用上述的SCID小鼠作為人單克隆抗體的制備方法。本發(fā)明中利用的SCID小鼠一般為5-15周齡，其中以8-12周齡為宜。
具體來講，可將從含有人干細胞的末梢血、骨髓、臍帶血或免疫組織比如脾臟中以經(jīng)典的方法提取純化的人淋巴細胞成分懸浮于生理鹽水、磷酸緩沖生理鹽水(PBS)等對細胞及生物體無影響的溶液中，然后植入SCID小鼠的腹腔內(nèi)或靜脈內(nèi)。懸浮的人淋巴細胞濃度應(yīng)為1×107個至5×108個，其中以1×108個左右為宜。
這種情況下，作為一種植入方法，可以先將移植細胞包被在免疫隔離膜中再將其植入動物腹腔。采用這種方法，由于免疫隔離膜的存在避免了移植細胞與宿主組織的接觸，有效抑制了移植抗宿主(graft-versus-host，GVH)現(xiàn)象的發(fā)生，同時還可以提高產(chǎn)生針對目的抗原的抗體的效率。
人抗原特異性抗體產(chǎn)生細胞的收獲通常選擇在移植后7天至60天內(nèi)進行，其中以7天至28天為宜，特別以25天至28天為最佳。此外，為保證收獲效率，應(yīng)自移植后的第7天開始，每周從SCID小鼠的眼窩適量取血液一次，以檢查其中人抗體量及人抗原特異性抗體效價是否呈上升趨勢。
人抗體含量及人抗原特異性抗體效價的測定可以采用酶免疫測定法(以下簡稱EIA)、被動紅血球凝集反應(yīng)法、熒光抗體法、放射性免疫法、點免疫分析法等方法，在抗原為可溶性抗原的情況下，通常采用使用固定化有抗人源免疫球蛋白抗體和目的抗原的免疫板(如丹麥ヌンク公司產(chǎn)品)的公認的酶免疫測定法。通過采用上述測定方法，我們可以從抗體含量和抗體效價高的SCID小鼠體內(nèi)收獲人抗體產(chǎn)生細胞。
從SCID小鼠的各臟器均可以收獲抗體產(chǎn)生細胞，但從收獲率、產(chǎn)品純度的角度考慮，選擇淋巴結(jié)是最為合適的。本發(fā)明中采用抗體效價測定以及血小板法、熒光免疫測定法等方法，這與傳統(tǒng)的試管內(nèi)培養(yǎng)細胞的方法相比，在誘導(dǎo)人抗體產(chǎn)生細胞方面是非常成功的，且對獲取人單克隆抗體十分有利。
關(guān)于本發(fā)明中人抗體產(chǎn)生細胞的收獲及精制的具體方法，可以按以下方式進行。首先采用物理方法將各臟器單細胞化，如果從臟器收獲的細胞中抗體產(chǎn)生細胞所占比例較大，即可直接用于制備抗體產(chǎn)生細胞株；如果抗體產(chǎn)生細胞的純度較低，比如混有較多的SCID小鼠細胞，為提純抗體產(chǎn)生細胞可采用的方法有密度梯度離心法、抗源淘篩(panning)法、使用抗小鼠細胞抗體與補體除去小鼠細胞的細胞溶解法以及經(jīng)典的使用抗B細胞抗體的親和層析(affinity column)法。
接下來，按以下步驟將純化的人抗體產(chǎn)生細胞細胞株化。細胞株化的方法主要有借助愛潑斯坦—巴爾病毒(EBV)的基因組法以及融合于合適的增殖性細胞的細胞融合法等。采用借助EBV的基因組法，需先按典型方法制備EBV，比如細胞株B95.8的培養(yǎng)上清等按1∶10至10∶1的比例添加到懸浮有0.5-5×107個細胞/毫升人抗體產(chǎn)生細胞的增殖培養(yǎng)基中，在37℃下反應(yīng)1小時-18小時。
反應(yīng)結(jié)束后，在室溫下以在經(jīng)離心的培養(yǎng)基中1×106個/毫升至5×105個/毫升的細胞濃度加入96孔板內(nèi)，每孔加入的體積為0.1毫升。然后置于二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)7天至30天，取有細胞增殖現(xiàn)象的小孔中的培養(yǎng)基上清，應(yīng)用上述的EIA等篩選方法，可以分離得到產(chǎn)生目的抗體的重組細胞。
細胞融合可以依公知的方法進行?？梢允褂玫娜诤蟿┯芯垡叶?以下簡稱PEG)、仙臺病毒等。此外，也可以不使用融合劑而直接進行電轉(zhuǎn)化，但最好使用PEG。適宜的PEG的平均分子量為1000-9000，其中以PEG4000和PEG6000為最佳。
這種情況下的PEG的濃度應(yīng)為10％至80％，其中以40％至50％為佳。細胞融合所使用的親本細胞可以是任何細胞株，但最好具有藥物標記。較為理想的細胞有骨髓系細胞株和人淋巴系細胞株等，特別以人淋巴細胞株AC-33、人淋巴芽球細胞LICR-2或SKO-007為佳。所述細胞融合，首先需要將通過SCID小鼠獲得的抗體產(chǎn)生細胞與適當?shù)募毎?應(yīng)為人骨髓系細胞或人淋巴系細胞株，以人淋巴細胞株AC-33為佳)分別用無血清培養(yǎng)基洗凈，然后將兩者以1∶1至10∶1的比例混合，室溫、700轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，從而得到富集細胞(cell pellet)。
將富集細胞置于37℃下溫浴并使其中的細胞分散開來，然后向其中緩緩加入預(yù)熱的PEG溶液，混勻。一般PEG的用量為1毫升/108個細胞，可以根據(jù)需要進行增減。接下來，再向其中緩緩加入預(yù)熱的培養(yǎng)基以稀釋PEG溶液。培養(yǎng)基的添加速度一般控制在每10分鐘1-30毫升。
在室溫下離心收集細胞，作為親本細胞株以1-5×105個/毫升的濃度在含有10％小牛血清(以下簡稱FCS)的培養(yǎng)基中靜置一夜，然后加入含有次黃嘌呤(hypoxanthine，H)、氨基喋呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶(thymidine，T)(HAT)和10％FCS的培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基)。此步操作可以省略，而在細胞融合后將細胞直接懸浮在HAT培養(yǎng)基中。在其后的2至3周內(nèi)，應(yīng)該數(shù)次更換培養(yǎng)基。
更換培養(yǎng)基的方法是先移除0.1至0.2毫升陳舊培養(yǎng)基，然后補加等量的HAT培養(yǎng)基。這期間如果發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)了可能的雜交系，應(yīng)盡早采用前述的EIA等適合的方法進行篩選，并將產(chǎn)生目的抗體的雜交系分離出來。分離得到的雜交系應(yīng)重新采用適當?shù)姆椒ㄟM行檢測加以確認。
用于細胞培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基可以是美味T培養(yǎng)基(日本制藥)、ダルべツコ改變イ-グル培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、イスコフ改變ダルべツコ培養(yǎng)基等。在利用EBV進行基因重組時，可向上述培養(yǎng)基中添加約20％的FCS作為增殖培養(yǎng)基；而采用細胞融合法時，需添加的FCS濃度為10-15％。從這樣獲得的人特異抗體產(chǎn)生細胞株中可以采用公知的方法提取人單克隆抗體。
例如，通過向SCID小鼠的腹腔內(nèi)植入人抗體產(chǎn)生細胞，可以獲得含有高濃度的與小鼠雜交系相同的單克隆抗體的腹水。此外，使用適當?shù)臒o血清培養(yǎng)基比如生長抑制試驗(Growth inhibition test，GIT)培養(yǎng)基(日本制藥)、HB104(ハナメデイア公司)、ハイブリテイI(日本藥品開發(fā)公司)等，可以進行大量培養(yǎng)。合理地組合使用各種經(jīng)典的分離、精制方法，可以從上述的腹水及培養(yǎng)液上清中大量獲取高純度的人單克隆抗體。
這種情況下，可以先將含有抗體的溶液進行離心分離，然后對上清液進行鹽析處理。鹽析時通常使用硫酸銨，所得到的蛋白質(zhì)沉淀再經(jīng)適當?shù)木彌_液溶解并透析后，可以采用柱層析(二乙胺基乙基纖維素(DEAE)離子交換柱、羥基磷灰石柱、凝膠過濾柱、蛋白A柱、蛋白G柱等)、免疫親和層析等手段分離精制目的人單克隆抗體。這種方法精制而得的人單克隆抗體的純度可達99.9％以上，完成符合人用藥物制劑的要求。
抗體可分為IgA、IgM、IgG、IgD、IgE等類型，其中小鼠的IgG又分為IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3(人類為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)4種亞型。對動物給予抗原刺激時，產(chǎn)生的抗體幾乎全是IgM或IgG。IgG的分子量約為16萬，具有二聚體結(jié)構(gòu)，是一種比較易于處理的分子。而IgM是一種分子量約為90萬的大分子，以J鏈彼此相連的五聚體形式存在，因此具有許多明顯的不足，比如分離純化困難、易發(fā)生凝集反應(yīng)而難于保存，易因蛋白酶的部分水解失活而難于制備Fab片段，以抗癌藥物、毒素等進行化學修飾時容易喪失結(jié)合活性等。
關(guān)于IgG型單克隆抗體和IgM型單克隆抗體哪一種在治療癌癥方面的表現(xiàn)更為出色，Bemstein等曾經(jīng)利用針對淋巴細胞Thy-1抗原的IgG型單克隆抗體和IgM型單克隆抗體進行了十分詳細的研究。(見《monoclonalAntibodies》，R.H.Kennet，T.J.Mc Keamand，K.B.Bechtol編著，Plenum Press，1980，P.275)據(jù)此，比較對于Thy-1抗原陽性淋巴細胞具有相同反應(yīng)性的IgG型單克隆抗體和IgM型單克隆抗體的抗腫瘤作用的研究結(jié)果表明盡管IgM單克隆抗體在體外(in vitro)表現(xiàn)出較好的補體依賴抗腫瘤效果；但當使用癌癥小鼠進行體內(nèi)(in vivo)抗腫瘤效果研究時，IgG型單克隆抗體表現(xiàn)出了有效地抗腫瘤作用，而IgM型單克隆抗體則未見明顯效果。
在通過給予小鼠放射性標記單克隆抗體來研究其在血液中的半衰期時發(fā)現(xiàn)，IgM型單克隆抗體的血液半衰期遠比IgG型單克隆抗體要短得多。上述研究結(jié)果表明，IgG型單克隆抗體更適合應(yīng)用于臨床。
本發(fā)明所述的人源抗體，可以單獨使用，也可以與一種或一種以上的制劑方面許可使用的輔劑聯(lián)合使用。比如，將人源抗體溶于生理鹽水、葡萄糖、乳糖、甘露醇等的水溶液中可以作為適宜的醫(yī)藥組合物；或者使用常規(guī)方法將人源抗體凍干，再向其中加入氯化鈉可以制成粉末注射劑。根據(jù)需要，還可以向上述醫(yī)藥組合物中加入制劑領(lǐng)域中通用的添加劑，比如制劑方面許可使用的各種鹽類。
本發(fā)明中所述組合物的給藥量因患者的年齡、病情等情況而異。對于包括人在內(nèi)的哺乳動物，人源抗體的給藥量一般為0.2-20毫克/千克·日。給藥可以采取一日一次(單次給藥或連續(xù)給藥)或間隔性地1周1-3次，也可2至3周一次進行靜脈注射。
利用基因工程手段從人單克隆抗體產(chǎn)生細胞株制備人單克隆抗體的方法利用基因工程手段，將從本發(fā)明所述的人單克隆抗體產(chǎn)生細胞中提取的編碼人單克隆抗體的基因裝載在合適的表達載體上，然后導(dǎo)入宿主細胞中，這樣可以獲得能夠產(chǎn)生人單克隆抗體的重組細胞。
本發(fā)明中所利用的基因，可以通過常規(guī)方法或其他各種方法獲得并進行克隆見(L.G.Davis等人編著，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier發(fā)行，New York 1986，及J.Feder等人Am.J.Hum.Genetics，37，635(1985))。
本發(fā)明中所利用的mRNA，也可以通過常規(guī)的經(jīng)典方法制備，并可以此為材料制備cDNA，并進行克隆(見J.Sambrook等人編著Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press發(fā)行，NewYork，1989)。
例如，可以通過公知的方法從基因組文庫中獲取。即首先采用標準方法制備細胞的基因組。比如，在十二烷基硫酸鈉(SDS)存在的條件下，用蛋白酶K處理細胞后，酚抽提，然后用不含DNA酶的RNA酶A(DNase-freeRNase A)處理，再酚抽提，這樣即可獲得基因組DNA(村松正實編著《ラボマニユアル遺傳子工學》，丸善株式會社，59頁(1988))。
接下來，采用標準方法分離獲取含有抗體可變結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)的目的基因。所述方法是通過用限制性核酸內(nèi)切酶處理基因組DNA使其片段化，將得到的限制性片段克隆到適當?shù)闹亟MDNA克隆載體上，采用放射性探針或酶標探針篩選本發(fā)明所述的DNA序列，并將其分離出來。從基因組中取得的DNA序列一般含有不編碼多肽的內(nèi)含子，可以采用公知的方法進行DNA刪除或置換(見W.Kramer等，Nucleic Acids Res.12，9441，1984年，及T.A.Kvnkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488，1985年)。
本發(fā)明所述的編碼人單克隆抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)多肽的DNA序列，也可以采用公知的方法從cDNA文庫中獲取(見H.Okayama等，Mol.cell.Biol.，2，161，1982年)。即采用標準方法提取人單克隆抗體產(chǎn)生細胞的mRNA，將細胞在含有硫氰酸胍的溶液勻漿后，在三氟乙酸銫的EDTA溶液中進行密度梯度離心分離得到富集RNA，然后用寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸(Oligo-dT)柱回收poly(A)+-RNA。
以poly(A)+-RNA為模板，以O(shè)ligo-dT引物或者隨機引物或者目標抗體基因特異性DNA序列為引物，采用公知的方法合成cDNA第一鏈，再以cDNA第一鏈為模板合成cDNA第二鏈(村松正實編著《ラボマニュアル遺傳子工學》，丸善株式會社，第70頁，第77頁，1988年)。
將采用公知的方法獲得的上述cDNA克隆到合適的克隆載體上，然后采用適當?shù)奶结槒闹泻Y選出編碼抗體可變區(qū)的cDNA。在分離獲得所期望的克隆后，基本上可以采用以基因組DNA相同的方法處理cDNA。此外，還可以采用經(jīng)典的方法通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR反應(yīng))(polymerase chainreaction)擴增編碼人單克隆抗體輕鏈及重鏈可變區(qū)的基因(見R.Orlandi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，3833，1989年)。
此外，編碼輕鏈及重鏈可變區(qū)的基因還可通過常規(guī)的化學合成方法獲得(N.D.Shina等人，Nucleic Acids Res.，12，4359，1984年)。這些化學合成的DNA中，即使以簡并密碼子代替原來的密碼子，翻譯時仍然會得到相同的氨基酸，因此它們沒有必要與分子克隆方法獲得的DNA序列完全一致。
本發(fā)明中所述的人單克隆抗體輕鏈及重鏈的恒定區(qū)基因，可以從基因組DNA或cDNA中篩選獲得，也可通過化學合成方法獲得。利用這樣獲得的編碼人單克隆抗體恒定區(qū)的DNA序列，可以得到免疫原性極低的輕鏈及重鏈多肽。這種編碼人單克隆抗體恒定區(qū)多肽的DNA序列，也可以從各種人淋巴細胞，比如末梢血淋巴細胞中提取獲得。
采用公知的方法，可以將所獲得的DNA序列導(dǎo)入合適的重組DNA克隆載體及重組DNA表達載體中(Y.Gluzman等人，Eukaryotic Viral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratories發(fā)行)。
在本發(fā)明中，將編碼輕鏈多肽及重鏈多肽的DNA序列作為表達載體的一部分導(dǎo)入適當?shù)乃拗骷毎?。本發(fā)明中用于表達人單克隆抗體的宿主細胞以雜合系、中華倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)(Chinese hamster ovary)、骨髓瘤細胞、形質(zhì)細胞瘤細胞、淋巴瘤細胞等為宜，也可以使用植物來源的宿主細胞。
人源多克隆抗體的制備方法下面將說明一種使用動物高效地制備細胞移植后安全可靠、且附著生長性能良好的人源多克隆抗體的方法。具體地說，就是針對免疫缺陷的動物在移植前和移植后分別給予HLA一致活性淋巴細胞，附著生長穩(wěn)定后，進行抗原致敏，通過細胞株化或者分離、基因的分離與表達等方法從該動物獲得抗原免疫淋巴細胞。
關(guān)于這里使用的免疫缺陷動物，具體地講可以是牛、馬、豚鼠、大鼠、家雞、家鴨等，在哺乳動物中從易于管理和操作方便的角度出發(fā)，以山羊和家兔為宜，而且從上述動物體內(nèi)收獲的多克隆抗體的量也較多。此外，還應(yīng)根據(jù)動物種類的不同選擇合適的免疫原的量及免疫的時間間隔。
關(guān)于免疫方法，可以采用任何免疫動物的常規(guī)方法。比如可通過動物皮下、腹腔、靜脈、肌肉、皮膚等途徑進行免疫。此外，免疫原最好與市售的弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、卡介苗(BCG)、氫氧化鋁凝膠、百日咳疫苗等適當?shù)拿庖咦魟┕餐褂谩?br>
本發(fā)明中所述的單克隆抗體及多克隆抗體具有無抗原性或抗原性低的顯著特點，在用于治療感染癥、藥物中毒的抗血清的替代品、使用抗基因型抗體的疫苗、針對消除炎癥反應(yīng)的接合分子的抗體、以及催化抗體等各個治療、診斷領(lǐng)域時，均表明出相當明顯的優(yōu)勢。
作為一種診斷試劑，本發(fā)明所述的抗體在具體應(yīng)用中，可以通過化學的或基因工程的方法與酶、色素、放射性同位素等合適的標記物結(jié)合而成為標記抗體。在作為治療藥物時，如果抗原本身是毒素等活性物質(zhì)，則可以單獨使用具有抗原活性中和能力的本發(fā)明所述的抗體；本抗體也可以與其它藥物聯(lián)合使用而成為混合制劑，比如在針對癌癥、血栓等疾病時，就可將其通過化學的或基因工程的方法與其它藥物結(jié)合起來制成抗體靶向性藥物，用于治療。
本發(fā)明所述的單克隆抗體及多克隆抗體根據(jù)要求，例如經(jīng)薄膜濾器過濾、除菌后，可以將其本身或與適宜的藥理學上允許使用的載體、賦形劑、稀釋劑等一起，采用常規(guī)的方法制成以注射劑為佳的非口服制劑。這種制劑經(jīng)哺乳動物(大鼠、小鼠、家貓、家犬、家豬、牛、猴、人等)的皮下、靜脈或肌肉給藥，是治療各種疾病的有效手段。
將本發(fā)明所述的人單克隆抗體及多克隆抗體溶解于磷酸緩沖液、生理鹽水、林格氏液等適宜的溶劑中，可以采用常規(guī)方法進行無菌處理并封裝至安瓶中。這些液體藥劑在經(jīng)常規(guī)方法凍干后可以成為固體藥劑。關(guān)于本發(fā)明所述的人單克隆抗體和多克隆抗體的給藥劑量，因給藥對象的體重、年齡、性別及疾病種類、癥狀和給藥途徑而異。一般來說，給予的免疫球蛋白的量應(yīng)為1日一至數(shù)次間隔或連續(xù)給藥，每日1微克至1毫克/千克體重。
實施例1以下通過實施例1對本發(fā)明加以闡述。
(1)固定化鼠抗CD3單克隆抗體(OKT3)的中號及大號培養(yǎng)瓶的制備先用PBS(-)配制5微克/毫升的OKT3溶液，然后向中號培養(yǎng)瓶中加入5毫升、大號培養(yǎng)瓶中加入10毫升該溶液，使溶液均勻地覆蓋培養(yǎng)瓶底部。使用之前需在冷藏室內(nèi)保存。
(2)從移植用臍帶血中回收淋巴細胞將按上述(1)中所述方法制得的OKT3固定化培養(yǎng)瓶(中號)中的OKT3溶液用吸液器吸凈。向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入10毫升PBS(-)，蓋好瓶蓋劇烈振蕩，打開瓶蓋，倒出其中的液體。然后在超凈臺內(nèi)再向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入10毫升PBS(-)，蓋好瓶蓋、劇烈振蕩，打開瓶蓋，倒去其中的液體。
用吸液器小心地將培養(yǎng)瓶和瓶蓋內(nèi)的液體吸盡，向其中加入臍帶血，再向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入10毫升培養(yǎng)用培養(yǎng)基(由44毫升RPMI1640+7培養(yǎng)基、1毫升35000單位/毫升(U/ml)的IL-2、5毫升人血清配制而成，簡稱培養(yǎng)用培養(yǎng)基)，輕輕攪拌，移取均勻的細胞懸浮液樣品，細胞計數(shù)用10微升，CD4、CD8陽性細胞含量測定用1500微升(可用1.5毫升離心管3支，各裝入500微升)，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，開始培養(yǎng)(培養(yǎng)的第0天)。
(3)基于提爾克氏液的細胞計數(shù)將前述(2)中采集的臍帶血10微升與40微升提爾克氏液混合，取10微升加于血球計數(shù)板上，在顯微鏡下測定細胞的數(shù)目。由上述結(jié)果可知培養(yǎng)瓶內(nèi)的總細胞數(shù)在1.3×106個左右。
(4)細胞表面抗原分析將上述(2)中所配制的3管細胞懸濁液于4℃，6000轉(zhuǎn)每分鐘離心5分鐘，以沉淀細胞。吸去上清液，向管1中加入PBS(-)8微升、CD3/HLA-DR抗體8微升，管2中加入PBS(-)8微升、CD4/CD8抗體8微升，分別反應(yīng)30分鐘。
管3只加入PBS(-)8微升，作為非特異性反應(yīng)對照。反應(yīng)后向每管中加入鞘液(コ-ルタ-株式會社制アイソトンII)800微升，旋渦混合后，4℃，6000轉(zhuǎn)每分鐘離心5分鐘，以沉淀細胞。小心吸去上清液，加入800微升鞘液，反復(fù)吹吸，重懸細胞，然后轉(zhuǎn)移至用于FACS測定的小管中。
熒光活性細胞分選(FACS)需使用細胞流式儀(FACScan)，基于FACS的測定應(yīng)遵照操作指南進行操作。測定結(jié)果表明，CD3、HLA-DR、CD4及CD8陽性細胞的含量分別為28％、3％、46％和5％。
(5)基于磁性小球標記的抗CD8抗體的CD4陽性細胞的制備與培養(yǎng)上述(2)中的培養(yǎng)結(jié)果，在培養(yǎng)第5天時，細胞總數(shù)可達3.4×107個，CD4及CD8陽性細胞分別達到9.5×106個左右。將這些細胞轉(zhuǎn)移至50毫升離心管中，20℃，1000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘。離心后棄上清，用旋渦振蕩器充分重懸細胞。
接下來，向15毫升小管中加入含有相當于CD8陽性細胞4倍量的小球的磁性小球標記抗CD8抗體300微升，放置于磁鐵裝置MPC-1上，反應(yīng)1分鐘。小心移取溶液，不要吸入小球，然后將小管從磁鐵上移開。向小管內(nèi)加入1毫升PBS(-)溶液，充分攪拌，重復(fù)上述操作。再向小管內(nèi)加入1毫升PBS(-)，充分攪拌。并重復(fù)上述操作一次。
向離心回收得到的細胞懸濁液中加入5毫升反應(yīng)用培養(yǎng)基(由清洗用培養(yǎng)基45毫升加人血清5毫升混合配制而成)，輕輕地重懸細胞，然后將細胞轉(zhuǎn)移至盛有磁性小球標記的抗CD8抗體的小管內(nèi)，以振蕩器輕輕振蕩，于冷室內(nèi)反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)后將小管置于磁鐵上，反應(yīng)1分鐘。小心移取溶液，不要吸起小球，將溶液轉(zhuǎn)移至一個新的15毫升小管內(nèi)。再次置于磁鐵上，反應(yīng)1分鐘后，小心移取溶液，不要吸起小球，將溶液回收到新的小管內(nèi)，20℃、1000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘。離心后棄上清，用旋渦振蕩器充分重懸沉淀的細胞。
向回收得到的CD4陽性細胞中加入培養(yǎng)基10毫升，輕輕懸浮細胞。將上述(1)中所制作的OKT3固定化培養(yǎng)瓶(中號)中的OKT3溶液用吸液器吸盡。向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入10毫升PBS(-)，蓋好瓶蓋，劇烈振蕩，打開瓶蓋，倒去其中的液體。然后在超凈臺中再向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入10毫升PBS(-)，蓋好瓶蓋，劇烈振蕩，打開瓶蓋，倒去其中的液體。用吸液器小心地吸盡培養(yǎng)瓶和瓶蓋內(nèi)殘留的液體，向其中加入細胞懸浮液。取細胞計數(shù)用樣品10微升、CD4、CD8陽性細胞含量測定樣品1000微升(可用1.5毫升離心管2支，各裝入500微升)，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，開始培養(yǎng)。(培養(yǎng)的第0天)。
(6)CD4陽性細胞的擴大培養(yǎng)在培養(yǎng)的第3天、第4天，分別向上述(5)中所述的細胞培養(yǎng)液內(nèi)各自加入培養(yǎng)用培養(yǎng)基20毫升。在培養(yǎng)的第5天，為進一步擴大培養(yǎng)，需更換體積較大的OKT3固定化培養(yǎng)瓶。即，將上述(1)中所制作的OKT3固定化培養(yǎng)瓶(大號)中的OKT3溶液用吸液器吸盡，向其中加入PBS(-)50毫升，蓋好瓶蓋，劇烈振蕩，打開瓶蓋，倒去其中的液體。
再次向培養(yǎng)瓶中加入50毫升滅菌的PBS(-)，蓋好瓶蓋，劇烈振蕩，打開瓶蓋，倒出其中的液體。小心地用吸液器吸盡殘留在培養(yǎng)瓶和瓶蓋中的液體。反復(fù)輕輕敲打生長有細胞的中號培養(yǎng)瓶，使附著在其底部的細胞脫離下來，將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移至處理好的大號培養(yǎng)瓶中。然后向這個大號培養(yǎng)瓶中加入新的培養(yǎng)用培養(yǎng)基50毫升，重懸起其中的細胞，將其轉(zhuǎn)移至一個新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。
(7)CD4陽性細胞的冷凍保存上述(6)中的培養(yǎng)細胞液，在培養(yǎng)第6天時，應(yīng)按下述方法冷凍保存。保存方法是，首先反復(fù)輕輕敲打培養(yǎng)瓶底面，使附著在其底部的細胞脫離下來，從培養(yǎng)瓶中取出500微升培養(yǎng)液，涂布于胰蛋白胨大豆(TSA)瓊脂培養(yǎng)基上，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)，進行無菌試驗。然后再從培養(yǎng)瓶中取出10微升培養(yǎng)液用于細胞計數(shù)。
接下來，向兩支50毫升離心管中各加入培養(yǎng)細胞40毫升，1000轉(zhuǎn)每分鐘，20℃離心5分鐘。棄上清，用旋渦混合器重懸起沉淀的細胞，分別將細胞懸浮液和細胞保存液(由人血清5毫升、DMSO 5毫升、RPMI1640+7培養(yǎng)基40毫升混合而成)置于冰水中冷卻5分鐘，然后將4.5毫升細胞保存液和細胞懸浮液混于一個管內(nèi)，輕輕吹吸以混勻細胞，以等量加入3支細胞保存用小管(2.0毫升)中。
然后將小管置于低溫冰箱中，于-80℃放置數(shù)日，其后可以置于液氮中保存。培養(yǎng)時細胞的濃度為1.9×106個/毫升，保存時每管中約含有5.1×107個細胞。
(8)基于臺盼蘭溶液的細胞計數(shù)將上述(7)中采集的細胞懸浮液10微升與20微升臺盼蘭溶液混合，取10微升加于血球計數(shù)板上，在顯微鏡下測定細胞的數(shù)目。由測定結(jié)果可知細胞總數(shù)為5.1×107個。
(9)臍帶血移植與給予淋巴細胞之前的過程針對無法進行緩解導(dǎo)入的急性骨髓單核細胞白血病患者，在接受HLA一致的捐獻者的移植骨髓兩個月后病情復(fù)發(fā)，此時又接受了同一捐獻者的兩次末梢血干細胞移植，結(jié)果芽球依然存在而骨髓形成能力很低，這3次移植過程中均未出現(xiàn)GVHD。針對同一患者進行了HLA位點不一致的臍帶血移植，從十天后開始出現(xiàn)了3次GVHD，在實施了甲基脫氫皮質(zhì)醇脈沖(methylprednisolone-pulse，mPSLpulse)療法后，GVHD現(xiàn)象表現(xiàn)減輕。在經(jīng)歷了上述3次不成功的干細胞移植后，為了不產(chǎn)生GVHD現(xiàn)象和不引發(fā)移植物抗白血病(GVL)作用，以及增強移植后的抗腫瘤效果和促進捐獻者細胞的附著生長，決定采取活性CD4陽性細胞療法。
(10)凍存的CD4陽性細胞的取出及活化取出一管上述(7)中冷凍保存的CD4陽性細胞，37℃熱沖擊4分鐘。在無菌條件下，向15毫升離心管中加入10毫升清洗用培養(yǎng)基(RPMI1640+6)，然后用移液器將保存的淋巴細胞加入培養(yǎng)基中并重懸細胞。20℃，1000轉(zhuǎn)每分鐘離心5分鐘，棄上清，輕輕敲擊，重懸于50毫升培養(yǎng)用培養(yǎng)基中，然后將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移至克隆板上。
細胞在經(jīng)顯微鏡下觀察后，置于37℃CO2培養(yǎng)箱中重新開始培養(yǎng)(培養(yǎng)的第0天)。在培養(yǎng)的第2天，用顯微鏡確認細胞是否已長滿整個克隆板，然后將克隆板上的細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶(225平方厘米，CELLCULTUREFLASK)中。用新制培養(yǎng)用培養(yǎng)基50毫升洗滌克隆板一次，然后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，于37℃CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
在培養(yǎng)的第4天，將按上述(5)中同樣方法制作的OKT3固定化培養(yǎng)瓶中的OKT3溶液用吸液器吸盡，向培養(yǎng)瓶中加入50毫升PBS(-)，蓋緊瓶蓋，劇烈振蕩，打開瓶蓋，倒去其中的液體。然后，在無菌條件下向培養(yǎng)瓶中加入50毫升PBS(-)，蓋緊瓶蓋，劇烈振蕩，打開瓶蓋，倒去其中的液體。
用吸液器小心地將培養(yǎng)瓶內(nèi)和瓶蓋中殘留的液體吸干，反復(fù)輕輕敲打生長有細胞的培養(yǎng)瓶，使附著在其底部的細胞脫離下來。將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移至已處理的培養(yǎng)瓶中，向原來的培養(yǎng)瓶內(nèi)加入150毫升新制培養(yǎng)用培養(yǎng)基，重懸起殘余的細胞，將其轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，置于37℃CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
(11)基于培養(yǎng)袋的CD4陽性細胞培養(yǎng)在培養(yǎng)的第6天，反復(fù)輕輕敲打上述(10)中所述的培養(yǎng)瓶，使附著在其底部的細胞脫離下來，從培養(yǎng)瓶中取出1毫升培養(yǎng)液，分別以等量涂布在薩布羅瓊脂培養(yǎng)基(添加氯霉素)和羊血瓊脂培養(yǎng)基上，置于37℃CO2培養(yǎng)箱中進行無菌試驗。
從培養(yǎng)瓶中取出10微升培養(yǎng)液，按前述(7)中所述的方法進行細胞計數(shù)。將裝有含等量的細胞袋培養(yǎng)用AIM-V培養(yǎng)基(10升培養(yǎng)基中含200單位/毫升(U/ml)的IL-2、1％的人血清及1毫摩爾/升的過氧乙酸)和CD-2(LL-7.1)培養(yǎng)基共750毫升的培養(yǎng)袋A-1000(細胞培養(yǎng)專用)在37℃下保溫。
無菌的條件下，將培養(yǎng)袋與一個50毫升注射器連接，通過注射器將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液全部注入培養(yǎng)袋中。用鉗子剪斷軟管，并將軟管的尖端密封起來，然后將培養(yǎng)袋置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
(12)CD4細胞的無菌試驗及肉毒素試驗在培養(yǎng)的第7天(給藥前一天)于無菌條件下，用裝有24G針頭的1毫升注射器從上述(11)的細胞培養(yǎng)袋的取樣孔中取出約1毫升培養(yǎng)液。棄去最先取出的液體，用同一支注射器再次取出約1毫升樣品，將其中約200微升涂布于羊血瓊脂培養(yǎng)基上，剩余的培養(yǎng)液注入干熱滅菌的spitz管內(nèi)。
取樣完畢的細胞培養(yǎng)袋，小心用經(jīng)酒精棉球處理過的鉗子將其取樣孔蓋好后，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。瓊脂板置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)進行無菌試驗；干熱滅菌spitz管于20℃、1500轉(zhuǎn)每分鐘離心5分鐘。
用經(jīng)干熱滅菌處理的微量移液器將配制好的主要試劑(使用toxicolour系統(tǒng)LS一200及toxicolour系統(tǒng)ET-1的肉毒素用試劑盒)加入3支干熱滅菌的試管中，每支試管加樣100微升。向空白管內(nèi)加入蒸餾水100微升、陽性對照管內(nèi)加入標準液100微升，然后向檢驗管內(nèi)加入蒸餾水80微升、經(jīng)離心處理的培養(yǎng)液上清20微升，將3支試管一起置于37℃水浴中反應(yīng)30分鐘。
30分鐘后，向每支試管內(nèi)加入400微升0.8摩爾/升醋酸溶液，旋渦振蕩混合，然后各取400微升反應(yīng)液移至96孔板內(nèi)，用讀板器測定405納米(參考630納米)處的吸光度值。可以確定所檢測的樣品的吸光度值未達到陽性對照樣品的1/5。
(13)基于FACS的給藥用CD4陽性細胞的回收前分析在回收CD4陽性細胞前，從細胞培養(yǎng)袋中取出一部分培養(yǎng)液，在采用前述(8)中的方法細胞計數(shù)的同時，采用前述(4)中的方法測定CD8陽性細胞的含量。結(jié)果表明，細胞總數(shù)為3×109個，其中CD8陽性細胞的含量為0.5％。由細胞總數(shù)和FACS分析得到的CD8陽性細胞的含量可知，體系中CD8陽性細胞的數(shù)量為1.5×106個。
(14)CD4陽性細胞的回收取上述(11)中的細胞袋中的培養(yǎng)液1000毫升，分裝于無菌的250毫升離心管中，20℃，1500轉(zhuǎn)每分鐘離心8分鐘。離心后，棄上清，振蕩重懸細胞。向離心管內(nèi)加入200毫升細胞清洗液，20℃，1800轉(zhuǎn)每分鐘離心8分鐘。離心后，棄上清，振蕩重懸細胞。每個離心管中加入細胞清洗液100毫升，然后將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移至2支250毫升管內(nèi)，20℃，1800轉(zhuǎn)每分鐘離心8分鐘。離心后，棄上清，振蕩重懸細胞，向每個250毫升管內(nèi)加入100毫升細胞清洗液。
離心后，棄上清，振蕩重懸細胞。將細胞懸浮液充分重懸在菲那爾液(在250毫升離心管中由生理鹽水100毫升和20％人血清白蛋白溶液5毫升混合配制而成的淋巴細胞給藥用液即菲那爾液)，然后過100目微濾網(wǎng)，測定細胞懸浮液的量。同時取一定量的細胞懸浮液，用于細胞計數(shù)和CD4含量測定。
在分裝袋(300毫升)上連接一個50毫升注射器，通過注射器將細胞懸浮液注入袋內(nèi)。完畢后，用注射器內(nèi)筒壓出殘留的液體，最后用鉗子剪斷軟管，用封口機封上軟管，用剪刀剪斷注射器。測定結(jié)果，液體量為100毫升，細胞總數(shù)為2.5×109個。
(15)基于FACS的給藥用CD4陽性細胞的回收后分析采用與上述(4)中所述相同的方法，進行基于FACS的給藥用CD4陽性細胞的回收后分析。結(jié)果表明，CD4陽性細胞含量為99.75％，CD8陽性細胞含量為0.25％。
(16)針對患者的CD4陽性細胞給藥根據(jù)患者的不同，以4.5×107細胞/kg體重，采用靜脈注射1小時的方式，給予上述(14)中制備的CD4陽性細胞。其后，可給藥1-2周，每周3次。每次的給藥量為2.5×106-5.9×107個細胞/千克體重，給藥方式為靜脈注射1小時。
實施例2從供血者體內(nèi)采血在臍帶血移植后，給予淋巴細胞9次。為了促進生長附著，在移植后的第87天，從患者的靜脈采血30毫升，加肝素保存。
(2)末梢血單核球細胞的分離超凈臺內(nèi)無菌(以下簡稱無菌)條件下，將采過血的注射器的針頭更換為19G注射針，注意不要接觸到針筒與針頭的結(jié)合部位。向2支50毫升離心管內(nèi)各加入15毫升清洗用培養(yǎng)基，將采集的所有血液分成兩等份加入到這2支離心管中。蓋緊離心管蓋，上下顛倒2-3次，充分混合，用10毫升吸液管向6支15毫升離心管內(nèi)各加入3毫升淋巴細胞提取液，然后向各管中加入培養(yǎng)基稀釋后的血液10毫升，注意小心操作，不要激起液面。20℃，1800轉(zhuǎn)每分鐘，制動裝置處于關(guān)閉(OFF)狀態(tài)下離心15分鐘。
離心后，在無菌條件下，用吸液器吸去離心管中距淋巴細胞層1厘米以上的液體，注意不要吸起淋巴細胞。再用5毫升吸液管取出淋巴細胞層，注意不要吸起血細胞層。將取出的淋巴細胞置于裝有25毫升清洗培養(yǎng)基(RPMI1640+6)的50毫升離心管中，蓋好離心管蓋，上下顛倒離心管2-3次，20℃，1800轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘。離心后，棄上清，用振蕩器充分重懸細胞。再次加入清洗培養(yǎng)基50毫升，充分顛倒混合，取10微升用于細胞計數(shù)，用1.5毫升小管2支各取500微升用于CD4、CD8細胞含量測定。
(3)基于提爾克液的細胞計數(shù)將前述(2)中的用于細胞計數(shù)的細胞懸浮液10微升與40微升提爾克液混合，取10微升加于血球計數(shù)板上，在顯微鏡下測定細胞的數(shù)目。結(jié)果表明，細胞總數(shù)為8.5×107個。
CD4陽性細胞的分析將上述(2)中制備的兩管細胞懸浮液于4℃，6000轉(zhuǎn)每分鐘離心5分鐘，吸盡上清。向每管內(nèi)加入8微升PBS(-)和8微升CD4/CD8抗體，充分攪拌，4℃反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)后，向每管中加入鞘液800微升，旋渦攪拌，4℃，6000轉(zhuǎn)每分鐘離心5分鐘，沉淀細胞。
吸盡上清，加入800微升鞘液，反復(fù)吹吸，重懸細胞，然后將其轉(zhuǎn)移至FACS測定用的小管內(nèi)。FACS需使用FACScan，基于FACS的測定應(yīng)遵照操作指南進行操作。CD4、CD8陽性細胞含量均為28％，由總細胞數(shù)和CD4、CD8陽性細胞的含量可知，體系中CD4、CD8陽性細胞均為2.4×107個。
(5)OKT3固定化中號培養(yǎng)瓶和大號培養(yǎng)瓶的制備先用PBS(-)配制5微克/毫升的OKT3溶液，然后向中號培養(yǎng)瓶中加入5毫升、大號培養(yǎng)瓶中加入10毫升該溶液，使溶液均勻地覆蓋培養(yǎng)瓶底部。使用之前需在冷藏室內(nèi)保存。
(6)基于磁性小球標記的抗CD8抗體的CD4陽性細胞的制備與培養(yǎng)從上述(2)中制備的50毫升細胞懸浮液中取20毫升(細胞總數(shù)3.4×107個，CD4及CD8陽性細胞均為9.5×106個)轉(zhuǎn)移至50毫升小管中，20℃，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。離心后，棄上清，旋渦振蕩重懸細胞。
接下來，向15毫升小管中加入含有相當于CD8陽性細胞4倍量的小球的磁性小球標記抗CD8抗體300微升，放置于磁鐵裝置MPC-1上，反應(yīng)1分鐘。小心移取溶液，不要吸入小球，然后將小管從磁鐵上移開。向小管內(nèi)加入1毫升PBS(-)溶液，充分攪拌，重復(fù)上述操作。再向小管內(nèi)加入1毫升PBS(-)，充分攪拌。并重復(fù)上述操作一次。
向離心回收得到的細胞懸濁液中加入5毫升反應(yīng)用培養(yǎng)基(由清洗用培養(yǎng)基45毫升加人血清5毫升混合配制而成)，輕輕地重懸細胞，然后將細胞轉(zhuǎn)移至盛有磁性小球標記的抗CD8抗體的小管內(nèi)，以振蕩器輕輕振蕩，于冷室內(nèi)反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)后將小管至于磁鐵上，反應(yīng)1分鐘。小心移取溶液，不要吸起小球，將溶液轉(zhuǎn)移至一個新的15毫升小管內(nèi)。再次置于磁鐵上，反應(yīng)1分鐘后，小心移取溶液，不要吸起小球，將溶液回收到新的小管內(nèi)，20℃、1000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘。離心后棄上清，用旋渦振蕩器充分重懸沉淀的細胞。
向回收得到的CD4陽性細胞中加入培養(yǎng)用培養(yǎng)基20毫升(由培養(yǎng)基RPMI1640+7 44毫升、1毫升35000單位/毫升(U/ml)的IL-2、5毫升人血清配制而成，簡稱培養(yǎng)用培養(yǎng)基)，輕輕懸浮細胞。將上述(5)中所制作的OKT3固定化培養(yǎng)瓶(中號)中的OKT3溶液用吸液器吸盡。向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入10毫升PBS(-)，蓋好瓶蓋，劇烈振蕩，打開瓶蓋，倒去其中的液體。然后在超凈臺中再向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入10毫升PBS(-)，蓋好瓶蓋，劇烈振蕩，打開瓶蓋，倒去其中的液體。
用吸液器小心地吸盡培養(yǎng)瓶和瓶蓋內(nèi)殘留的液體，向其中加入細胞懸浮液。取細胞計數(shù)用樣品10微升、CD4、CD8陽性細胞含量測定樣品1000微升(可用1.5毫升小管2支，各裝入500微升)，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)(濕度95％)，開始培養(yǎng)(培養(yǎng)的第0天)。如前述(4)進行CD4陽性細胞分析，結(jié)果表明CD4陽性細胞含量為46％、CD8陽性細胞含量為5％。
(7)基于臺盼蘭溶液的細胞計數(shù)將上述(6)中采集的細胞懸浮液10微升與20微升臺盼蘭溶液混合，取10微升加于血球計數(shù)板上，在顯微鏡下測定細胞的數(shù)目。由測定結(jié)果可知細胞總數(shù)為2.6×107個。
(8)CD4陽性細胞的擴大培養(yǎng)在培養(yǎng)的第3天、第4天，分別向上述(6)中所述的細胞培養(yǎng)液內(nèi)各自加入培養(yǎng)用培養(yǎng)基20毫升。在培養(yǎng)的第5天，為進一步擴大培養(yǎng)，需更換體積較大的OKT3固定化培養(yǎng)瓶。即，將上述(5)中所制作的OKT3固定化培養(yǎng)瓶(大號)中的OKT3溶液用吸液器吸盡，向其中加入PBS(-)50毫升，蓋好瓶蓋，劇烈振蕩，打開瓶蓋，倒去其中的液體。
再次向培養(yǎng)瓶中加入50毫升滅菌的PBS(-)，蓋好瓶蓋，劇烈振蕩，打開瓶蓋，倒出其中的液體。小心地用吸液器吸盡殘留在培養(yǎng)瓶和瓶蓋中的液體。反復(fù)輕輕敲打生長有細胞的中號培養(yǎng)瓶，使附著在其底部的細胞脫離下來，將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移至處理好的大號培養(yǎng)瓶中。然后向這個大號培養(yǎng)瓶中加入新的培養(yǎng)用培養(yǎng)基50毫升，重懸起其中的細胞，將其轉(zhuǎn)移至一個新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。
(9)CD4陽性細胞的冷凍保存上述(8)中的培養(yǎng)細胞液，在培養(yǎng)第6天時，應(yīng)按下述方法冷凍保存。保存方法是，首先反復(fù)輕輕敲打培養(yǎng)瓶底面，使附著在其底部的細胞脫離下來，從培養(yǎng)瓶中取出500微升培養(yǎng)液，涂布于胰蛋白胨大豆(TSA)瓊脂培養(yǎng)基上，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)，進行無菌試驗。然后再從培養(yǎng)瓶中取出10微升培養(yǎng)液，如前述(3)進行細胞計數(shù)。
接下來，向兩支50毫升離心管中各加入培養(yǎng)細胞40毫升，1000轉(zhuǎn)每分鐘20℃離心5分鐘。棄上清，用旋渦混合器重懸起沉淀的細胞，分別將細胞懸浮液和細胞保存液(由人血清5毫升、DMSO 5毫升、RPMI1640+7培養(yǎng)基40毫升混合而成)置于冰水中冷卻5分鐘，然后將4.5毫升細胞保存液和細胞懸浮液混于一個管內(nèi)，輕輕吹吸以混勻細胞，以等量加入3支細胞保存用小管(2.0毫升)中。然后將小管置于低溫冰箱中，于-80℃放置數(shù)日，其后可以置于液氮中保存。培養(yǎng)時細胞的濃度為1.9×106個/毫升，保存時每管中約含有5.1×107個細胞。
(10)凍存的CD4陽性細胞的取出及活性取出1管上述(9)中冷凍保存的CD4陽性細胞，37℃熱沖擊4分鐘。在無菌條件下，向15毫升離心管中加入10毫升清沈用培養(yǎng)基(RPMI1640+6)，然后用移液器將保存的淋巴細胞加入培養(yǎng)基中并重懸細胞。20℃，1000轉(zhuǎn)每分鐘離心5分鐘，棄上清，輕輕敲擊，重懸于50毫升培養(yǎng)用培養(yǎng)基中，然后將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移至克隆板上。
細胞在經(jīng)顯微鏡下觀察后，置于37℃，CO2培養(yǎng)箱中重新開始培養(yǎng)(培養(yǎng)的第0天)。在培養(yǎng)的第2天，應(yīng)用顯微鏡確認細胞是否已長滿整個克隆板，然后將克隆板上的細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶(225平方厘米，CELLCULTUREFLASK)中。用新制培養(yǎng)用培養(yǎng)基50毫升洗滌克隆板一次，然后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，于37℃，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
在培養(yǎng)的第4天，將按上述(5)中同樣方法制作的OKT3固定化培養(yǎng)瓶中的OKT3溶液用吸液器吸盡，向培養(yǎng)瓶中加入50毫升PBS(-)，蓋緊瓶蓋，劇烈振蕩，打開瓶蓋，倒去其中的液體。然后，在無菌條件下向培養(yǎng)瓶中加入50毫升PBS(-)，蓋緊瓶蓋，劇烈振蕩，打開瓶蓋，倒去其中的液體。用吸液器小心地將培養(yǎng)瓶內(nèi)和瓶蓋中殘留的液體吸干。
反復(fù)輕輕敲打生長有細胞的培養(yǎng)瓶，使附著在其底部的細胞脫離下來。將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移至已處理的培養(yǎng)瓶中，向原來的培養(yǎng)瓶內(nèi)加入150毫升新制培養(yǎng)用培養(yǎng)基，重懸起殘余的細胞，將其轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，置于37℃CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
(11)基于培養(yǎng)袋的CD4陽性細胞培養(yǎng)在培養(yǎng)的第6天，反復(fù)輕輕敲打上述(10)中所述的培養(yǎng)瓶，使附著在其底部的細胞脫離下來，從培養(yǎng)瓶中取出1毫升培養(yǎng)液，分別以等量涂布在薩布羅瓊脂培養(yǎng)基(添加氯霉素)和羊血瓊脂培養(yǎng)基上，置于37℃CO2培養(yǎng)箱中進行無菌試驗。
從培養(yǎng)瓶中取出10微升培養(yǎng)液，按前述(7)中所述的方法進行細胞計數(shù)。將裝有含等量的細胞袋培養(yǎng)用AIM-V培養(yǎng)基(10升培養(yǎng)基中含200單位/毫升(U/ml)的IL-2、1％的人血清及1毫摩爾/升的過氧乙酸)和CD-2(LL-7.1)培養(yǎng)基(1升)的共750毫升的培養(yǎng)袋A-1000(細胞培養(yǎng)專用)在37℃下保溫。無菌的條件下，將培養(yǎng)袋與一個50毫升注射器連接，通過注射器將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液全部注入培養(yǎng)袋中。用鉗子剪斷軟管，并將軟管的尖端密封起來，然后將培養(yǎng)袋置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
(12)CD4細胞的無菌試驗及肉毒素試驗在培養(yǎng)的第7天(給藥前一天)于無菌條件下，用裝有24G針頭的1毫升注射器從上述(11)的細胞培養(yǎng)袋的取樣孔中取出約1毫升培養(yǎng)液。棄去最先取出的液體，用同一支注射器再次取出約1毫升樣品，將其中約200微升涂布于羊血瓊脂培養(yǎng)基上，剩余的培養(yǎng)液注入干熱滅菌的spitz管內(nèi)。
取樣完畢的細胞培養(yǎng)袋，小心用經(jīng)酒精棉球處理過的鉗子將其取樣孔蓋好后，置于37℃、二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。瓊脂板置于37C培養(yǎng)箱內(nèi)進行無菌試驗；干熱滅菌spitz管于20℃1500轉(zhuǎn)每分鐘離心5分鐘。
用經(jīng)干熱滅菌處理的微量移液器將配制好的主要試劑加入3支干熱滅菌的試管中，每支試管加樣100微升。向空白管內(nèi)加入注射用蒸餾水100微升、陽性對照管內(nèi)加入標準液100微升，然后向檢驗管內(nèi)加入注射用蒸餾水80微升、經(jīng)離心處理的培養(yǎng)液上清20微升，將3支試管一起置于37℃水浴中反應(yīng)30分鐘。
30分鐘后，向每支試管內(nèi)加入400微升0.8摩爾/升醋酸溶液，旋渦振蕩混合，然后各取400微升反應(yīng)液移至96孔板內(nèi)，用讀板器測定405納米(參考630納米)處的吸光度值?？梢源_定所檢測的樣品的吸光度值未達到陽性對照樣品的1/5。
(13)基于FACS的給藥用CD4陽性細胞的回收前分析在回收CD4陽性細胞前，從細胞培養(yǎng)袋中取出一部分培養(yǎng)液，在采用前述(7)中的方法細胞計數(shù)的同時，采用前述(4)中的方法測定CD8陽性細胞的含量。結(jié)果表明，細胞總數(shù)為4.0×109個，其中CD8陽性細胞的含量為0.5％。由細胞總數(shù)和FACS分析得到的CD8陽性細胞的含量可知，體系中CD8陽性細胞的數(shù)量為2.0×106個。
(14)CD4陽性細胞的回收取上述(12)中的細胞袋中的培養(yǎng)液1000毫升，分裝于250毫升離心管中，20℃，1500轉(zhuǎn)每分鐘離心8分鐘。離心后，棄上清，振蕩重懸細胞。向離心管內(nèi)加入250毫升細胞清洗液，20℃，1800轉(zhuǎn)每分鐘離心8分鐘。離心后，棄上清，振蕩重懸細胞。每個離心管中加入細胞清洗液100毫升，然后將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移至2支250毫升管內(nèi)，20℃，1800轉(zhuǎn)每分鐘離心8分鐘。離心后，棄上清，振蕩重懸細胞，向每個250毫升管內(nèi)加入50毫升細胞清洗液。
離心后，棄上清，振蕩重懸細胞。將細胞懸浮液充分重懸在菲那爾液(在250毫升離心管中，由生理鹽水100毫升和20％人血清白蛋白溶液5毫升混合配制而成的淋巴細胞給藥用液即菲那爾液)，然后過100目微濾網(wǎng)，測定細胞懸浮液的量。
同時取一定量的細胞懸浮液，用于細胞計數(shù)和CD4含量測定。在分裝袋(300毫升)上連接一個50毫升注射器，通過注射器將細胞懸浮液注入袋內(nèi)。完畢后，用注射器內(nèi)筒壓出殘留的液體，最后用鉗子剪斷軟管，用封口機封上軟管，用剪刀剪斷注射器。測定結(jié)果，液體量為100毫升，細胞總數(shù)為3.7×109個。
(15)基于FACS的給藥用CD4陽性細胞的回收后分析采用與上述實施例1的(4)中所述相同的方法，進行基于FACS的給藥用CD4陽性細胞的回收后分析。結(jié)果表明，CD4陽性細胞含量為99.75％，CD8陽性細胞含量為0.25％。
(16)針對患者的CD4陽性細胞給藥根據(jù)患者的不同，以3×107細胞/kg體重，采用靜脈注射1小時的方式，給予上述(14)中制備的CD4陽性細胞。其后，可每周3次給藥。每次的給藥量為3×107-9×107個細胞/千克體重，給藥方式為靜脈注射1小時。
實施例3(1)免疫球蛋白量的測定對患者末梢血中免疫球蛋白的量進行了測定，結(jié)果表明與早期相比，患者末梢血中免疫球蛋白值有所提高。患者在移植后兩個月病情復(fù)發(fā)，芽球細胞數(shù)量過半且淋巴細胞數(shù)量減少，但免疫球蛋白值仍在正常水平，因此無需進行免疫球蛋白的增補療法。
與嗜中型粒細胞和淋巴細胞數(shù)量顯著減少無關(guān)，患者并未發(fā)生重癥感染。這個事實說明，給予的CD4陽性細胞可以顯著地提高患者的免疫力。這樣，對于臍帶血干細胞移植患者可以迅速地產(chǎn)生抗體，這表明捐獻者來源的活性淋巴細胞具有促進造血干細胞附著生長和促進抗體產(chǎn)生的作用。
權(quán)利要求
1.一種使造血干細胞移植后附著生長穩(wěn)定的組合物，該組合物以人類白細胞抗原一致淋巴細胞為主要成分，所述人類白細胞抗原一致淋巴細胞是通過將從末梢血或臍帶血中分離的單核球細胞中的人類白細胞抗原一致淋巴細胞，經(jīng)增殖、活化、分離提純而得到的。
2.如權(quán)利要求1所述的使造血干細胞移植后附著生長穩(wěn)定的組合物，其中，該組合物的主要成分人類白細胞抗原一致淋巴細胞含有用于醫(yī)療的成份。
3.如權(quán)利要求1所述的使造血干細胞移植后附著生長穩(wěn)定的組合物，其中，人類白細胞抗原一致活性淋巴細胞是一種CD4陽性細胞。
4.一種用于獲取造血干細胞移植后附著生長穩(wěn)定的組合物的試劑盒，該試劑盒是用于增殖、活化從末梢血或臍帶血中采集的血液人類白細胞抗原一致淋巴細胞的器具，該器具包括含有白介素-2的培養(yǎng)液以及抗CD3抗體固相化的培養(yǎng)瓶。
5.一種使造血干細胞移植后附著生長穩(wěn)定的組合物的制備方法，其中該方法包括從含有人類白細胞抗原一致淋巴細胞的末梢血或臍帶血中分離單核球細胞的步驟；增殖、活化已分離的單核球細胞中的人類白細胞抗原一致淋巴細胞的步驟；分離已增殖、活化的人類白細胞抗原一致淋巴細胞并制備以此為主要成分的制劑的步驟。
6.如權(quán)利要求5所述的使造血干細胞移植后附著生長穩(wěn)定的組合物的制備方法，其中人類白細胞抗原一致淋巴細胞的增殖與活化是在培養(yǎng)用培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的，所述培養(yǎng)用培養(yǎng)基中含有白介素-2和/或抗CD3抗體。
7.如權(quán)利要求5或6所述的使造血干細胞移植后附著生長穩(wěn)定的組合物的制備方法，其中當培養(yǎng)是以增殖、活化人類白細胞抗原一致淋巴細胞為目的時，培養(yǎng)液中需添加各種細胞分裂素或促細胞分裂素。
8.一種用于產(chǎn)生人單克隆抗體的細胞株，該細胞株通過對免疫缺陷狀態(tài)的動物，在移植前和移植后給予人類白細胞抗原一致活性淋巴細胞以促進附著生長穩(wěn)定后，針對所述淋巴細胞進行抗原致敏，采用細胞株化、分離、基因的分離與表達等手段從該動物獲得。
9.一種人多克隆抗體，該多克隆抗體通過將人造血干細胞移植到免疫缺陷狀態(tài)的動物，在移植前和移植后給予人類白細胞抗原一致活性淋巴細胞，附著生長穩(wěn)定后進行抗原致敏，從該動物提取。
10.一種用于產(chǎn)生人單克隆抗體的細胞株的制備方法，所述細胞株通過將人造血干細胞移植到免疫缺陷狀態(tài)的動物，在移植前和移植后給予人類白細胞抗原一致活性淋巴細胞以促進附著生長，經(jīng)抗原致敏，采用細胞株化、分離、基因的分離與表達等手段從該免疫缺陷動物獲得。
11.如權(quán)利要求10所述的用于產(chǎn)生人單克隆抗體的細胞株的制備方法，其中免疫缺陷狀態(tài)的動物是重癥復(fù)合免疫缺陷小鼠。
12.如權(quán)利要求11所述的用于產(chǎn)生人單克隆抗體的細胞株的制備方法，其中重癥復(fù)合免疫缺陷小鼠是SCID小鼠。
13.如權(quán)利要求10所述的用于產(chǎn)生人單克隆抗體的細胞株的制備方法，其中給予的人類白細胞抗原一致人淋巴細胞是人類白細胞抗原一致人活性淋巴細胞。
14.如權(quán)利要求10所述的用于產(chǎn)生人單克隆抗體的細胞株的制備方法，其中給予的人類白細胞抗原一致人活性淋巴細胞以CD4陽性細胞為主要成分。
15.如權(quán)利要求10所述的用于產(chǎn)生人單克隆抗體的細胞株的制備方法，其中給予的人類白細胞抗原一致人活性淋巴細胞中，活性CD4陽性細胞占給予總細胞數(shù)的90％以上。
16.如權(quán)利要求10所述的用于產(chǎn)生人單克隆抗體的細胞株的制備方法，其中對于給予的人類白細胞抗原一致人活性淋巴細胞，CD8陽性細胞的摻入率為給予的總細胞數(shù)的10％以下。
17.如權(quán)利要求10所述的用于產(chǎn)生人單克隆抗體的細胞株的制備方法，其中，由免疫缺陷動物細胞株化抗原敏感淋巴細胞的方法是基于愛潑斯坦-巴爾病毒的細胞株化方法。
18.如權(quán)利要求10所述的用于產(chǎn)生人單克隆抗體的細胞株的制備方法，其中，由免疫缺陷動物細胞株化抗原敏感淋巴細胞的方法是與人骨髓瘤細胞株進行細胞融合的細胞株方法。
19.如權(quán)利要求10-18中任何一項所述的用于產(chǎn)生人單克隆抗體的細胞株的制備方法，其中使用的抗原是人類來源的。
20.如權(quán)利要求10-18中任何一項所述的用于產(chǎn)生人單克隆抗體的細胞株的制備方法，其中使用的抗原可以是人源半抗原和載體蛋白的復(fù)合體。
21.如權(quán)利要求10-18中任何一項所述的用于產(chǎn)生人單克隆抗體的細胞株的制備方法，其中使用的抗原可以是由人源小肽構(gòu)成的多抗原肽。
22.如權(quán)利要求10-18中任何一項所述的用于產(chǎn)生人單克隆抗體的細胞株的制備方法，其中使用的抗體是免疫球蛋白。
23.如權(quán)利要求10-18中任何一項所述的用于產(chǎn)生人單克隆抗體的細胞株的制備方法，其中使用的抗體是IgG免疫球蛋白。
24.一種人單克隆抗體，由如權(quán)利要求8或10-23中任何一項所述的用于產(chǎn)生人單克隆抗體的細胞株所產(chǎn)生。
25.一種編碼人單克隆抗體的基因，其中所述人單克隆抗體由如權(quán)利要求8或10-23中任何一項所述的用于產(chǎn)生人單克隆抗體的細胞株所產(chǎn)生。
26.一種導(dǎo)入了編碼人單克隆抗體的基因的重組細胞，其中所述人單克隆抗體由如權(quán)利要求8或10-23中任何一項所述的用于產(chǎn)生人單克隆抗體的細胞株所產(chǎn)生。
27.一種人多克隆抗體的制備方法，該方法包括將人造血干細胞移植到免疫缺陷狀態(tài)的動物，在移植前和移植后給予人類白細胞抗原一致活性淋巴細胞以促進附著生長，經(jīng)抗原致敏，從該免疫缺陷動物提取所述多克隆抗體。
28.如權(quán)利要求27所述的人多克隆抗體的制備方法，其中給予的人類白細胞抗原一致人活性淋巴細胞是人類白細胞抗原一致人活性淋巴細胞。
29.如權(quán)利要求27所述的人多克隆抗體的制備方法，其中給予的人類白細胞抗原一致人活性淋巴細胞以CD4陽性細胞為主要成分。
30.如權(quán)利要求27所述的人多克隆抗體的制備方法，其中給予的人類白細胞抗原一致人活性淋巴細胞占給予的總細胞數(shù)的90％以上。
31.如權(quán)利要求27所述的人多克隆抗體的制備方法，其中對于給予的人類白細胞抗原一致人活性淋巴細胞，CD8陽性細胞的摻入率為給予的總細胞數(shù)的10％以下。
32.如權(quán)利要求27-31中任何一項所述的人多克隆抗體的制備方法，其中使用的抗原是人類來源的。
33.如權(quán)利要求27-31中任何一項所述的人多克隆抗體的制備方法，其中使用的抗原可以是人源半抗原和載體蛋白的復(fù)合體。
34.如權(quán)利要求27-31中任何一項所述的人多克隆抗體的制備方法，其中使用的抗原可以是由人源小肽構(gòu)成的多抗原肽。
35.如權(quán)利要求27-31中任何一項所述的人多克隆抗體的制備方法，其中使用的抗體是免疫球蛋白。
36.如權(quán)利要求27-31中任何一項所述的人多克隆抗體的制備方法，其中使用的抗體是IgG免疫球蛋白。
37.如權(quán)利要求9或權(quán)利要求27-36中任何一項所述的人多克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明目的是利用人類白細胞抗原(HLA)一致的活性淋巴細胞使造血干細胞移植后附著生長穩(wěn)定。從末梢血或臍帶血分離獲得的單核球細胞中的HLA一致淋巴細胞經(jīng)增殖、活化后，進一步分離提純，制備以HLA一致淋巴細胞為主要成分的造血干細胞移植后附著生長穩(wěn)定的組合物。該組合物可以廣泛應(yīng)用于預(yù)防造血干細胞移植后附著生長不全及促進造血干細胞移植后附著生長的治療。本發(fā)明中組合物的給藥量因患者的年齡、癥狀而異，對于包括人在內(nèi)的哺乳動物，人源抗體的給藥量為0.2－20毫克/千克體重·天。給藥可經(jīng)靜脈注射，每日一次(單次給藥或連續(xù)給藥)或間隔性地每周1－3次，每2周或每3周1次。
文檔編號C12N15/09GK1798834SQ200480015269
公開日2006年7月5日 申請日期2004年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月3日
發(fā)明者馬場憲三, 黑巖保幸, 森尾友宏, 清水則夫 申請人:株式會社淋巴技術(shù)