專利名稱：高活力胰酶的制備新工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種用于制備高活力胰酶的新工藝，具體而言就是用PEG(聚乙二醇)對激活豬胰進行沉淀的方法。
背景技術(shù)：
胰酶系各國藥典收載的助消化藥，是從動物胰臟中提取的多種酶的混合物，主要成分為胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，它可以用來治療消化不良、食欲不振及肝、胰疾患引起的消化障礙。消化不良是人類的常見病、多發(fā)病，尤其是老年人胃腸消化功能減弱，成為伴隨終身的痼疾。對于消化不良的治療，比較好的辦法就是給予能夠消化食物中蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪的各種酶類，幫助人體胃腸道完成消化任務(wù)，協(xié)助調(diào)理身體增加食物營養(yǎng)的吸收。作為消化酶補充藥物，高質(zhì)量的胰酶在國外已經(jīng)廣泛應(yīng)用。此外，由于胰酶中含有多種活性物質(zhì)，可以作為基礎(chǔ)原料從中提取多種生化藥品，如胰激肽酶原，彈性蛋白酶，門冬酰胺酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶，羧肽酶等等。
胰酶是否具有胰中天然比例的酶的特性，是影響胰酶質(zhì)量的關(guān)鍵因素，而不同生產(chǎn)工藝制備的胰酶產(chǎn)品中三酶(胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶)含量比例差異很大，因此USP24對高標準胰酶中三酶的含量有明確的規(guī)定，2000版CP對胰酶的三酶含量也有相應(yīng)的要求。
目前文獻報道的生產(chǎn)藥用胰酶的傳統(tǒng)工藝普遍采用的是有機溶劑沉淀的方法。例如，在《重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》1995(4)，305中報道的從豬胰臟中提取胰酶的優(yōu)化工藝，工藝流程中使用的沉淀劑是乙醇，產(chǎn)品中三酶活力分別為4,200U/g，3,600U/g，5,000U/g，收率10～13％?！吨袊幬镫s志》1994(3)，190報道的高活力胰酶生產(chǎn)工藝中使用的提取劑是低濃度的乙醇，沉淀劑是高濃度的冷乙醇，三酶活力分別為4,500U/g，3,500U/g，7,000U/g，胰酶總收率為7.9～10.8％。常州千紅生化制藥有限公司在《中國生化藥物雜志》1993(2)，40上報道的胰酶工藝使用的沉淀劑是乙醇，得到的胰酶產(chǎn)品中三酶活力比為1∶16∶30(胰蛋白酶∶胰脂肪酶∶胰淀粉酶)，收率為9～11％。清華大學(xué)在《中國生化藥物雜志》1994(4)，283中報道的高活力胰酶制備工藝使用的提取劑和沉淀劑均是乙醇，按干品計算，每克胰酶粉的三酶活力分別為281,000U，18,300U，37,400U，其中脂肪酶和淀粉酶的活力相對偏低，收率為10.47％。長沙生化制藥廠在《青海醫(yī)藥雜志》2000(4)，56上報道的胰酶制備新工藝使用的沉淀劑是丙酮，每克胰酶粉的酶活力平均含胰蛋白酶211,355U，脂肪酶9,957U，淀粉酶22,141U，其中脂肪酶和淀粉酶的含量仍然相對偏低，收率平均為12.8％。綜上所述，這些工藝中都使用了大量的有機溶劑，由于有機試劑的易燃性和對工人的慢性毒性，使生產(chǎn)中存在重大的安全隱患；而且由于乙醇和丙酮可能使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，生產(chǎn)過程中酶活力損失較多，尤其是脂肪酶和淀粉酶的活力損失嚴重，致使三酶比例不合理，收率也不盡人意。

發(fā)明內(nèi)容
綜合比較以上工藝路線，本發(fā)明提出了一種用酶沉淀保護劑PEG沉淀激活的豬胰漿來制備胰酶的具體方法。該方法具有安全性好，操作簡便，生產(chǎn)周期短，收率高，三酶活力高，能耗低以及不需要增加特殊儀器設(shè)備等特點，有推廣應(yīng)用價值。
本發(fā)明的胰酶制備新工藝是用PEG對激活豬胰進行沉淀，將凍豬胰或新鮮豬胰絞碎成胰漿后激活，調(diào)pH為6.0～8.0，加入PEG 10～50％，充分攪拌，2～8℃條件下沉淀30～120min，然后加入少量的促沉淀劑，充分攪拌，2～8℃條件下繼續(xù)沉淀3～7h，離心，收集沉淀，脫脂干燥后得胰酶成品。上清液供回收PEG。
本發(fā)明的上述方法在對激活胰漿進行沉淀制備胰酶時使用的是酶沉淀保護劑PEG。PEG是一種非離子水溶性多聚體，作為蛋白質(zhì)沉淀劑，PEG只在個別濃度下才使蛋白質(zhì)稍有變性。由于PEG溶解時散熱低，沉淀效能高以及形成沉淀的平衡時間短等特點，使得PEG在蛋白質(zhì)的組分分離中成為一個有用的試劑。本發(fā)明的胰酶制備新工藝中，PEG對胰酶有較好的沉淀作用，三酶活力得到較好的保護。大量的實驗結(jié)果證實，胰酶的重量回收率可達14.3～18.0％，超過文獻報道的最高水平；胰酶中三酶活力分別可以達到3,760U/g，28,000U/g，53,000U/g，達到中國藥典標準六倍以上，并接近胰臟中的天然比例。
本發(fā)明的上述方法使用的酶沉淀保護劑PEG安全無毒。由于大大減少了乙醇、丙酮等易燃、易爆、有毒試劑的使用量，使生產(chǎn)的安全性大大提高。
本發(fā)明的上述方法由于結(jié)合使用了酶沉淀保護劑和促沉淀劑，使生產(chǎn)周期大大縮短，整個沉淀過程最多只需要8h。
本發(fā)明的上述方法使用的PEG可以反復(fù)使用數(shù)次，從上清液中回收PEG，收率平均可達95％。PEG連續(xù)利用3次后，胰酶回收率仍然可以達到13.0％，三酶含量無明顯變化。PEG的再利用在一定程度上降低了生產(chǎn)成本。
下面通過若干實例的具體實施方式
，再對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進一步的詳細說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅局限于下述的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
具體實施例方式
實例1(1)取冰凍豬胰或新鮮豬胰絞碎成胰漿后激活。(2)取激活胰漿10g(相當于豬胰4g)，加水至50mL，調(diào)pH為7.0，加入PEG 15g，充分攪拌，4℃條件下沉淀60min，然后加入少量的促沉淀劑，充分攪拌，4℃條件下繼續(xù)沉淀5h，3000rpm離心10min，收集沉淀，脫脂干燥后得胰酶成品0.67g，重量回收率為16.8％，產(chǎn)品中胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的含量分別為3,760U/g，28,000U/g，53,000U/g。上清液供回收PEG。
實例2(1)取冰凍豬胰或新鮮豬胰絞碎成胰漿后激活。(2)取激活胰漿10g(相當于豬胰4g)，加水至50mL，調(diào)pH為6.5，加入PEG 15g，充分攪拌，6℃條件下沉淀60min，然后加入少量的促沉淀劑，充分攪拌，6℃條件下繼續(xù)沉淀6h，3000rpm離心10min，收集沉淀，脫脂干燥后得胰酶成品0.63g，重量回收率為15.8％，產(chǎn)品中胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的含量分別為3,900U/g，28,670U/g，55,000U/g。上清液供回收PEG。
實例3(1)取冰凍豬胰或新鮮豬胰絞碎成胰漿后激活。(2)取激活胰漿50g(相當于豬胰20g)，加水至200mL，調(diào)pH為7.5，加入PEG 50g，充分攪拌，3℃條件下沉淀30min，然后加入少量的促沉淀劑，充分攪拌，3℃條件下繼續(xù)沉淀7h，3000rpm離心10min，收集沉淀，脫脂干燥后得胰酶成品3.40g，重量回收率為17.0％，產(chǎn)品中胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的含量分別為4,100U/g，26,000U/g，50,000U/g。上清液供回收PEG。
實例4(1)取冰凍豬胰或新鮮豬胰絞碎成胰漿后激活。(2)取激活胰漿200g(相當于豬胰80g)，加水至1000mL，調(diào)pH為7.0，加入PEG 150g，充分攪拌，8℃條件下沉淀60min，然后加入少量的促沉淀劑，充分攪拌，8℃條件下繼續(xù)沉淀6h，3000rpm離心10min，收集沉淀，脫脂干燥后得胰酶成品14.4g，重量回收率為18.0％，產(chǎn)品中胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的含量分別為2,687U/g，20,500U/g，46,000U/g。上清液供回收PEG。
實例5(1)取冰凍豬胰或新鮮豬胰絞碎成胰漿后激活。(2)取激活胰漿200g(相當于豬胰80g)，加水至1000mL，調(diào)pH為7.8，加入PEG 250g，充分攪拌，4℃條件下沉淀90min，然后加入少量的促沉淀劑，充分攪拌，4℃條件下繼續(xù)沉淀5h，3000rpm離心10min，收集沉淀，脫脂干燥后得胰酶成品11.4g，重量回收率為14.3％，產(chǎn)品中胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的含量分別為3,400U/g，27,500U/g，57,000U/g。上清液供回收PEG。
從上清液中回收的PEG可以繼續(xù)用于制備胰酶。
實例6(1)取冰凍豬胰或新鮮豬胰絞碎成胰漿后激活。(2)取激活胰漿200g(相當于豬胰80g)，加水至1000mL，調(diào)pH為7.8，加入回收PEG 250g(已連續(xù)使用過3次)，充分攪拌，4℃條件下沉淀90min，然后加入少量的促沉淀劑，充分攪拌，4℃條件下繼續(xù)沉淀5h，3000rpm離心10min，收集沉淀，脫脂干燥后得胰酶成品10.4g，重量回收率為13.0％，產(chǎn)品中胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的含量分別為3,600U/g，24,000U/g，50,000U/g。
胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活力測定參照2000版CP。
權(quán)利要求
1.高活力胰酶的制備新工藝，用酶沉淀保護劑對激活胰漿進行沉淀，其特征在于將凍豬胰或新鮮豬胰絞碎成胰漿后激活，調(diào)至一定pH，加入PEG(聚乙二醇)充分攪拌，一定溫度條件下沉淀一段時間后，加入少量的促沉淀劑充分攪拌，繼續(xù)沉淀一段時間，離心，收集沉淀，脫脂干燥后得胰酶成品。上清液供回收PEG。
2.如權(quán)利要求1所述的高活力胰酶制備新工藝，其特征在于使用的酶沉淀保護劑是PEG。
3.如權(quán)利要求1所述的高活力胰酶制備新工藝，其特征在于PEG的用量為10～50％。
4.如權(quán)利要求1所述的高活力胰酶制備新工藝，其特征在于沉淀時的pH為6.0～8.0。
5.如權(quán)利要求1所述的高活力胰酶制備新工藝，其特征在于PEG單獨沉淀的時間為30～120min。
6.如權(quán)利要求1所述的高活力胰酶制備新工藝，其特征在于加入促沉淀劑后繼續(xù)沉淀的時間為3～7 h。
7.如權(quán)利要求1所述的高活力胰酶制備新工藝，其特征在于沉淀時的溫度為2～8℃。
全文摘要
本發(fā)明涉及高活力胰酶的制備新工藝，將凍豬胰或新鮮豬胰絞碎成胰漿后激活，調(diào)pH為6.0～8.0，加入酶沉淀保護劑，充分攪拌，2～8℃條件下沉淀30～120min，然后加入少量的促沉淀劑，充分攪拌，2～8℃條件下繼續(xù)沉淀3～7h，離心，收集沉淀，脫脂干燥后得胰酶成品。利用本工藝制備胰酶，安全性好，操作簡便，生產(chǎn)周期短，收率高，三酶活力高，能耗低，且不需要增加特殊儀器設(shè)備。
文檔編號C12N9/94GK1632114SQ200410081389
公開日2005年6月29日 申請日期2004年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月3日
發(fā)明者余蓉, 李曉紅, 許浩鴻, 楊繼虞 申請人:四川大學(xué)