專利名稱：一種提高紅豆杉內(nèi)生真菌發(fā)酵物中紫杉醇產(chǎn)率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本方法是利用產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌培養(yǎng)物與產(chǎn)紫杉醇合成前體的內(nèi)生真菌培養(yǎng)物進(jìn)行混合培養(yǎng)，大幅度提高其發(fā)酵物中紫杉醇含量的一種方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自wani et al.從短葉紅豆杉(Taxus brevifolia Nutt.)的樹皮中抽取分離出紫杉醇，并發(fā)現(xiàn)其具有抗癌作用以來，科研人員又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)它的獨(dú)特抗癌機(jī)理并可治療多種癌癥。因此，人們開始大量地從紅豆杉的樹皮提取紫杉醇以滿足醫(yī)藥市場的需求。由于紅豆杉樹在世界范圍內(nèi)屬珍稀植物，所以靠從樹皮中提取紫杉醇必然嚴(yán)重地破壞自然資源，危及生態(tài)平衡。為了解決藥源緊缺狀況，國內(nèi)外學(xué)者為多渠道得到紫杉醇做了大量研究包括培育新品種、化學(xué)人工合成、組織培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)和微生物發(fā)酵。
Stroble與Stierle于1993年首次報道了從太平洋紫杉樹中分離出一種可產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌，其紫杉醇含量為24～50ng/L，為人們展示了一個可能生產(chǎn)紫杉醇的誘人的新途徑。之后，人們已經(jīng)從各種紅豆杉科植物中分離出許多能夠發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌，報道的紫杉醇含量在14.2-406.95μg/L左右，其中，馬天有，董兆麟報道的紫杉醇產(chǎn)率為14.2ug/L，(《西北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》，1999，29(1)47～49)；Strobel G A，Hess W M，F(xiàn)ord E等利用小孢盤多毛孢發(fā)酵的產(chǎn)率為60-79ug/L(J Ind Microb，1996，17417~423)；JY Li，RS Sidhu等利用內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)量為85.1μg/L左右(Joumal of induction Microbiology & Biotechnology.1998，20，259-264)；王建鋒，呂華鷹，黃耀堅(jiān)等。利用瘤座孢發(fā)酵得到的紫杉醇產(chǎn)率為185.4ug/L，(《廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》，1999，38(4)485～487)；劉曉蘭，周東坡，孫劍秋等利用樹狀多節(jié)孢發(fā)酵產(chǎn)量為406.950μg/L(《菌物系統(tǒng)》，2002，21(2)246-251)。這些發(fā)酵產(chǎn)量水平是很低的，距工業(yè)化生產(chǎn)還有一定差距。一般來說，發(fā)酵物中紫杉醇的產(chǎn)量水平要達(dá)到1mg/L左右才有工業(yè)生產(chǎn)價值。

發(fā)明內(nèi)容
本方法的目的在于提供一種通過產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌培養(yǎng)物與產(chǎn)紫杉醇合成前體的內(nèi)生真菌培養(yǎng)物進(jìn)行混合培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的新方法，使其發(fā)酵物中紫杉醇含量大幅度提高。
本方法主要采用如下步驟1、培養(yǎng)基制備(1)PDA培養(yǎng)基。
(2)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖 2-10g/L蔗糖 10-20g/L 蛋白胨 0.5-2.5醋酸鈉 0.5-3g/L MgSO42-5mg/L Ca(NO3)25-100mg/LCuSO40.5-300mg/LZnSO40.5-200mg/L MnCl21-25mg/LFeCl30.5-10mg/L KH2PO410-350mg/L 維生素B10.5-10mg/L維生素B60.5-30mg/L 苯丙氨酸 0.5-5mg/L 苯甲酸鈉 50-1000mg/L 乙酰水楊酸鈉0.01-5mg/L甲醇5-20ml/L 油酸1-10ml/L。pH6.8。
2、菌體預(yù)培養(yǎng)。分別挑取產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌與產(chǎn)紫杉醇合成前體10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III內(nèi)生真菌的菌絲接種于含50ml PDA培養(yǎng)基的發(fā)酵瓶中，在28℃，200轉(zhuǎn)每分鐘搖床黑暗培養(yǎng)2d形成種子發(fā)酵液。
3、菌體生長培養(yǎng)。分別將上述兩種真菌的種子發(fā)酵液接種于含500ml發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，在恒溫?fù)u床上于28℃，200rpm黑暗培養(yǎng)3d。擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，可以進(jìn)行二級生長培養(yǎng)。
4、混合培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇。將生長好的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌培養(yǎng)物與產(chǎn)紫杉醇合成前體的內(nèi)生真菌培養(yǎng)物按1∶0.5～4.0的體積份數(shù)比混合，補(bǔ)加總體積的0.5-1.0倍的發(fā)酵培養(yǎng)基，在恒溫?fù)u床上于28℃，200rpm黑暗培養(yǎng)6d。
5、紫杉醇的提取將發(fā)酵物4000rpm離心15min。上清液和低溫凍溶的菌體加等體積的乙酸乙酯超聲波萃取1h，重復(fù)提取2次。合并所有乙酸乙酯層，于50℃旋轉(zhuǎn)蒸干，甲醇洗滌，加入二氯甲烷和水1∶1(v/v)萃取后，將二氯甲烷蒸干，準(zhǔn)確量取1ml乙醇溶解得到紫杉醇樣品。
6、含量檢測紫杉醇樣品過濾后上高效液相色譜柱，于228nm做定性及定量檢測。以保留時間定性，以外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。標(biāo)準(zhǔn)品均為Sigma公司產(chǎn)品，高效液相色譜條件為流動相甲醇—水(65∶35)，反向C18柱，柱長15cm，柱溫25℃，流速0.8ml/min。
本方法中所述的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌包括XT5(莖葉核菌屬Ectostroma Fr.)，菌株種類鑒定(真菌鑒定手冊 魏景超遺著上海 上海科學(xué)技術(shù)出版社 1979年645-649)TAX-47(莖點(diǎn)菌屬Phoma Sacc)(參考文獻(xiàn)陳毅堅(jiān)，張碩，王艷等.云南紅豆杉(Taxus yunnanensis)內(nèi)生真菌中產(chǎn)紫杉醇真菌的篩選.生物技術(shù).2003，13(2).-10-11)；TAX-49(組絲核菌屬Phacodium Pers.Ex Wallr.)(參考文獻(xiàn)陳毅堅(jiān)，張碩，王艷等.云南紅豆杉(Taxus yunnanensis)內(nèi)生真菌中產(chǎn)紫杉醇真菌的篩選.生物技術(shù).2003，13(2).-10-11)；樹狀多節(jié)孢Nodulisporium sylviforme(參考文獻(xiàn)周東坡，平文祥，孫劍秋等.紫杉醇產(chǎn)生菌分離的研究.微生物學(xué)雜志，2001，21(1)18~20)；瘤座孢Tubercularia sp.(參考文獻(xiàn)王建鋒，呂華鷹，黃耀堅(jiān)等.一株新的紫杉醇產(chǎn)生菌及其抗腫瘤活性.廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，1999，38(4)485~487)、小孢盤多毛孢Pestalotiopsis mictospora(參考文獻(xiàn)Strobel G，YangX S，Sars J et al.Taxol from Pestalotiopsis microspora，an endophyticfungus of Taxus wallachiana.Microbiology，1996，142435~440)等。
所述的產(chǎn)紫杉醇合成前體10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III內(nèi)生真菌包括XT1(束絲菌屬Ozonium Lk.ex Fr.)，菌株種類鑒定(真菌鑒定手冊 魏景超遺著上海 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社 1979年645-649)；TAX-25(莖葉核菌屬Ectostroma Fr.)(參考文獻(xiàn)陳毅堅(jiān)，張碩，王艷等.云南紅豆杉(Taxus yunnanensis)內(nèi)生真菌中產(chǎn)紫杉醇真菌的篩選.生物技術(shù).2003，13(2).-10-11)等。
本方法是利用這兩種同類真菌代謝途徑互補(bǔ)，一方面使高產(chǎn)紫杉醇合成前體的內(nèi)生真菌為產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的生物轉(zhuǎn)化提供大量合成前體(10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III)，充分利用產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌菌株的生物轉(zhuǎn)化能力合成紫杉醇。另一方面產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌為高產(chǎn)紫杉醇合成前體的內(nèi)生真菌提供了紫杉醇合成酶和信號誘導(dǎo)因子，使產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌菌株合成的大量10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III轉(zhuǎn)化為紫杉醇，從而使發(fā)酵物中紫杉醇的產(chǎn)率大大提高。在內(nèi)生真菌生長末期，促進(jìn)細(xì)胞透性的增加和部分菌體發(fā)生的自溶，也為大幅度提高紫杉醇的產(chǎn)率創(chuàng)造了條件。
利用本方法可以大幅提高紫杉醇的含量，使發(fā)酵物中的紫杉醇含量提高3.6-4.0倍左右，達(dá)到731.3022μg/L-1094.0274μg/L之間，大大高于產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌單獨(dú)培養(yǎng)的產(chǎn)率水平，使利用內(nèi)生真菌進(jìn)行工業(yè)化發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇成為可能。
本方法不但適用于產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌與產(chǎn)紫杉醇合成前體的內(nèi)生真菌混合培養(yǎng)，提高培養(yǎng)物中紫杉醇含量。也適宜于產(chǎn)生天然有用成分的內(nèi)生真菌與產(chǎn)生天然有用成分合成前體的內(nèi)生真菌混合培養(yǎng)，提高培養(yǎng)物中天然有用成分的含量。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1本例選用的是從南方紅豆杉中分離出的兩株內(nèi)生真菌XT1(高產(chǎn)紫杉醇合成前體10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III，但幾乎不產(chǎn)紫杉醇)和XT5(產(chǎn)紫杉醇)的培養(yǎng)物進(jìn)行混合培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇。
本例涉及的兩個內(nèi)生菌株種類鑒定(真菌鑒定手冊 魏景超遺著上海上?？茖W(xué)技術(shù)出版社 1979年645-649)如下表內(nèi)生真菌的形態(tài)特征、產(chǎn)物和分類地位


上述XT5和XT1可以采用現(xiàn)有常規(guī)的方法分離獲得，以下例舉一種分離方法將南方紅豆杉(Taxus chinansis var maurei)的樹皮切成約1.5cm的小段，分別經(jīng)75％的酒精表面消毒5～15min，0.1％的升汞溶液處理15min，然后用無菌水沖洗，接種于含鏈霉素的PDA固體培養(yǎng)基平皿上，放置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)，待長出菌落后，按無菌操作程序挑出，在PDA斜面培養(yǎng)基上純化3次以上。然后分離純化后得到的真菌菌株進(jìn)行搖床液體擴(kuò)大培養(yǎng)，提取發(fā)酵物中的紫杉醇和各種前體，利用高效液相色譜測定，根據(jù)紫杉醇和紫杉醇合成前體標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間定性，用外標(biāo)法定量，篩選出的內(nèi)生真菌XT5能夠產(chǎn)生紫杉醇，而XT1能夠產(chǎn)生紫杉醇的合成前體10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III，且含量高，但幾乎不產(chǎn)生紫杉醇。
以下是將XT5和XT1混合培養(yǎng)提取紫杉醇的具體過程1、培養(yǎng)基制備PDA培養(yǎng)基的制備每升含200g土豆水煮上清液和20g葡萄糖，pH自然。
發(fā)酵培養(yǎng)基組成(未標(biāo)注單位的均為mg/L)葡萄糖 5g/L蔗糖 15g/L 蛋白胨 1g/L醋酸鈉 1g/LMgSO42.5mg/L Ca(NO3)210mg/LCuSO410mg/L ZnSO45mg/L MnCl22.5mg/L
FeCl32mg/L KH2PO4100mg/L維生素B15mg/L維生素B65mg/L 苯丙氨酸 2mg/L 苯甲酸鈉 400mg/L乙酰水楊酸鈉 1mg/L甲醇 10ml/L 油酸 5ml/LpH調(diào)到6.8，乙酰水楊酸鈉混合培養(yǎng)時再加入。
2、菌體預(yù)培養(yǎng)。分別挑取XT1和XT5菌絲接種于含50ml PDA培養(yǎng)基的發(fā)酵瓶中，在恒溫?fù)u床上28℃，200rpm黑暗培養(yǎng)2d形成發(fā)酵種子。
3、菌體生長培養(yǎng)。分別將XT1和XT5的種子發(fā)酵液接種于含500ml發(fā)酵用培養(yǎng)基的搖瓶瓶中，在恒溫?fù)u床上28℃，200rpm黑暗培養(yǎng)3d。為擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，可以進(jìn)行二級生長培養(yǎng)。
4、混合培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇。將生長好的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌和高產(chǎn)紫杉醇合成前體內(nèi)生真菌分別單獨(dú)培養(yǎng)，然后按1∶0.5～4.0體積份數(shù)比混合，補(bǔ)加總體積的0.5-1.0倍的發(fā)酵培養(yǎng)基，在恒溫?fù)u床上28℃，200rpm黑暗培養(yǎng)6d。
5、紫杉醇提取將發(fā)酵物4000rpm離心15min。上清液60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1/10體積后，加入等體積的乙酸乙酯在超聲波下萃取1h；菌體低溫凍溶2次后用組織搗碎器處理后加入等體積的乙酸乙酯在超聲波下萃取1h，收集乙酸乙酯層，菌體沉淀和上清液再加入等體積的乙酸乙酯超聲波提取2次。合并所有乙酸乙酯層，于50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入適量甲醇溶解洗滌固體物，再加入二氯甲烷和水1∶1(v/v)萃取后，將二氯甲烷層于45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，準(zhǔn)確量取1ml乙醇溶解得到紫杉醇樣品。
6、含量檢測紫杉醇樣品過濾后上高效液相色譜柱，于228nm做定性及定量檢測。以保留時間定性，以外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。標(biāo)準(zhǔn)品均為Sigma公司產(chǎn)品，高效液相色譜條件為流動相甲醇—水(65∶35)，反向C18柱，柱長15cm，柱溫25℃，流速0.8ml/min。
將上述混合培養(yǎng)與兩個菌株單獨(dú)培養(yǎng)的對照進(jìn)行比較，混合培養(yǎng)發(fā)酵物，XT5單獨(dú)培養(yǎng)，XT1單獨(dú)培養(yǎng)的發(fā)酵物中紫杉醇含量分別為731.3022μg/L，191.3381μg/L，0μg/L，混合培養(yǎng)的發(fā)酵物中所能提取到的紫杉醇含量明顯高于菌株單獨(dú)培養(yǎng)的發(fā)酵物。
實(shí)施例2將例1中，產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌換用組絲核菌屬(Phacodium Pers.ExWallr.)；高產(chǎn)紫杉醇合成前體10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III換用莖葉核菌屬(Ectostroma Fr.)。發(fā)酵培養(yǎng)基中蔗糖改為10g/L，苯丙氨酸改為1mg/L，其他條件不變，進(jìn)行TAX-49與TAX-25混合培養(yǎng)，TAX-49和TAX-25單獨(dú)培養(yǎng)。高效液相色譜檢測，發(fā)酵物中紫杉醇含量分別為842.5648μg/L，231.5830μg/L，0μg/L。
實(shí)施例3將例1中發(fā)酵培養(yǎng)基中蔗糖改為10g/L，苯丙氨酸改為1mg/L，乙酰水楊酸鈉改為0.5mg/L，油酸改為10ml/L，其他條件不變，進(jìn)行XT5與XT1混合培養(yǎng)，XT5，XT1單獨(dú)培養(yǎng)，高效液相色譜檢測，發(fā)酵物中紫杉醇含量分別為1094.0274μg/L，276.7554μg/L，0μg/L。
表培養(yǎng)物中紫杉醇含量 單位μg/L

權(quán)利要求
1.一種提高紅豆杉內(nèi)生真菌發(fā)酵物中紫杉醇產(chǎn)率的方法，其特征在于將產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌與產(chǎn)紫杉醇合成前體10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III內(nèi)生真菌的培養(yǎng)物進(jìn)行混合培養(yǎng)，大幅度提高發(fā)酵物中紫杉醇的產(chǎn)率，步驟如下(1)培養(yǎng)基制備①PDA培養(yǎng)基②發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖2-10g/L蔗糖10-20g/L蛋白胨0.5-2.5g/L醋酸鈉0.5-3g/L MgSO42-5mg/L Ca(NO3)25-100mg/LCuSO40.5-300mg/L ZnSO40.5-200mg/L MnCl21-25mg/LFeCl30.5-10mg/L KH2PO410-350mg/L 維生素B10.5-10mg/L維生素B60.5-30mg/L 苯丙氨酸0.5-5mg/L 苯甲酸鈉50-1000mg/L乙酰水楊酸鈉0.01-5mg/L 甲醇5-20ml/L 油酸1-10ml/L，pH 6.8；(2)菌體預(yù)培養(yǎng)；分別挑取產(chǎn)紫杉醇合成前體10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III內(nèi)生真菌和產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的菌絲接種于含50ml PDA培養(yǎng)基的發(fā)酵瓶中，培養(yǎng)形成種子發(fā)酵液；(3)菌體生長培養(yǎng)分別將上述兩種真菌的種子發(fā)酵液接種于含500ml發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，培養(yǎng)得到含菌體和培養(yǎng)液的真菌菌液；(4)將上述兩種發(fā)酵物(既真菌菌液)進(jìn)行混合培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇將生長好的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌菌液與產(chǎn)紫杉醇合成前體10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III內(nèi)生真菌菌液按1∶0.5～4.0的體積份數(shù)比混合，補(bǔ)加總體積的0.5-1.0倍的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)；(5)紫杉醇提取將發(fā)酵物4000rpm離心15min，上清液和低溫凍溶的菌體加等體積的乙酸乙酯超聲波萃取1h，重復(fù)提取2次；合并所有乙酸乙酯層，于50℃旋轉(zhuǎn)蒸干，甲醇洗滌，加入二氯甲烷和水1∶1(v/v)萃取后，將二氯甲烷蒸干，準(zhǔn)確量取1ml乙醇溶解得到紫杉醇樣品；(6)含量檢測紫杉醇樣品過濾后上高效液相色譜柱，于228nm做定性及定量檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高紅豆杉內(nèi)生真菌發(fā)酵物中紫杉醇產(chǎn)率的方法，其特征在于所述的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌包括XT5(莖葉核菌屬Ectostroma Fr.)、TAX-47(莖點(diǎn)菌屬Phoma Sacc)、TAX-49(組絲核菌屬Phacodium Pers.Ex Wallr.)、樹狀多節(jié)孢Nodulisporium sylviforme、瘤座孢Tubercularia sp.、小孢盤多毛孢Pestalotiopsis mictospora；所述產(chǎn)紫杉醇合成前體10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III內(nèi)生真菌包括XT1(束絲菌屬Ozonium Lk.ex Fr.)、TAX-25(莖葉核菌屬Ectostroma Fr.)。
全文摘要
一種提高紅豆杉內(nèi)生真菌發(fā)酵物中紫杉醇產(chǎn)率的方法，本方法利用產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌與產(chǎn)紫杉醇合成前體10－去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III分別單獨(dú)培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)物進(jìn)行混合培養(yǎng)，并適當(dāng)補(bǔ)加培養(yǎng)基，大幅度提高發(fā)酵物中紫杉醇的產(chǎn)率。本方法的優(yōu)點(diǎn)在于利用兩種同類真菌代謝途徑互補(bǔ)大幅提高發(fā)酵物中紫杉醇的含量，大大高于產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌單獨(dú)培養(yǎng)的產(chǎn)率水平。使利用內(nèi)生真菌進(jìn)行工業(yè)化發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇成為可能。本方法不但適用于產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌與產(chǎn)紫杉醇合成前體的內(nèi)生真菌混合培養(yǎng)，提高培養(yǎng)物中紫杉醇含量。也適宜于產(chǎn)生天然有用成分的內(nèi)生真菌與產(chǎn)生天然有用成分合成前體的內(nèi)生真菌混合培養(yǎng)，提高培養(yǎng)物中天然有用成分的含量。
文檔編號C12N1/14GK1624103SQ20041008126
公開日2005年6月8日 申請日期2004年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月13日
發(fā)明者談鋒, 胡凱, 祝順琴, 唐克軒, 廖志華 申請人:西南師范大學(xué)