專利名稱：Dna序列、其編碼的蛋白質(zhì)及制法、轉(zhuǎn)化酵母菌株及用途的制作方法
本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?6106077.8申請(qǐng)的分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為1996年2月14日，發(fā)明名稱為“編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)的DNA序列和該蛋白質(zhì)及生產(chǎn)方法，轉(zhuǎn)化酵母菌株，用途”。
編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的A.thaliana蛋白質(zhì)的DNA序列，δ7-Red蛋白質(zhì)，生產(chǎn)方法，轉(zhuǎn)化酵母菌株，用途。
本發(fā)明涉及編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的A.thaliana蛋白質(zhì)的DNA序列，δ 7-Red蛋白質(zhì)，它們的生產(chǎn)方法，轉(zhuǎn)化酵母菌株及其用途。
δ-5，7甾醇，δ-7還原酶(E.C.1.3.1.21)是一種微粒體酶，根據(jù)其在大鼠的肝勻漿中具有活性(M.E.Dempsey等人，MethodsEnzymol.，15，501-514，1969)以及在玉米植物制劑中具有活性(M.Taton等人，Biochem.Biophys.Res，Commun.，181，465-473，1991)已經(jīng)證明了該酶的存在。該還原酶依賴于NADPH并在體外將7-脫氫膽甾醇還原為膽甾醇。
膽甾是真核生物膜的主要組成成分，但根據(jù)種的不同顯示出結(jié)構(gòu)上的差異。在真核生物例如酵母的細(xì)胞中，主要甾醇是麥角甾醇，該甾醇在C-5和C-7位均是不飽和的，在C-24位具有一個(gè)分支側(cè)鏈，并且在C-22位也是不飽和的，而哺乳動(dòng)物甾醇特征在于在C-5位進(jìn)行了脫飽和作用并且含有一個(gè)飽和的側(cè)鏈。植物中最有代表性的一般甾醇的谷甾醇，豆甾醇和菜油甾醇具有一個(gè)分支但飽和的側(cè)鏈并且如同脊椎動(dòng)物的甾醇，在C-7位上也是不飽和的。對(duì)甾醇核結(jié)構(gòu)之間的這種差異起作用的酶是δ-5，7甾醇，δ-7還原酶。
還從沒有將δ-5，7甾醇，δ-7還原酶純化至均一并且僅描述了部分純化方法(M.E.Dempsey等人；M.Taton等人，已經(jīng)引述過)。該蛋白質(zhì)的物理-化學(xué)特性還沒有得到表征。對(duì)該蛋白質(zhì)的序列信息以及針對(duì)該蛋白質(zhì)的抗體都沒有描述。此外，對(duì)患有RSH/Smith-Lemli-Opitz(SLO)綜合癥的人體的7-脫氫膽甾醇還原酶的近核效率已有描述(J.M.Opitz等人，Am.J.Med.Genet.，50，326-338，1994)。
采用已知方法還沒有獲得編碼δ-5，7甾醇，δ-7還原酶的CDNA的克隆，利用該克隆可以鑒定相應(yīng)蛋白質(zhì)的序列，也可以對(duì)人基因進(jìn)行定性或者將該基因的先天性缺陷顯露出來，所述已知方法是使用例如雜交和/或免疫檢測(cè)技術(shù)。因此特別尋求可以實(shí)施克隆的有創(chuàng)造性的篩選方法，尤其是在沒有有關(guān)蛋白質(zhì)信息的情況下。
真菌膜的主要甾醇，豆甾醇在C-5，7位含有一對(duì)共軛的雙鏈，該雙鍵為多烯族化合物例如制霉菌素提供了抗霉菌素的活性(R.Bittman等人，J.Biol.Chem.260，2884-2889，1985)。根據(jù)制霉菌素作用的發(fā)揮對(duì)C-5，7位不飽和的甾醇在膜中的濃度有強(qiáng)烈依賴性這一情況，可以在釀酒酵母中選擇有關(guān)積累甾醇的突變菌株(S.W.Molzahn等人，J.Gen.Microbiol.，72，339-348，1972)。因此，突變體erg2和erg3積累甾醇，它們?cè)贑-5，7位沒有共軛雙鍵，因?yàn)樗鼈兎謩e在甾醇δ-8，7異構(gòu)酶(W.Ashman等人，Lipids，26，628，1991)以及甾醇δ-5脫氫酶(B.Arthinton等人，Gene，102，39，1991)方面有缺陷。這樣的突變體是能生存的，因?yàn)樵谶m當(dāng)條件下可用不同替代甾醇包括膽甾醇代替豆甾醇，酵母的主要天然甾醇。
發(fā)明人利用一種干擾釀酒酵母代謝的篩選方法將編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的異源蛋白質(zhì)的CDNA進(jìn)行克隆，發(fā)現(xiàn)了富含在C-5，7位沒有雙重不飽和的甾醇的酵母菌株其對(duì)制霉素素抗性的增加是具有益處。而且這種方法的成功之處在于克服了許多技術(shù)難點(diǎn)也是沒有預(yù)見到的，該方法具有不依賴于已知DNA序列或蛋白質(zhì)并且可僅根據(jù)酶活性進(jìn)行檢測(cè)的雙重優(yōu)點(diǎn)。
第一方面的限制處來自于下列事實(shí)制霉菌素起作用的方式還沒有被完全闡明(L.W.Parks等人，CRC Critical Reviews inMicrobiology，301-304，1978)。例如，由于促使酵母中對(duì)自發(fā)基因組突變例如erg突變體(S.W.Molzahn等人，已經(jīng)引述過)或者涉及獨(dú)立于甾醇途徑的抗性的基因組突變發(fā)生進(jìn)行選擇的制霉菌素的間接特性，這種低特異性的制霉菌素的選擇作用是可預(yù)見到的。同樣，由基因文庫轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以表達(dá)能提供與甾醇途徑不相關(guān)的制霉菌素抗性的異源基因。
另一個(gè)預(yù)料中的受限制方面的實(shí)例是涉及下列事實(shí)該異源蛋白質(zhì)在細(xì)胞中活性弱，由于例如下列原因之一而導(dǎo)致對(duì)制霉菌素沒有或較低抗性1)微弱地表達(dá)編碼δ-5，7甾醇，δ-7還原酶的基因；2)由于缺乏折疊或者由于不正確的亞細(xì)胞定位，該蛋白質(zhì)是弱活性或沒有活性；3)植物蛋白質(zhì)不能將酵母自身甾醇辨認(rèn)為底物或者4)可以作為底物的甾醇是酯化形式或者貯存于泡囊中并且不與酶接觸。因此，預(yù)期以這種方式積累的甾醇逃脫了δ-5，7甾醇，δ-7還原酶的作用，在真核生物中認(rèn)為該還原酶定位于微粒體中。
本發(fā)明涉及根據(jù)一種克隆方法將編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)(命名為δ-7Red)的A.thaliana cDNA的進(jìn)行克隆，所述克隆方法是根據(jù)對(duì)制霉菌素的抗性在酵母中進(jìn)行代謝干擾來完成的。該δ-7Red蛋白質(zhì)通過一個(gè)生物還原方法使在C-7位不飽和的甾醇被還原，另外，該蛋白質(zhì)為使甾醇或類固醇(在C-5，7位有雙重不飽和位)的C-7位進(jìn)行選擇性還原提供了有益的解決辦法，這種選擇性還原作用是采用化學(xué)途徑的還原方法達(dá)不到的。
本發(fā)明還涉及表達(dá)δ-7Red的轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，所述酵母細(xì)胞以令人驚奇的方式積累C-7位飽和并且C-22位飽和或不飽和的產(chǎn)品，與豆甾醇相反，該產(chǎn)品是膽因醇側(cè)鏈的限制性酶的底物即細(xì)胞色素P450SCC。
這些未曾預(yù)料到特性可將本發(fā)明的轉(zhuǎn)化酵母用于制備具有工業(yè)的和/或藥物用途的甾醇或類固醇的方法中，尤其是通過在腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶(ADR)和腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白(ADX)存在下，由細(xì)胞色素P450SCC(P450SCC)在第C-7位上使之還原而使內(nèi)源酵母甾醇發(fā)生生物氧化從而制備孕甾烯醇酮。還可以將本發(fā)明的轉(zhuǎn)化酵母用于制備在哺乳動(dòng)物和其他脊椎動(dòng)物中膽固醇轉(zhuǎn)化為氫化可的松的代謝途徑的中間產(chǎn)物類固醇的方法中。這種應(yīng)用具有在生物氧化方法制備氫化可的松或其中間體的優(yōu)點(diǎn)，這種方法不需要將外源甾醇例如膽甾醇用作為起始底物，從而回避了甾醇滲透到酵母中的問題，前面已經(jīng)描述過在有氧條件下外源甾醇不具有滲透性(R.T.Lorentz等人，J.Bacteriology，981-985，1986)。
本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明的克隆方法獲得的核酸序列的使用。編碼δ-5，7甾醇，δ-7還原酶的RNA或DNA可用于診斷或治療涉及δ-5，7甾醇，δ-7還原酶的基因產(chǎn)物的疾病。例如，據(jù)推測(cè)能將7-脫氫膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇的δ-5，7甾醇，δ-7還原酶的缺陷與RSH/SLO綜合癥有關(guān)。因此，可將人DNA序列用作為探計(jì)，用于診斷δ-5，7甾醇，δ-7還原酶的缺陷，并且也可用于糾正這種缺陷而進(jìn)行的基因治療。
因此，本發(fā)明的一個(gè)主題是一種核酸序列，包含有編碼具δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)的序列，所述核酸是一種DNA或一種RNA并且尤其是一種CDNA。
利用在實(shí)施例部分進(jìn)一步描述的體外酶促檢測(cè)方法例如，可以顯示δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性。
本發(fā)明更具體的一個(gè)方面是涉及一種cDNA序列，其中的編碼序列為具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的A.thaliana的蛋白質(zhì)編碼，并且它具有序列SEQ ID No.1的核苷酸序列GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG AATCTGAGGC TTTGGCCGAG ACGAAGAGAA 60AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG GAG ACT GTA CAT TCT CCG ATC GTT ACT TAC 111Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr1 5 10GCA TCG ATG TTA TCG CTT CTC GCC TTC TGT CCA CCT TTC GTC ATT CTC 159Ala Ser Met Leu Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu15 20 25CTA TGG TAC ACA ATG GTT CAT CAG GAT GGT TCT GTT ACT CAG ACC TTT 207Leu Trp Tyr Thr Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe30 35 40GGC TTC TTT TGG GAG AAT GGA GTT CAA GGA CTT ATC AAC ATA TGG CCA 255Gly Phe Phe Trp Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro45 50 55 60
AGA CCC ACT TTG ATT GCT TGG AAA ATT ATA TTT TGC TAT GGA GCA TTT 303Arg Pro Thr Leu Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe65 70 75GAA GCT ATT CTT CAG CTG CTT CTG CCT GGT AAA AGA GTT GAG GGT CCA 351Glu Ala Ile Leu Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro80 85 90ATA TCT CCA GCC GGA AAC CGA CCA GTT TAC AAG GCC AAT GGT CTG GCT 399Ile Ser Pro Ala Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala95 100 105GCT TAC TTT GTG ACA CTA GCA ACC CAT CTT GGT CTT TGG TGG TTT GGA 447Ala Tyr Phe Val Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly110 115 120ATC TTC AAC CCT GCA ATT GTC TAT GAT CAC TTG GGT GAA ATA TTT TCG 495Ile Phe Asn Pro Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser125 130 135 140GCA CTA ATA TTC GGA AGC TTC ATA TTT TGT GTT TTG TTG TAC ATA AAA 543Ala Leu Ile Phe Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys145 150 155GGC CAT GTT GCA CCT TCA TCA AGT GAC TCT GGT TCA TGT GGT AAC CTA 591Gly His Val Ala Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu160 165 170ATA ATT GAC TTC TAT TGG GGC ATG GAG TTG TAC CCT CGA ATT GGT AAG 639Ile Ile Asp Phe Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys175 180 185AGC TTT GAC ATC AAG GTG TTT ACT AAT TGC AGA TTC GGA ATG ATG TCT 687Ser Phe Asp Ile Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser190 195 200TGG GCA GTT CTT GCA GTC ACG TAC TGC ATA AAA CAG TAT GAA ATA AAT 735Trp Ala Val Leu Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gln Tyr Glu Ile Asn205 210 215 220
GGC AAA GTA TCT GAT TCA ATG CTG GTG AAC ACC ATC CTG ATG CTG GTG 783Gly Lys Val Ser Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val225 230 235TAT GTC ACA AAA TTC TTC TGG TGG GAA GCT GGT TAT TGG AAC ACC ATG 831Tyr Val Thr Lys Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met240 245 250GAC ATT GCA CAT GAC CGA GCT GGA TTC TAT ATA TGC TGG GGT TGT CTA 879Asp Ile Ala His Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu255 260 265GTG TGG GTG CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA GGC ATG TAC CTT GTG AAC 927Val Trp Val Pro Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn270 275 280CAC CCC GTC GAA CTC GGA ACT CAG TTG GCA ATA TAC ATT CTC GTT GCA 975His Pro Val Glu Leu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala285 290 295 300GGA ATT CTG TGC ATT TAC ATA AAG TAT GAC TGT GAT AGA CAA AGG CAA1023Gly Ile Leu Cys Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gln305 310 315GAG TTC AGG AGG ACA AAC GGG AAA TGT TTG GTT TGG GGA AGA GCC CCG1071Glu Phe Arg Arg Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro320 325 330TCA AAG ATT GTG GCG TCG TAT ACT ACA ACA TCT GGT GAA ACT AAA ACT1119Ser Lys Ile Val Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr335 340 345AGT CTT CTC TTA ACG TCT GGA TGG TGG GGA TTG GCT CGT CAT TTC CAT1167Ser Leu Leu Leu Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His350 355 360TAT GTT CCT GAG ATC TTA AGT GCT TTC TTC TGG ACC GTA CCG GCT CTC1215Tyr Val Pro Glu Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu365 370 375 380TTC GAT AAC TTC TTG GCA TAC TTC TAC GTC CTC ACC CTT CTT CTC TTT1263Phe Asp Asn Phe Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe385 390 395
GAT CGA GCC AAG AGA GAC GAT GAC CGA TGC CGA TCA AAG TAT GGG AAA1311Asp Arg Ala Lys Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys400 405 410TAT TGG AAG CTG TAT TGT GAG AAA GTC AAA TAC AGG ATC ATT CCG GGA1359Tyr Trp Lys Leu Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly415 420 425ATT TAT TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTAATTC 1415Ile Tyr430GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT GCAAATTGAT GCGATAGACA 1475TTCTTTTGCT GAAAAAAAAA A1496以及該序列的等位變異體。
編碼具有相應(yīng)于圖3中所示序列(SEQ ID NO2)的430個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)的上述cDNA序列是一種cDNA序列，按照在下文中進(jìn)一步詳細(xì)描述的操作條件，利用基于酵母對(duì)制霉菌素的抗性出現(xiàn)進(jìn)行的篩選方法，從A.thaliana表達(dá)文庫開始在酵母中進(jìn)行克隆可以獲得該cDNA序列。
知道了上述的核苷酸序列SEQ ID NO1，采用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的方法，例如采用化學(xué)合成法或者利用合成的寡核苷酸探針以及雜交技術(shù)篩選基因文庫或cDNA文庫或者采用PCR擴(kuò)增?？梢灾貜?fù)本發(fā)明。
本發(fā)明還有一個(gè)主題是涉及編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)的DNA序列，該DNA序列在中等或者高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1的核苷酸序列雜交或者這兩個(gè)序列有約60％或者更多的序列相同性。
在中等嚴(yán)緊的標(biāo)準(zhǔn)條件下，例如在50％甲酰胺SSC×6溶液中，42℃雜交12小時(shí)，隨后進(jìn)行洗滌或者在低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下，例如在20％甲酰胺，SSC×6溶液中，于42℃雜交24小時(shí)，隨后在已知標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行洗滌(T.Maniatis等人，Molecular Cloning，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)能夠以一種可檢測(cè)方式將上述所述序列與SEQ ID NO.1序列進(jìn)行雜交。
利用例如BLAST程序″basic local alignment search tool″(S.F.Altschul等人，J.Mol.Biol.，215，403-410，1990)在NCBI輔助器上測(cè)出核苷酸序列等同性的百分?jǐn)?shù)。
本發(fā)明還涉及編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)的DNA序列，并且采用PCR技術(shù)，利用編碼具有SEQ ID NO3氨基酸序列的共有序列的寡核苷酸作為引物可擴(kuò)增該DNA序列Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa1 5 10Xaa Tyr15其中7位的Xaa是Trp或者Tyr并且第12位的Xaa是His或者Lys。
上述SEQ ID NO.3序列對(duì)應(yīng)于一種新的共有序列，通過對(duì)從SEQ ID NO.1核苷酸序列推測(cè)出的新序列SEQ ID NO.2與編碼在除C-7位以外的一個(gè)位置上具有持異性作用的其他甾醇還原酶或者編碼lamin B受體的已知序列之間的氨基酸序列等同性進(jìn)行排列，已經(jīng)對(duì)該新的共有序列進(jìn)行了限定，在實(shí)施例部分對(duì)該步驟將作詳細(xì)描述。根據(jù)氨基酸序列SEQ ID NO.3給出的信息，可以定義并合成至多由45個(gè)核苷酸組成的引物，利用該引物，并與作為返回序列的第二種引物寡聚dT(17個(gè)核苷酸)結(jié)合一起，可以用商業(yè)途徑購買的PCR檢測(cè)藥盒(例如Stratagene)，對(duì)編碼具δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。
本發(fā)明還涉及具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性并且具有SEQID NO2的氨基酸序列的A.thaliana蛋白質(zhì)
Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr Ala Ser Met Leu1 5 10 15Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu Leu Trp Tyr Thr20 25 30Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe Gly Phe Phe Trp35 40 45Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro Arg Pro Thr Leu50 55 60Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe Glu Ala Ile Leu65 70 75 80Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro Ile Ser Pro Ala85 90 95Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala Ala Tyr Phe Val100 105 110Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly Ile Phe Asn Pro115 120 125Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser Ala Leu Ile Phe130 135 140Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys Gly His Val Ala145 150 155 160Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu Ila Ile Asp Phe165 170 175Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys Ser Phe Asp Ile180 185 190Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser Trp Ala Val Leu195 200 205Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gln Tyr Glu Ile Asn Gly Lys Val Ser210 215 220
Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val Tyr Val Thr Lys225 230 235 240Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met Asp Ile Ala His245 250 255Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu Val Trp Val Pro260 265 270Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn His Pro Val Glu275 280 285Leu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala Gly Ile Leu Cys290 295 300Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gln Glu Phe Arg Arg305 310 315 320Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro Ser Lys Ile Val325 330 335Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu340 345 350Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His Tyr Val Pro Glu355 360 365Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu Phe Asp Asn Phe370 375 380Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe Asp Arg Ala Lys385 390 395 400Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys Tyr Trp Lys Leu405 410 415Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly Ile Tyr420 425 430以及該序列的等位變異體和類似物。
對(duì)于等位體和類似物，包括通過取代，缺失或增加一或多個(gè)氨基酸而修飾得到的序列，只要這些產(chǎn)物保留了相同的功能。利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的位點(diǎn)特異性誘變技術(shù)例如可以制備這些修飾序列。
本發(fā)明的一個(gè)特定方面是具有δ-5，7甾醇δ-7還原酶活性并且具有上述的SEQ ID NO.2氨基酸序列的A.thaliana蛋白質(zhì)并且命名為δ-7Red。
本發(fā)明還涉及具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列與SEQ ID NO.2序列具有約60％和更多的序列等同性。
利用上面指出的BLAST程序例如可以測(cè)出等同性百分?jǐn)?shù)。
本發(fā)明還涉及具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性以及與上文中定義的A.thaliana δ-7Red蛋白質(zhì)具有交叉免疫反應(yīng)性的蛋白質(zhì)。
例如利用根據(jù)已知方法制備的針對(duì)δ-7Red蛋白質(zhì)的抗血清，以及免疫沉淀方法可以檢測(cè)到該蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)例如通過在含有前面定義的DNA序列的宿主細(xì)胞中表達(dá)而獲得的蛋白質(zhì)，本發(fā)明具體涉及A.thaliana蛋白質(zhì)，例如通過在含有編碼上述SEQ ID NO.2的氨基酸序列的DNA序列的宿主細(xì)胞中表達(dá)而獲得的蛋白質(zhì)。
當(dāng)在宿主細(xì)胞表達(dá)而獲得本發(fā)明蛋白質(zhì)時(shí)，可根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的遺傳工程方法和細(xì)胞培養(yǎng)方法來完成。
表達(dá)可以在原核宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌或在真核宿主細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞或酵母中完成，所述宿主含有前面有合適啟動(dòng)子的編碼本發(fā)明的δ-7Red的序列。
所獲得的重組蛋白可以是糖基化的或非糖基化的。
具體地講本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明得到的蛋白質(zhì)，例如通過在酵母細(xì)胞中表達(dá)獲得的。
本發(fā)明還涉及針對(duì)前面定義的具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)的抗體。該抗體可以是根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的方法制備的一種多克隆或單克隆抗體。
本發(fā)明還涉及含有前面定義的DNA序列的表達(dá)載體以及涉及由該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
表達(dá)載體是允許蛋白質(zhì)在合適載體控制下進(jìn)行表達(dá)的已知載體。對(duì)于原核細(xì)胞，啟動(dòng)子可以是例如lac啟動(dòng)子，trp啟動(dòng)子，tac啟動(dòng)子，β-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子或pl啟動(dòng)子。對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，啟動(dòng)子可以是SV40啟動(dòng)子或腺病毒的啟動(dòng)子。桿狀病毒型載體也可用于在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。對(duì)于酵母細(xì)胞細(xì)胞該啟動(dòng)子可以是例如PGK啟動(dòng)子，ADH啟動(dòng)子，CYC1啟動(dòng)子或GAL10/CYC1啟動(dòng)子。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。原核細(xì)胞例如有大腸桿菌，芽孢桿菌或鏈霉菌，原核宿主細(xì)胞包括酵母和絲狀真菌以及更高等生物細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是倉鼠CHO細(xì)胞或猴COS細(xì)胞。昆蟲細(xì)胞可以是例如SF9細(xì)胞。酵母細(xì)胞可以是例如釀酒酵母細(xì)胞，Schizosaccharomyces pombe或Kluyveromyces lactis本發(fā)明的又一主題是在微生物中克隆編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)的核酸的克隆方法，該方法包括一種篩選方法，該篩選方法用于選擇-對(duì)制霉菌素或一種類似化合物具抗性的微生物，所述化合物的毒性依賴于在C-7位攜帶不飽和鍵的甾醇的存在而定，
克隆方法還包括-將該核酸與上述SEQ ID NO.1的核苷酸序列進(jìn)行雜交，-利用數(shù)據(jù)處理技術(shù)從隨機(jī)分離到的DNA序列鑒別出該核酸，-直接表達(dá)該蛋白質(zhì)，隨后用針對(duì)具有上述SEQ ID NO.2氨基酸序列的蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)。
所述微生物是指一種酵母例如釀酒酵母S.pombe或K.laetis。
類似于制霉菌素的化合物包括例如兩性霉素B或菲律賓菌素。
所述雜交是指在中等或高度嚴(yán)緊條件下根據(jù)已知標(biāo)準(zhǔn)方法(T.Maniatis等人，已經(jīng)引述)進(jìn)行的雜交。
根據(jù)上面說明的BLAST程序例如可以完成利用數(shù)據(jù)處理技術(shù)進(jìn)行鑒別。
在實(shí)施例部分進(jìn)一步描述了上面所述克隆方法的一個(gè)實(shí)例，其中的篩選方法使用了對(duì)制霉菌素具抗性的酵母。
本發(fā)明的一個(gè)主題還包括采用上面克隆方法獲得的DNA或RNA核酸序列。核酸序列可根據(jù)完成克隆所取材料而分為原核或真核來源例如來源于人類。
本發(fā)明的一個(gè)方面還涉及用含有經(jīng)上述克隆方法得到之DNA序列的載體而轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。前文已列舉了宿主細(xì)胞和載體的實(shí)例。
本發(fā)明的一個(gè)方面還特別涉及由載體轉(zhuǎn)化的選自酵母或絲狀真菌的宿主細(xì)胞，所述載體含有本發(fā)明上文所定義的DNA序列或用上述克隆方法得到的DNA序列。
本發(fā)明一個(gè)方面也涉及具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)的制備方法，其中包括培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并且分離表達(dá)的蛋白質(zhì)，本發(fā)明特別涉及其中所用宿主細(xì)胞為一種轉(zhuǎn)化酵母的方法，在該宿主細(xì)胞中DNA序列處于酵母啟動(dòng)子控制之下。
本發(fā)明的另一方面涉及在C-7位上不飽和的甾醇的體外還原方法，其中包括將待還原的甾醇與上述方法獲得的蛋白質(zhì)進(jìn)行保溫，并且選擇性包括分離獲得被還原甾醇的步驟。
本發(fā)明一個(gè)方面還涉及在C-7位不飽和的外源甾醇的體內(nèi)還原方法，該方法包括將甾醇與本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞一起保溫，并且可選擇性地采用分離被還原甾醇的步驟，宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，尤其是酵母或絲狀真菌。
本發(fā)明的一個(gè)方面還涉及在C-7位不飽和的內(nèi)源甾醇的體內(nèi)還原方法，其中培養(yǎng)選自于酵母或絲狀真菌的本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化宿主菌株，并且選擇性地采用分離所積累的還原所得甾醇的步驟。
具體地說，本發(fā)明涉及上述定義的體外或體內(nèi)還原方法，其中所獲得的被還原的甾醇是膽固醇側(cè)鏈限制性酶的底物(P450SCC)并且本發(fā)明尤其是涉及體內(nèi)還原方法，其中待還原的內(nèi)源甾醇是麥角甾5，7二烯3-醇，麥角甾5，7，24(28)三烯3-醇或者麥角甾5，7，22三烯3-醇或者它們的混和物。
本發(fā)明的一個(gè)方面還涉及孕甾烯醇酮的生產(chǎn)方法，其中包括將選自于酵母或絲狀真菌的本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，將在C-7位被還原的被積累的內(nèi)源甾醇或類固醇進(jìn)行分離或不分離，在P450SCC存在，并且有或沒有腎上腺皮質(zhì)激素還原酶(ADR)以及腎上腺皮質(zhì)激素(ADX)存在下保溫被還原的甾醇，并且分離或不分離獲得的孕甾烯醇酮。
本發(fā)明的一個(gè)特定方面是生產(chǎn)上文中定義的孕甾烯醇酮的方法，其中宿主細(xì)胞是酵母。
本發(fā)明還涉及孕甾烯醇酮的生產(chǎn)方法，其中將由一個(gè)或多個(gè)載體轉(zhuǎn)化的酵母進(jìn)行培養(yǎng)，所述載體允許具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)以及P450SCC以及有或沒有ADR和ADX一起共表達(dá)，對(duì)游離或酯化的孕甾烯醇酮進(jìn)行分離或不分離。
本發(fā)明特別涉及上述方法，在該方法中將具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)，P450SCC，ADR和ADX進(jìn)行共表達(dá)的轉(zhuǎn)化酵母進(jìn)行培養(yǎng)，更具體地涉及這樣的方法，其中具有δ-5，7甾醇δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)是A.thalianaδ-7Red的蛋白質(zhì)，并更進(jìn)一步涉及其中酵母菌株是ECO1/PCD63的菌株的上述方法。
在實(shí)施例部分進(jìn)一步給出了本發(fā)明所述孕甾烯醇酮的生產(chǎn)的實(shí)施例。
用于實(shí)施孕甾烯醇酮生產(chǎn)方法的轉(zhuǎn)化酵母可以是例如由本發(fā)明表達(dá)載體以及細(xì)胞色素P450SCC和包括或不包括ADX和ADR的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化的酵母，所述表達(dá)載體含有編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性之蛋白質(zhì)的DNA序列。細(xì)胞色素P450SCC和/或ADX的表達(dá)載體是已知的并且其制備描述于例如歐洲專利申請(qǐng)EP0340878以及進(jìn)一步可參見實(shí)施例部分描述。
所使用的轉(zhuǎn)化酵母還可以是一種酵母，其中編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)的DNA序列整合到基因組特定位點(diǎn)，例如在ADE2位點(diǎn)，并且麥角甾醇不再是在δ-7還原酶表達(dá)條件下的主要甾醇。然后用整合性表達(dá)盒或由表達(dá)載體轉(zhuǎn)化獲得的″整合″酵母，所述表達(dá)載體含有編碼細(xì)胞色素P450SCC并且包括或不包括ADX和ADR的DNA序列。
在實(shí)施例部分進(jìn)一步給出了構(gòu)建體內(nèi)生產(chǎn)孕甾烯醇酮或其乙酸酯的酵母菌株的實(shí)施例。
因此本發(fā)明主題還包括轉(zhuǎn)化酵母菌株，它能共表達(dá)具有δ-5，7甾醇δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)，P450SCC，ADR和ADX并且積累游離或酯化孕甾烯醇酮，本發(fā)明特別包括這樣的上述酵母菌株，其中具有δ-5，7甾醇δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)是A.thaliana δ-7Red蛋白質(zhì)以及具體涉及稱為ECO1/PCD63酵母菌株，其精確結(jié)構(gòu)進(jìn)一步描述于實(shí)施例部分。
本發(fā)明還延伸到根據(jù)上文中定義的克隆方法獲得的人DNA序列，利用該序列作為探針可用于診斷δ-5，7甾醇，δ-7還原酶的先天性缺陷。δ-5，7甾醇，δ-7還原酶的缺陷包括例如7-脫氫膽固醇還原酶的缺陷，該酶的缺陷是導(dǎo)致血漿中膽固醇含量異常低的原因。
本發(fā)明還涉及檢測(cè)δ-5，7甾醇，δ-7還原酶缺陷的方法，該方法包括在標(biāo)準(zhǔn)雜交條件下將含有人基因組DNA的樣品與上文中定義的探針一起保溫，并且展現(xiàn)出該探針是否與基因組DNA固定，如果后者沒有被固定或還原，表明δ-5，7甾醇，δ-7還原酶先天性缺陷。
本發(fā)明方法還可用于例如檢測(cè)胎兒期或新生兒以及患有各種疾病的病人尤其是具有RSH/SLO綜合癥臨床表現(xiàn)的患者的δ-5，7甾醇，δ-7還原酶的先天缺陷。
附圖描述了發(fā)明的特定方面

圖1表示從對(duì)制霉菌素具抗性的F22克隆提取到的總甾醇的概況，所述克隆是通過從FY1679酵母中篩選A.thaliana文庫獲得的。在205nm或在285nm處進(jìn)行RP-HPLC(圖1A)或者與未轉(zhuǎn)化酵母FY1679比較GC(圖1B)可完成上述分析。
圖2描述了pF22質(zhì)粒的NotI片段的限制性圖譜以及測(cè)序方案。
圖3描述了cDNA δ-7Red的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)以及相應(yīng)的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)。
圖4描述了用誘導(dǎo)型表達(dá)載體″δ-7/V8″轉(zhuǎn)化的FY1679的微粒體部分的δ-5，7甾醇δ-7還原酶活性的體外檢測(cè)。分析是采用GC進(jìn)行的，并且證明在內(nèi)源甾醇5，22二烯3-醇(RT＝16.682)；麥角甾醇(RT＝17.249)；麥角甾5-烯3-醇(RT＝17.664)存在下底物7-脫氫膽固醇(RT＝16.528)轉(zhuǎn)化為膽固醇(RT＝15.887)。
圖5描述了孕甾烷酮醇的體外制備，即通過將從表達(dá)δ-7Red的轉(zhuǎn)化酵母純化到的麥角甾5-烯3-醇(圖5A)；麥角甾5，24(28)二烯3-醇(5B)或麥角甾5，22二烯3-醇(5C)進(jìn)行限制，然后與P450SCC，ADX和ADR一起保溫而制備。通過與作為對(duì)照限制的膽固醇比較GC而進(jìn)行分析。
圖6描述了整合性質(zhì)粒PADδ-7的構(gòu)建，該質(zhì)粒允許編碼δ-7Red(甾醇δ-7還原酶)的cDNA整合到ADE2位點(diǎn)。
圖7描述通過將在半乳糖存在下培養(yǎng)的FY1679菌株和ELR01整合菌株進(jìn)行堿性皂化而提取到的總甾醇的GC進(jìn)行分析結(jié)果。
圖8是穿梭載體大腸桿菌-釀酒酵母V13的構(gòu)建示意圖，該載體在多克隆位點(diǎn)中含有單一的Sal I(Sa)位點(diǎn)。
圖9表示整合質(zhì)粒pCD62-1和pCD62-2的構(gòu)建過程，這兩質(zhì)粒允許ADR表達(dá)盒插入到leu 2基因和Spl1δ基因的基因間隔區(qū)。MCS1和MCS2多克隆位點(diǎn)圖10表示CDRO1菌株的構(gòu)建方案。
圖11表示含有兩個(gè)表達(dá)盒ADX和P450SCC的PCD63表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建過程。
圖12表示對(duì)甾醇的GC進(jìn)行的分析，所述甾醇是從用半乳糖誘導(dǎo)9小時(shí)(圖12a)或24小時(shí)(圖12b)之后的EC01/PCD63菌株分離到的細(xì)胞(細(xì)胞裂解液)或培養(yǎng)基(介質(zhì))提取的。
圖13表示pTG7457質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。
圖14表示pTG7453質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。
圖15表示pTG10014質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。
圖16表示pTG10004質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。
圖17表示pTG10031質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。
圖18表示pTG10033質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。
下列實(shí)施例是用于描述發(fā)明而不是用于限制。
實(shí)施例1編碼A.thaliana的δ-5，7甾醇，δ-7還原酶(δ-7Red)的CDNA的克隆A.-在酵母中篩選A.thaliana表達(dá)文庫起始cDNA表達(dá)文庫是由M.Minet等人(Plant J.，2，417-422，1992)描述的文庫，該文庫是從二片子葉發(fā)芽期的A.thaliana的mRNA制備的，并且其兩為Not I位點(diǎn)的CDNA已被插入到穿梭載體大腸桿菌/釀酒酵母PFL61的表達(dá)盒的Bst XI位點(diǎn)。該表達(dá)盒含有磷酸甘油酸激酶基因(PGK)的啟動(dòng)子和終止序列。酵母的復(fù)制原點(diǎn)來源于2u序列，并且有一個(gè)選擇指示信號(hào)URA3保證載體在酵母中繁殖。該載體在大腸桿菌中繁殖是源自于pUC19質(zhì)粒。
利用由D.Gietz等人描述的乙酸鋰方法(Nucleic Acids Res.，20，1425，1992)由CDNA文庫轉(zhuǎn)化FY1679酵母菌株(Mata)，該菌株是由A，Thierry等人描述的S288C菌株的等基因菌株(Yeast，6，521-534，1990)。
在含有7克/升的″酵母氮源″(Difco)，1克/升的細(xì)菌酪蛋白氨基酸(Difco)，20克/升葡萄糖，20mg/升的色氨酸并且不含尿嘧啶的SGI合成培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)細(xì)胞。然后將獲得的105個(gè)尿嘧啶原養(yǎng)型轉(zhuǎn)化體分組并在相同的無尿嘧啶并含有2或5μg/ml制霉菌素的合成培養(yǎng)基平板上以每平皿5×104個(gè)細(xì)胞的比例進(jìn)行培養(yǎng)。以這種方式對(duì)每個(gè)制霉菌素濃度篩查106個(gè)轉(zhuǎn)化體。在28℃培養(yǎng)3天之后，以5個(gè)克隆為一組收集大約100個(gè)在2μg/ml制霉菌素濃度生長(zhǎng)的克隆，采用反相高效液相色譜(在下文中稱為RP-HPLC)分析這些克隆的甾醇組分，而在濃度為5μg/ml的制霉菌素時(shí)獲得了稱為F22的單個(gè)抗性克隆。
B.-分析在F22克隆中積累的甾醇根據(jù)L.Parks等人描述的堿性皂化方法(Methods in Enzymol，111，333-346，1985)制備酵母的總甾醇，然后采用RP-HPLC和/或采用氣相色譜(稱為GC)進(jìn)行分析。
將獲得的甾醇?xì)埢苡谝掖?四氫呋喃-水混合物(65∶10∶25V/V)中，然后采用RP-HPLC方法在Applied Biosysterns C18鍵合的二氧化硅柱(100×2.1mm)上以1ml/分鐘的流速以及在55℃和利用溶于水中的甲醇的線性梯度(50％-100％，經(jīng)18分鐘)對(duì)此混合物進(jìn)行分析，在205nm和285nm處檢測(cè)光密度值，并與麥角甾醇，油菜甾醇和膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行比較。
在Alltech SE-30毛細(xì)管柱(30m×0.32mm)上用氦作為載體氣體，對(duì)于注射器和檢測(cè)器溫度分別為280℃和310℃，在起始時(shí)溫度從110℃增加到245℃時(shí)增加速度為45℃/分鐘，然后增加速度為3℃/分鐘以至達(dá)到280℃，再對(duì)甾醇組合物的GC進(jìn)行分析。
根據(jù)RP-HPLC分析(圖1A)以及根據(jù)GC分析(圖1B)顯示了上面獲得的F22克隆中積累甾醇的概況，其特征為在非轉(zhuǎn)化菌株FY1679中的主要甾醇麥角甾醇實(shí)質(zhì)上完全消失，并由兩種主要甾醇以相同的量取代，它們?cè)?85nm處沒有吸收峰，因而根據(jù)RP-HPLC分析，獲得的甾醇不再具有共軛的雙不飽和鍵。
在圖1A中，油菜甾醇(Sigma)(24-R-麥角甾-5-烯-3-醇)含有大約35％的二氫蕓苔屬甾醇(24-S-麥角甾5-烯-3-醇)。
C-δ-7Red CDNA的克隆根據(jù)J.N.Strathern等人描述的方法(Methods in Enzymol.，194，319-329，1991)，在大腸桿菌中擴(kuò)增源自于F22克隆的質(zhì)粒，然后用Not I進(jìn)行消化。獲得約600堿基對(duì)(bp)的片段以及1.6kbp的片段。分別用上面各個(gè)片段轉(zhuǎn)化FY1679菌株。按照上面指示的方法對(duì)轉(zhuǎn)化酵母的各個(gè)克隆的甾醇的組分進(jìn)行分析，并且辨別出攜帶有對(duì)甾醇的修飾情況起作用的基因的質(zhì)粒。以這種方式鑒別出的質(zhì)粒稱為PF22。
D-δ-7Red的CDNA序列的測(cè)定將pF22的CDNA插入物再克隆到來源于PUC9(pharmacia)的PUC9N載體的Not I位點(diǎn)，該載體中多克隆位點(diǎn)中的EcoRI位點(diǎn)被插入的Not I限制性位點(diǎn)所替代，但保留了Lacz基因的閱讀框架。然后測(cè)出限制性圖譜(圖2)。
將分別含有Not I外來位點(diǎn)以及EcoRI，Pvu II或Hind III內(nèi)源位點(diǎn)的限制性片段亞克隆到pBluescript質(zhì)粒(Stratagene)上。利用PBluescript PUC9，T3和T7的直接和反向引物或者推導(dǎo)出的CDNA核苷酸序列的特異引物，根據(jù)Sanger方法以及DNA聚合酶測(cè)序酶(Stratagene藥盒)，在兩條鏈上測(cè)定核苷酸序列。
所獲得所有序列匯編代表A.thaliana的δ-7Red CDNA核苷酸序列(SEQ ID NO.1)，其序列列于圖3中。該序列含有1496個(gè)核苷酸，其末端含有一個(gè)多聚腺苷酸序列。該序列有一個(gè)開放式閱讀框架，該框架起始于第76核苷酸的甲硫氨酸起始密碼子，結(jié)束于第1366位核苷酸的終止密碼子。這樣該開放式閱讀框架具有1290個(gè)核苷酸，編碼含有430個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。編碼δ-7Red蛋白質(zhì)的δ-7Red CDNA的編碼區(qū)，及其推測(cè)出的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)顯示于圖3中。該蛋白質(zhì)序列包括430個(gè)氨基酸胺，它具有計(jì)算出的分子質(zhì)量為49.286KDa。
含有位于載體PUC9N中的δ-7Red CDNA(命名為δ7Red/PUC9N CDNA)的大腸桿菌DH5-1菌株的樣本于1995年2月10日寄存于CNCM，寄存號(hào)為I-1535。
E-共有序列SEQ ID NO.3的測(cè)定利用序列數(shù)據(jù)庫(Genbank和EMBL)進(jìn)行計(jì)算機(jī)檢索，已經(jīng)證明A.thaliana的δ-7Red蛋白質(zhì)的序列與其他甾醇還原酶具有某些序列相似性，尤其是與由R.T.Lorentz等人(DNA Ceu Biol.，11，685-692，1992)以及W.Chen等人(Yeast，7，305-308，1991)分別描述的釀酒酵母的甾醇C-14還原酶以及甾醇C-24(28)還原酶，以及由M.Shimanuki等人(Mol.Biol，Cell，3，263-273，1992)描述的S.Pombe的sts 1+基因的產(chǎn)物以及Neurospora crassa的甾醇C-14還原酶(在EMBL數(shù)據(jù)庫中為NO.X77955)。另外，δ-7Red蛋白質(zhì)與由H.J.Worman等人(J.Cell Biol.，111，1535-1542，1990)以及E.Schuler等人(J.Biol.Chem.，269，11312-11317，1994)描述的雞野芝麻花堿B受體的C末端的400個(gè)氨基酸以及人受體的相應(yīng)區(qū)域都具有相似性。
在由上面獲得的δ-7Red cDNA推導(dǎo)出的SEQ ID NO.2氨基酸序列和三個(gè)酵母甾醇還原酶以及兩個(gè)野芝麻花堿B受體的氨基酸序列進(jìn)行序列等同性排列，然后為了制備寡核苷酸，定義了一個(gè)具有下列氨基酸序列的新的共有序列(SEQ ID NO.3)Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa15 10Tyr15其中第7位上的Xaa是Trp或Tyr以及第12位上的Xaa是His或者Lys，所制備的寡核苷酸可在PCR中用作為引物用于擴(kuò)增編碼具δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)的新的基因組DNA或cDNA序列。
F-δ-7Red蛋白質(zhì)在酵母中的表達(dá)a)在酵母中構(gòu)建誘導(dǎo)型表達(dá)載體δ-7/V8利用下面特定寡核苷酸通過PCR擴(kuò)增將PF22的CDNA的非編碼區(qū)缺失5′CGCGGATCCA TGGCGGAGAC TGTACATTC 3′(SEQ ID No.4)和5′CAGGGTACCT CAATAAATTC CCGGAATG 3′(SEQ ID No.5)定義這些寡核苷酸是為了在緊接起始密碼子的上游導(dǎo)入一個(gè)BamHI限制性位點(diǎn)，并且在緊挨終止密碼子的下游導(dǎo)入一個(gè)Kpn I位點(diǎn)。
在2個(gè)單位的Pfu DNA聚合酶以及0.2μM的每個(gè)上述各種引物。存在下，利用下面擴(kuò)增條件94℃，10秒；52℃，50秒；74℃，90秒；從1ng的″δ-7Red/pUC9N cDNA″質(zhì)粒開始將該cDNA用Stratagene PCR藥盒擴(kuò)增33個(gè)循環(huán)。
結(jié)果獲得了約1300bp的片段，然后用限制性酶BamHI和Kpn I進(jìn)行消化并插入到C.Cullin等人(Gene，65，203-217，1988)描述的大腸桿菌/釀酒酵母pYeDP1/8-2穿梭載體(稱為V8)的BamHI和Kpn I位點(diǎn)。V8攜帶了選擇性指示劑URA3并且含有適用于酵母的表達(dá)盒，該表達(dá)盒含有啟動(dòng)子GAL10/CYC1以及PGK基因的終止序列。由此獲得的載體稱為δ-7/V8，該載體可在半乳糖誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)δ-7Red蛋白質(zhì)。
b)δ-7Red蛋白質(zhì)的生產(chǎn)采用D.Gietz等人描述的乙酸鋰方法(已經(jīng)引述過)用上述得到的δ-7/V8質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株FY1679(Mata)。
在上面描述的SGI選擇性培養(yǎng)基(但是其中葡萄糖濃度為5克/升)上，于27℃將轉(zhuǎn)化酵母進(jìn)行培養(yǎng)，直到獲得細(xì)胞密度達(dá)飽和(oD600nm＝12)。然后通過加入1倍體積的完全培養(yǎng)基YP(酵母提取物10克/升(Difco)并且細(xì)菌用蛋白胨(Difco)10克/升)，然后加入作為碳源的乙醇(1.5％V/V)而將該培養(yǎng)物稀釋，當(dāng)生長(zhǎng)至細(xì)胞濃度至少為7×107個(gè)細(xì)胞/ml時(shí)，加入濃度為20克/升的半乳糖而誘導(dǎo)δ-7Red的表達(dá)。
在SLI選擇性基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至細(xì)胞濃度為2×107個(gè)細(xì)胞/ml時(shí)也可以實(shí)施誘導(dǎo)，該SLI培養(yǎng)基相當(dāng)于SGI培養(yǎng)基，但其中由半乳糖(20克/升)取代葡萄糖。
c)δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的體外酶促檢測(cè)利用M.Taton等人描述的酶促檢測(cè)法(Biochem.Bioph.Res.Commun，181，465-473，1991)但沒有利用NADPH再生系統(tǒng)，而是用上面描述的被誘導(dǎo)酵母的微粒體或胞液細(xì)胞制劑可以證明δ-7Red蛋白質(zhì)的表達(dá)。
將被誘導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械破碎可以獲得細(xì)胞的各個(gè)組分，并且采用由P.Urban等人描述的方法(Eur.J.Biochem.222，843-850，1994)進(jìn)行超離心將各個(gè)部分分離。收集細(xì)胞，然后用TE-Kcl緩沖液(50mM Tris-Hcl，pH7.4；1mM EDTA，0.1MKcl)洗滌兩次，并且重懸于0.6MTE-山梨醇裂解緩沖液中。加入直徑為0.45-0.5mm(Braun)的玻璃珠，直到顯示玻璃珠穿過細(xì)胞懸液表面，然后在4℃攪拌5分鐘。將表面的細(xì)胞裂解液集合在一起，用裂解緩沖液將玻璃珠洗三次。將裂解液和洗液混合，然后在4℃以20,000g離心13分鐘，以便去除線粒體部分。將收集到的上清液于4℃以100,000g離心1小時(shí)。單獨(dú)收集含有微粒體部分的團(tuán)丸以及代表胞質(zhì)部分的上清液。
將由此獲得的微粒體部分或胞質(zhì)部分分別在100mM Tris/Hcl緩沖液，pH7.3，37℃，以及在2mM NADPH存在下保溫90分鐘，所述緩沖液含有用吐溫-80(1.5g/l)乳化的150μm的7-脫氫膽固醇作為底物。通過加入3倍體積的甲醇-二氯甲烷混合物(50∶50，V/V)提取甾醇，然后與標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物進(jìn)行GC比較分析。
由上述FY1679酵母獲得的微粒體部分(3.5mg/ml蛋白質(zhì))將7-脫氫膽固醇(RT-16.528分鐘)轉(zhuǎn)化成的膽固醇(RT＝15.887分鐘)顯示于圖4中，所述FY1679酵母已用δ-7/V8載體轉(zhuǎn)化并且被誘導(dǎo)了3小時(shí)，其內(nèi)源甾醇具有較高的滯留時(shí)間(對(duì)于麥角甾5-22二烯3-醇其RT＝16.682；對(duì)于麥角甾醇其RT＝17.249分鐘并且對(duì)于麥角甾5-烯3-醇其RT＝17.664分鐘)。
這些結(jié)果證明該轉(zhuǎn)化酵母一方面表達(dá)δ-7Red蛋白質(zhì)，另一方面具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性。
實(shí)施例2在C-7位不飽和的酵母的內(nèi)源性甾醇的體內(nèi)還原用實(shí)施例1中獲得的δ-7/V8載體轉(zhuǎn)化酵母菌株，該菌株的主要甾醇在C-5，7位上具有一個(gè)雙鍵，然后按實(shí)施例1所述將該菌株培養(yǎng)并誘導(dǎo)。提取內(nèi)源甾醇，分析其GC概況，并按實(shí)施例1所述，利用制備性C18柱(100×4.6mm)采用RP-HPLC進(jìn)行純化，然后根據(jù)IR，UV，MS和NMR進(jìn)行鑒別。分別使用下面三個(gè)菌株-實(shí)施例1中描述的FY1679菌株；-突變菌株erg5，稱為PLC1051，其特征在于缺失了甾醇C-22去飽和酶，通過FY1679菌株和S.W.Molzahn等人描述的原始菌株pol5(J.Gen.Microbiol.，72，339-348，1972)之間進(jìn)行雜交可以構(gòu)建該菌株，該菌株積累麥角甾5，7-二烯3-醇。
-雙重突變菌株erg4，5，稱為PLC1451，其特征在于缺失甾醇C-22去飽和酶(erg5)以及甾醇C-24(28)還原酶(erg4)，通過將FY1679菌株與由S.W.Molzahn等人(已經(jīng)引證)描述pol5菌株進(jìn)行雜交可獲得該突變菌株，其中pol5菌株在系統(tǒng)篩查用于研究甾醇突變體的酵母的過程中獲得了自發(fā)的對(duì)制霉菌素的抗性，所述雙突變菌株積累麥角甾5，7，24(28)三烯3-醇。得到的單倍體菌株攜帶雙突變erg4，erg5，它能在半乳糖和一種不能發(fā)酵的底物存在下生長(zhǎng)，并且是尿嘧啶，色氨酸和組氨酸營養(yǎng)缺陷型。菌株P(guān)LC1051和PLC1451已于1995年2月10日寄存于CNCM，分別得到保存號(hào)為I-1536和I-1537。
下表中列出了分別從上述三個(gè)轉(zhuǎn)化菌株鑒別出的主要被還原甾醇起始菌株起始主要在C-7位被還原內(nèi)源甾醇的主要內(nèi)源甾醇- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -FY1679 麥角甾5，7，22三烯 麥角甾5-烯3-醇3-醇(麥角甾醇) (二氫油菜甾醇)麥角甾5，22二烯3-醇(油菜甾醇)erg5麥角甾5，7二烯3-醇 麥角甾5-烯3-醇PLC1051erg4，5 麥角甾5，7，24(28) 麥角甾5，24(28)二烯3-醇PLC1451 三烯-3-醇 (牡蠣甾醇)實(shí)施例3將在第C-7位上被還原的酵母內(nèi)源甾醇進(jìn)行限制而體外制備孕甾烯酮醇利用Wada等人描述(Arch.Biochem.Biophys.，290，376-380，1991)的膽固醇側(cè)鏈的體外酶促限制檢測(cè)而制備孕甾烯酮醇，在該過程中，根據(jù)D.W.Seybert等人，J.Biol.Chem.，254，12088-12098，1979的描述在140nM腎上腺皮質(zhì)激素還原酶，1.16μM腎上腺皮質(zhì)激素和0.68μM來源于牛腎上腺的細(xì)胞色素P450SCC存在下，在150μl的10mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4，100mM NaCl，0.3％吐溫20中將實(shí)施例2中獲得的在C-7位上被還原的甾醇260μM保溫。
通過加入150μM的NADPH而激發(fā)反應(yīng)。在37℃保溫80分鐘之后，加入1倍體積的甲醇-二氯甲烷混合物(50∶50V/V)而終止反應(yīng)。按實(shí)施例1所述提取甾醇并分析GC。
圖5分別證明麥角甾5-烯3-醇(圖5A)，麥角甾5，24(28)二烯3-醇(圖5B)或者麥角甾5，22二烯3-醇(圖5C)是細(xì)胞色素P450SCC的底物并且產(chǎn)生一種產(chǎn)物，該產(chǎn)物，與同樣條件下限制膽固醇獲得的孕甾烯醇酮具有同樣的RT。
所得結(jié)果顯示能表達(dá)δ-7Red的轉(zhuǎn)化酵母積累可直接用于通過體外生物氧化而制備孕甾烯酮醇的甾醇。
實(shí)施例4體內(nèi)生產(chǎn)孕甾烯酮醇或其乙酸酯的酵母菌株的構(gòu)建A-含有A.thaliana的δ-7Red的表達(dá)盒的ELR01菌株的構(gòu)建，所述表達(dá)盒整合于單倍體菌株FY1679交配型a(FY1679 Mata)的ADE2位點(diǎn)a)整合性質(zhì)粒PADδ-7(PAD△7)的構(gòu)建質(zhì)粒pAD△7的構(gòu)建是按照?qǐng)D6描述完成的。從pASZ11質(zhì)粒(A.Stotz等人，Gene，95，91，1990)中分離含有釀酒酵母的ADE2基因的Bgl II片段(2244bp)并將該片段插入到pBluescript II KS+載體(Stratagene)的多克隆位點(diǎn)的BamHI位點(diǎn)。
得到的質(zhì)粒稱為pBS-ADE2，然后在其單一的Stu I位點(diǎn)將該質(zhì)粒線性化并且脫磷酸化。根據(jù)PCR技術(shù)，利用下列寡核苷酸作為引物5′GATTACGCCA AGCTTTTCGA AAC 3′ (SEQ ID NO.6)5′AGATCTTGAG AAGATGCGGC CAGCAAAAC 3′(SEQ ID NO.7)從實(shí)施例1F獲得的質(zhì)粒δ-7/V8制備大約2.44Kb的片段，該片段含有GAL10/CYC1啟動(dòng)子，δ-7Red的編碼區(qū)(甾醇7還原酶)以及終止子PGK(tPGK)，所述寡核苷酸引物被限定為分別與tPGK的3′末端以及與URA3基因的3′末端相匹配。使用下列物質(zhì)作為模板的δ-7/V8質(zhì)粒(80ng)，上述寡核苷酸(各為0.5μM)，天然的Pfu DNA聚合酶(溶于由Stratagene推薦的緩沖液中的1個(gè)單位)以及使用了下列擴(kuò)增條件35個(gè)周期縮環(huán)在95℃1分鐘；在95℃ 5秒；在56℃30秒鐘；在70℃4分鐘30秒)。然后將獲得的擴(kuò)增片段克隆到上面線性化的pBS-ADE2質(zhì)粒的平齊末端以便得到pAD△7質(zhì)粒，該質(zhì)粒中大約有4720bp的NotI-Pst I片段攜帶有被δ-7Red表達(dá)盒間斷的ADE2基因。
b)酵母菌株FY1679 Mata中的染色體整合從pAD△7質(zhì)粒分離到的Not I-Pst I片段(4720bp)用限制性酶Not I和Pst I消化，然后利用D.Gietz等人描述(已經(jīng)引述過)乙酸鋰方法通過轉(zhuǎn)化將消化后的片段導(dǎo)入到FY1679 Mata酵母中。
根據(jù)其對(duì)制霉菌素的抗性，及其表型，選擇出由于同源重組而已經(jīng)整合了該片段的轉(zhuǎn)化體，由于δ-7Red的表達(dá)而將酵母的δ-5，7甾醇轉(zhuǎn)化為δ-5甾醇產(chǎn)生其表型。
在實(shí)施例1F描述的含有葡萄糖(20克/升)并補(bǔ)充了腺嘌呤(20mg/l)的YP完全培養(yǎng)基上28℃將轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)。然后將細(xì)胞濃縮并涂布于SLI-瓊脂基本培養(yǎng)基(細(xì)菌用酪蛋白氨基酸1克/升；″酵母氮源″7克/升；半乳糖20克/升；腺嘌呤20mg/升，瓊脂20克/升)平板上，在28℃培養(yǎng)過夜以便誘導(dǎo)δ-7Red基因的表達(dá)。沒有尿嘧啶互補(bǔ)作用使細(xì)胞生長(zhǎng)受限制，收集克隆，分組然后涂布于含有YP完全培養(yǎng)基的平板上，該YP完全培養(yǎng)基含有半乳糖(20克/升)并補(bǔ)充了腺嘌呤(20mg/升)以及濃度逐漸增高的制霉菌素(分別0μg/ml，1μg/ml，2μg/ml，5μg/ml，20μg/ml)。在第4天，獲得了在5μg/ml濃度時(shí)能生長(zhǎng)的約二十個(gè)克隆。在裝有WO基本培養(yǎng)基(7克/升″酵母氮源″，沒有氨基酸，20克/升葡萄糖)的平皿中再培養(yǎng)這十二個(gè)克隆，該WO培養(yǎng)基富含尿嘧啶，亮氨酸，色氨酸，組氨酸和腺嘌呤(各為20mg/升)。
然后通過在上面描述的富含尿嘧啶，殼氨酸，色氨酸，組氨酸，沒有腺嘌呤的WO基本培養(yǎng)基上沒有觀察到有任何生長(zhǎng)而證實(shí)由于破壞了ADE2基因而成為腺嘌呤營養(yǎng)缺陷型。
通過從獲得的克隆的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并且利用具有上述的SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7的序列作為引物可以控制酵母基因組中表達(dá)盒的存在。
通過對(duì)酵母中積累并且采用一個(gè)5米SE30毛細(xì)管柱(Alltech)根據(jù)實(shí)驗(yàn)例1B描述的操作方法進(jìn)行堿性皂化作用提取到的甾醇的GC組分分析而證實(shí)整合人的δ-7Red基因的功能。分析結(jié)果顯示當(dāng)在半乳糖存在下培養(yǎng)該克隆時(shí)顯示有含有第C-7位上不飽和的甾醇的改良過的分布概況。所獲得的稱為ELR01的菌株積累了麥角甾5烯3-醇和麥角甾5，22二烯3-醇而不是麥角甾5，7，22三烯3-醇(麥角甾醇)，如圖7所示，被替代的麥角甾醇是起始菌株FY1679的主要甾醇。
由此方式構(gòu)建的ELR01菌株在半乳糖存在下培養(yǎng)時(shí)，由于轉(zhuǎn)錄受啟動(dòng)子GAL 10/CYC1控制這一事實(shí)，因而能表達(dá)δ-7Red基因。雖然δ-7Red的表達(dá)單位具有相同于ADE2基因的轉(zhuǎn)錄方向，但是當(dāng)在半乳糖存在下培養(yǎng)時(shí)通過對(duì)甾醇的GC組分進(jìn)行分析沒有檢測(cè)到δ-7Red的表達(dá)，這是由于啟動(dòng)子GAL10/CYC1的阻遏作用造成的。B-含有牛腎上腺皮質(zhì)激素還原酶(ADRm)的成熟形式的表達(dá)盒的CDR01菌株的構(gòu)建，所述表達(dá)盒整合到單倍體菌株FY1679交配型α(mat.α)的LEU2和SPL1位點(diǎn)之間
a)穿梭載體大腸桿菌-釀酒酵母V13的構(gòu)建V13載體相當(dāng)于V8載體(C.Cullin等人，已經(jīng)引述過)，該載體攜帶選擇性標(biāo)記URA3和適用于酵母的含有GAL10/CYC1啟動(dòng)子的表達(dá)盒(PG/C)并且在該載體中根據(jù)圖8顯示的構(gòu)建示意圖，在其多克隆位點(diǎn)已經(jīng)導(dǎo)入了另一個(gè)SalI位點(diǎn)(Sa)。
用限制性酶Hind III和BamHI消化V8載體，并將獲得的含有URA3基因和GAL10/CYC1啟動(dòng)子(稱為進(jìn)一步根據(jù)Ura-gal)的BamHI-HindIII片段亞克隆到用限制性酶Hind III和BamHI消化的PUC18載體(pharmacia)的相應(yīng)位點(diǎn)。
然后采用PCR方法，利用下列條件30次循環(huán)；在86℃，5秒鐘；在95℃，10秒；在38℃，40秒；在55℃，5秒以及在74℃，2分鐘，溶于制造商的緩沖液中的2個(gè)單位的Taq DNA聚合酶以及具有下列核苷酸序列的各種引物各1μM5′GGGGATCCGT GGTCGACGTA ATTTAGTGTG TGTATTTGTG TTTGCG 3′(SEQ ID NO.8)和5′GTAAAACGAC GGCCAGT 3′ (SEQ ID NO.9)從上述獲得的在95℃退化30秒的30ng PUC 18/″ura-gal″質(zhì)粒擴(kuò)增″Ura-gal″片段。引物SEQ ID No.8含有相同于″Ura-gal″片段的Bam HIGGATCC位點(diǎn)，在Bam HI位點(diǎn)有3個(gè)連續(xù)的核苷酸不與模板雜交，還含有一個(gè)SalI GTCGAC位點(diǎn)以及一個(gè)與GAL10/CYC1啟動(dòng)子同源的序列。引物XEQ ID NO.9與位于多克隆位點(diǎn)PUC18的Hind III位點(diǎn)前面的序列相匹配。在擴(kuò)增之后獲得的1722bp的Hind III-BamHI片段用Xho I和BamHI進(jìn)行消化，釋放出含有GAL10/CYC1啟動(dòng)子(pG/c)的一個(gè)254bp片段，然后將該片段亞克隆到用限制性酶BamHI和XhoI消化的V8載體中。
最后得到的V13載體含有限制性位點(diǎn)，允許編碼成熟牛腎上腺皮質(zhì)激素還原酶(ADRm)，成熟牛腎上腺皮質(zhì)激素(ADXm)以及牛細(xì)胞色素P450SCC的CDNA容易地進(jìn)行亞克隆。
在下列方式中從V13載體開始，分別制備V13-ADR載體和V13-ADX載體和V13-SCC10載體a)V13-ADR載體的構(gòu)建從EP.340878的實(shí)施例25中描述的pGBADR-2質(zhì)粒分離攜帶有編碼ADRm的cDNA的1478bp的SalI-KpnI片段并且再克隆到V13載體的相應(yīng)位點(diǎn)得到V13-ADR載體。
b)V13-ADX載體的構(gòu)建從歐洲專利申請(qǐng)EP340878的實(shí)施例23中描述的PGBADX-1質(zhì)粒分離攜帶有編碼ADXm的CDNA的390bp的SalI-BamHI片段并且再克隆到V13載體的相應(yīng)位點(diǎn)得到V13-ADX載體。
c)V13-SCC10載體的構(gòu)建從歐洲專利申請(qǐng)EP 340878的實(shí)施例6描述的pGBSCC-10質(zhì)粒分離攜帶了編碼P450SCC的CDNA的1554bp的SalI-EcoRI片段并且再克隆到V13載體的相應(yīng)位點(diǎn)得到V13-SCC10載體。
b)整合性質(zhì)粒pCD62-1和pCD62-2的構(gòu)建質(zhì)粒pCD62-1和pCD62-2的構(gòu)建按圖9描述來完成。
a)質(zhì)粒pFL26CD的構(gòu)建根據(jù)下列操作方法，在從splI基因(稱為spl1)的5′末端隔離開的leu2基因的基因間隔區(qū)(C.Kolman等人，J.Bacteriol.，175，1433，1993)將Not I位點(diǎn)導(dǎo)入到pFL26質(zhì)粒(N.Bonneaud等人，Yeast，7，609-615，1991)利用具有下列核苷酸序列5′TTGAAGGTTC AACATCAATT GATTG 3′(SEQ ID NO.10)5′GTGTGGCGGC CGCCTCCTTG TCAATATTAA TGTTAAAG 3′(SEQ IDNO.11)(用于擴(kuò)增704bp片段)以及核苷酸序列5′CAAGGAGGCG GCCGCCACAC AAAAAGTTAG GTGT 3′(SEQ ID NO.12)5′TCTGCTTCCC TAGAACCTTC TTATG 3′ (SEQ ID NO.13)(用于擴(kuò)增347bp片段)的引物進(jìn)行PCR合成分別攜帶leu2的5′末端和Spl1的3′末端的704bp和347bp的兩個(gè)DNA片段。
引物SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12具有一個(gè)GGCGGCCG序列，該序列對(duì)應(yīng)于NotI位點(diǎn)并且該序列中3個(gè)堿基與模板不相配。引物SEQ ID NO.10與定位于Leu2終止密碼子上游536bp處的一個(gè)序列相匹配，并且引物SEQ ID NO.13與定位于Spl 1△終止密碼子上游194bp處的一個(gè)序列相匹配。
利用PFL26質(zhì)粒作為模板，pfu DNA聚合酶作為酶，在由供應(yīng)商(Stratagene)描述的標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行pCR首先擴(kuò)增704bp和347bp片段。
所獲得的兩個(gè)擴(kuò)增片段與由SEQ ID NO.11引物(704bp片段)和SEQ ID NO.12引物(347bp片段)從5′末端起始產(chǎn)生末端水平的20bp相匹配；這些20bp分別對(duì)應(yīng)于每種引物的開始20個(gè)核苷酸。
利用SEQ ID NO.10引物和SEQ ID NO.13引物以及下列條件30次循環(huán)，包括95℃10秒，60℃5秒，45℃，1分鐘，65℃5秒，以及72℃2分鐘，隨后一個(gè)循環(huán)在72℃，7分鐘；各種引物各50pmol，以及1個(gè)單位的pfu DNA聚合酶，都溶于50μl反應(yīng)緩沖液(Stratagene)中，對(duì)由704bp DNA片段(1ng)和347bp DNA片段(2ng)進(jìn)行配對(duì)得到的產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。獲得了含有一個(gè)Not限制性位點(diǎn)的1031bp的擴(kuò)增片段。然后用BstXI和NsiI酶消化該片段，將獲得的含有Not I位點(diǎn)的920bp片段插入到pFL26的起始BstXI-NsiI片段的位置，得到質(zhì)粒pFL26CD，其圖譜描述于圖9a中。
b)pCD60質(zhì)粒的構(gòu)建-pDP10036質(zhì)粒的制備從質(zhì)粒V13-ADX中分離出攜帶有編碼成熟牛腎上腺皮質(zhì)激素(ADXm)的CDNA的390bp SalI-BamHI片段，然后亞克隆于pTG10033質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)的SalI-Bgl II位點(diǎn)，該pTG10033質(zhì)粒的兩側(cè)是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GAL10/CYC1以及終止子ter PGK。根據(jù)下文中進(jìn)一步描述的操作方法可以制備pTG10033質(zhì)粒，其圖譜描述于圖18中，它相當(dāng)于表達(dá)載體pTG10031(圖17)，含有啟動(dòng)子CYC1和terPGK，其中啟動(dòng)子CYC1已被啟動(dòng)子GAL10/CYC1替代。
由此獲得的質(zhì)粒稱為pDP10034，它攜帶ADX表達(dá)盒，即處于GAL10/CYC1和terPGK轉(zhuǎn)錄控制下的編碼ADXm的基因。隨后，將術(shù)語″表達(dá)盒″用于其轉(zhuǎn)錄依賴于GAL10/CYC1和ter PGK的任何基因。
采用限制性酶Hind III消化而從質(zhì)粒V13-ADR中分離出攜帶選擇性標(biāo)記URA3和ADR表達(dá)盒的3593bp的Hind III片段，然后將該片段插入到用限制性酶Hind III消化的pDP10034質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)。獲得的質(zhì)粒稱為pDp10036，該質(zhì)粒含有由標(biāo)記URA3使之相互隔離開的ADX和ADR表達(dá)盒(圖9b)。
-pCD60質(zhì)粒的制備
通過用限制性酶Afl III和AccI將pDp10036質(zhì)粒進(jìn)行部分消化而分離出攜帶ADR表達(dá)盒的2770bp的Afl III-AccI片段，用DNA聚合酶I的Klenow片段處理而制備平齊末端，連接后亞克隆到質(zhì)粒pBlue-Script KS+(Stratagene)的SmaI位點(diǎn)的平齊末端。在獲得的稱為PCD60的質(zhì)粒中，該ADR表達(dá)盒在NotI位點(diǎn)的任一側(cè)構(gòu)建形成，一個(gè)定位于Afl III/SmaI連接位點(diǎn)上游的209bp處并且來源于亞克隆片段，而另一個(gè)來源于pBlue-Script KS+的多克隆位點(diǎn)(MCS1)(圖9b)。
C)質(zhì)粒pCD62-1和pCD62-2的構(gòu)建采用限制性酶NotI消化質(zhì)粒pCD60，消化后分離出的2558bp的NotI片段亞克隆到pFL26CD質(zhì)粒的單一NotI位點(diǎn)。根據(jù)該片段插入的方向，獲得兩個(gè)質(zhì)粒稱為pCD62-1和pCD62-2(圖9C)。
在pCD62-1質(zhì)粒中，ADR表達(dá)盒定位于leu2基因的轉(zhuǎn)錄方向，而在pCD62-2質(zhì)粒中其方向正好相反。
保留pCD62-1質(zhì)粒，用于后來的構(gòu)建過程。
c)-酵母菌株FY1679(Matalpha)的染色體整合pCD62-1質(zhì)粒含有與FY1679菌株的染色體上位點(diǎn)同源的區(qū)域。這些區(qū)域分別對(duì)應(yīng)于圖10中描述的1060bp的Bgl II-ClaI片段(A)，707bp的EcoRI-NotI片段(B)以及602bp的Nat I-Bgl II片段。
在FY1679菌株中缺失對(duì)應(yīng)于pCD62-1質(zhì)粒的486bp的ClaI-EcoRI片段的區(qū)域，暗示著該菌株實(shí)際上是亮氨酸營養(yǎng)缺陷型(LEU2菌株)(R.S.Sikorski等人，Genetics，122，19，1989)。
通過用限制性酶XbaI消化而將pCD62-1質(zhì)粒線性化，該質(zhì)粒的限制性位點(diǎn)定位于同源區(qū)的外面，然后利用乙酸鋰方法(D.Gietz等人，已經(jīng)引證)通過轉(zhuǎn)化將線性化質(zhì)粒導(dǎo)入到FY1679菌株(Matα)。
由于酵母具有的對(duì)DNA的細(xì)胞修復(fù)能力(″缺口修復(fù)″)以及對(duì)具有LEU2+表現(xiàn)型的重組體的選擇能力，因而在第一種情況下選擇出了兩種類型的重組子第一種類型是在片段A和B水平上發(fā)生同源重組之后獲得的，第二種類型是在片段A和C水平上發(fā)生同源重組之后獲得的。僅僅后一種重組類型除了使表現(xiàn)型LEU2+修復(fù)以外還允許ADR表達(dá)盒整合。
為了選擇第二種類型的克隆，利用上面的SEQ ID NO.10引物以及具有下列核苷酸序列的引物5′TACATTAGGT CCTTTGTAGC 3′(SEQ ID NO.14)進(jìn)行PCR篩選以便證實(shí)在FY1679菌株(Matα)基因組中既存在ADR表達(dá)盒又使ADR表達(dá)盒有正確定位。
在該篩選方法中，SEQ ID NO.14引物全部與編碼ADRm的序列相匹配，而SEQ ID NO.10引物與染色體上一個(gè)序列相匹配(圖10)。
利用從FY1679菌株(Matα)分離的基因組DNA(20ng)(C.Hoffman等人，Gene，57，267，1987)作為模板，以及Taq DNA聚合酶(1U，Bochringer)，各個(gè)引物各50pmol以及在供應(yīng)商描述的標(biāo)準(zhǔn)條件下30次PCR循環(huán)(在95℃，10秒，在55℃1分鐘，在72℃3分鐘)而完成擴(kuò)增反應(yīng)。
在表達(dá)盒被整合的情況下擴(kuò)增之后分離出相應(yīng)的2.9kb片段。在相反情況下，沒有檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物。
以這種公式選擇的FY1679菌株(Mataα)含有整合的ADR表達(dá)盒，將該菌株稱為CDR01。
采用對(duì)抗ADR抗體識(shí)別的蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫檢測(cè)，可以實(shí)施例1F描述的方案制備的胞質(zhì)細(xì)胞組分證明由該菌株表達(dá)了ADR。
在實(shí)施例3描述的膽固醇側(cè)鏈的體外酶限制檢測(cè)中證實(shí)了由CDR01菌株表達(dá)的ADR的功能，其中由含有100μg總蛋白的CDR01菌株的細(xì)胞的胞質(zhì)部分代替純化ADR(0.28pmol)來完成的。觀察到膽固醇轉(zhuǎn)化為孕甾烯酮醇的生物轉(zhuǎn)化速率約為25％，這相當(dāng)于用純化ADR獲得的速率。
C.-共表達(dá)A.Thaliana的δ-7Red和ADRm的二倍體EC01菌株的構(gòu)建根據(jù)G.Sprague等人描述的方案(Methods in Enzymology，194，77，1991)將單倍體菌株CDR01和上文中獲得的ELR01菌株雜交獲得了二倍體菌株EC01。
首先在前面描述的富含尿嘧啶，色氨酸和組氨酸(各20mg/l)但沒有亮氨酸的WO基本培養(yǎng)基上進(jìn)行第一次選擇以便分離出二倍體LEU2+克隆(原養(yǎng)型特性，證明存在有ADR表達(dá)盒)。然后在前面描述的固體合成SLI瓊脂培養(yǎng)基上檢測(cè)這些克隆對(duì)5μg/ml的制霉菌素的抗性(抗性特征，證明存在有δ-7Red表達(dá)盒)。
以這種方式從對(duì)制霉菌素具抗性的克隆中任意地分離出一個(gè)菌株稱為EC01。
D-產(chǎn)生孕甾烯醇酮和孕甾烯醇酮-3-乙酸的EC01/pCD63菌株構(gòu)建a)表達(dá)質(zhì)粒pCD63的構(gòu)建按照?qǐng)D11描述完成pCD63質(zhì)粒的構(gòu)建。
利用限制性酶Not I從前面制備的質(zhì)粒pDP10036中分離含有ADX表達(dá)盒，選擇性標(biāo)記URA3和ADR表達(dá)盒的4961bp的NotI片段并用限制性酶NotI消化，然后將該片段克隆到pFL45L質(zhì)粒(N.Bonneaud等人，Yeast，7，609，1991)的多克隆位點(diǎn)的Not I位點(diǎn)。由此獲得的載體稱為pDP10037，描述于圖11中。
一方面，用酶Tth111I消化而將質(zhì)粒pDP10037線性化，該質(zhì)粒的限制性位點(diǎn)定位于編碼ADRm的基因內(nèi)。
另一方面，將前面獲得的V13-SCC10質(zhì)粒用限制性酶Pvu II和EcoRV消化，純化出含有P450SCC的表達(dá)盒以及URA3標(biāo)記物的5′末端的3476bp的PvuII-EcoRV片段。
分別得到的兩個(gè)線性化DNA具有同源區(qū)域，一方面該區(qū)域與URA3基因的5′末端以及GAL10/CYC1相對(duì)應(yīng)，另一方面對(duì)應(yīng)于terPGK，如圖11a描述。
然后利用乙酸鋰方法(D.Gietz等人，已經(jīng)引述過)通過共轉(zhuǎn)化將這兩個(gè)片段導(dǎo)入酵母菌株FY1679(Mata)中。
下面介紹的選擇尿嘧啶和色氨酸(URA3+，RTP1+)的原養(yǎng)型重組子的方法可以分離這樣的克隆，其中由于通過同源重組整合了表達(dá)盒P450SCC而將由限制性酶Tth111I消化產(chǎn)生的雙鏈破裂處修復(fù)。
在富含亮氨酸，組氨酸以及亮氨酸(各為20mg/l)沒有尿嘧啶和色氨酸的Wo基本培養(yǎng)基上選擇重組體(URA3+，RTP1+)。從收集到的50個(gè)克隆開始，采用C.Hoffman等人描述的方法(Gene，57，267，1987)提取總DNA，然后采用電穿孔方法導(dǎo)入到大腸桿菌XL1-藍(lán)色(Stratagene)菌株中。在含有50mg/l氨芐青霉素的豐富培養(yǎng)基LB(胰蛋白胨1％，酵母抽提物0.5％，NaCl1％)選擇由″缺口修復(fù)″產(chǎn)生的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的克隆。根據(jù)J.Sambrook等人，Molecular Cloning，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989描述的方法從選出的克隆之一提取稱為pCD63的質(zhì)粒。所獲得的質(zhì)粒pCD63含有由選擇標(biāo)記URA3分隔開的表達(dá)盒ADX和P450SCC，如圖11b所描述的b)pCD63質(zhì)粒轉(zhuǎn)化EC01菌株根據(jù)乙酸鋰方法(D.Gietz等人，已經(jīng)引證過)通過轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒pCD63導(dǎo)入到上述獲得的EC01菌株中。然后將轉(zhuǎn)化酵母培養(yǎng)于前面描述的WO基本培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基沒有尿嘧啶，色氨酸腺嘌呤和亮氨酸，但增補(bǔ)了組氨酸(20mg/l)。
以這種方式分離稱為EC01/pCD63菌株。參考名稱為EC01/pCD63的菌株樣品已于1995年2月10日寄存于CNCM，保芷號(hào)為I-1538。
c)體內(nèi)生產(chǎn)孕甾烯醇酮和孕甾烯醇酮-3乙酸在28℃有氧條件下(130r/min)將EC01/pCD63菌株培養(yǎng)于3升Erlenmeyer中的實(shí)施例1A中描述的SGI選擇性培養(yǎng)基中直到達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)期(OD600＝12-13)，所述培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為5克/升。然后加入1倍體積的上面描述的Yp完全培養(yǎng)基稀釋該培養(yǎng)物，然后加入乙醇(0.5％V/V)作為碳源。當(dāng)達(dá)到新的穩(wěn)定生長(zhǎng)期(OD600＝12-13)時(shí)，以濃縮溶液形式(500克/升)向該培養(yǎng)物中加入半乳糖(20克/升)，以便同時(shí)誘導(dǎo)編碼ADXm，ADRm，P450SCC和δ-7Red的基因進(jìn)行表達(dá)，這些基因分別處于啟動(dòng)子GAL10/CYC1控制之下。
根據(jù)下列操作方法分別對(duì)細(xì)胞中積累的甾醇以及培養(yǎng)上清液中的甾醇進(jìn)行分析可以證明四個(gè)基因的共表達(dá)在誘導(dǎo)9個(gè)小時(shí)和24個(gè)小時(shí)之后收集50ml培養(yǎng)物樣品。將每個(gè)樣品離心(4000g，10分鐘，4℃)以便將細(xì)胞與培養(yǎng)基分離。
一方面，根據(jù)實(shí)施例1F說明的方法在玻璃珠存在下通過機(jī)械玻碎將細(xì)胞裂解。然后從由此獲得的裂解液中，通過加入1倍體積的己烷而提取細(xì)胞內(nèi)甾醇。
另一方面，通過加入1倍體積己烷直接提取培養(yǎng)基中存在的甾醇。
按照實(shí)施例1中說明的方法分析提取的甾醇GC組分，并與標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品進(jìn)行比較。
在誘導(dǎo)了9小時(shí)或24小時(shí)之后獲得的結(jié)果分別顯示于圖12a和圖12b中。
在誘導(dǎo)9小時(shí)之后，圖12a顯示-在細(xì)胞裂解液中，存在與標(biāo)準(zhǔn)孕甾烯醇酮乙酸鹽(RT＝11.8分鐘)具有同樣滯留時(shí)間的主要化合物，而在孕甾烯醇酮的滯留時(shí)間(RT＝9.9分鐘)時(shí)僅存在十分弱的峰。在RT＝18分鐘和RT＝17分鐘時(shí)分別鑒別出低量的第C-7位還原的酵母的內(nèi)源甾醇(麥角甾5-烯3-醇和麥角甾5，22二烯3-醇)。在分析之前將細(xì)胞裂解液堿性皂化導(dǎo)致存在與孕甾烯醇酮共遷移的主要化合物。這可以證實(shí)具有RT＝11.8分鐘的積累化合物相當(dāng)于乙酸孕甾烯醇酮。
-在培養(yǎng)基中，孕甾烯醇酮或其乙酸鹽明顯缺乏。
在誘導(dǎo)24小時(shí)之后，圖12b顯示-在細(xì)胞裂解液中，存在低量的孕甾烯醇酮(RT＝10.2分鐘)和乙酸孕甾烯醇酮(RT＝12分鐘)以及存在被還原的酵母內(nèi)源甾醇(RT＝17分鐘和RT＝18分鐘)。膽固醇(RT＝16.2分鐘)是一種在提取之前加入的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物。
-在培養(yǎng)基中，主要存在乙酸孕甾烯醇酮以及小量的孕甾烯醇酮。
試驗(yàn)也平行地用對(duì)照質(zhì)粒如pFL45L(已經(jīng)引述)轉(zhuǎn)化的EC01菌株進(jìn)行，該平行試驗(yàn)已經(jīng)證明沒有對(duì)應(yīng)于游離孕甾烯醇酮或乙酸鹽形式的孕甾烯醇酮的峰。
以這種方式對(duì)甾醇進(jìn)行鑒別顯示在沒有任何內(nèi)源甾醇存在下，在半乳糖存在下進(jìn)行誘導(dǎo)之后酵母菌株EC01/pCD63積累了孕甾烯醇酮和乙酸孕甾烯醇酮，并且在誘導(dǎo)9小時(shí)之后具有最大生產(chǎn)量這些結(jié)果證明一方面EC01菌株中在C-7位還原的內(nèi)源甾醇的有效變化，另一方面，內(nèi)源甾醇的側(cè)鏈的限制性反應(yīng)偶合十分有效。
整合菌株的概述表
實(shí)施例4pTG10033質(zhì)粒的構(gòu)建
1.具有新的多克隆位點(diǎn)的pUC19衍生物利用下列寡核苷酸5′GCGCTCAGCG GCCGCTTTCC AGTCG 3′SEQ ID NO.15將克隆載體M13mp19(C.Yanish-Peron等人，Gene，33，103，1985)誘變以便將NotI位點(diǎn)導(dǎo)入到被截?cái)嗟膌ac I基因的序列中得到質(zhì)粒M13TG724。
然后利用下列寡核苷酸5′AATTGCGGCC GCGTACGTAT G 3′SEQ ID NO，165′AATTCATACG TACGCGGCCG C 3′SEQ ID NO.17將含有EcoRI，SnaBI和Not I位點(diǎn)的″多接頭″導(dǎo)入到質(zhì)粒M13TG724的EcoRI位點(diǎn)，得到質(zhì)粒M13TG7244，其中在擴(kuò)增階段觀察到插入物修飾。質(zhì)粒M13TG7244的插入物具有下列核苷酸序列CAATTCATACGTACGCGGCCGCAATTGCGGCCGGTACGTATAATTCACTGGCCGT其中底下劃線部分為EcoRI，SnaBI和SstI位點(diǎn)，斜體字描寫為pUC19的lacZ基因。在用限制性酶EcoRI和SstI消化質(zhì)粒M13TG7244之后，利用下列寡核苷酸5′CAACGCGTCC TAGG3′ SEQ ID NO.18和5′AATTCCTAGG ACGCGTTGAG CT 3′ SEQ ID NO.19導(dǎo)入含有MluI和Avr II位點(diǎn)的″多接頭″。
在用酶Pvu II消化之后，將獲得的Pvu II片段亞克隆到pUc19(C.Yanish-Porch等人，已經(jīng)引述)得到質(zhì)粒pTG7457(圖13)。
2.PGK終止子的亞克隆
用限制性酶BamHI和EcoRI消化PUC19，利用下列寡核苷酸5′GATCCGCAGA TATCATCTAG ATCCCGGGTA GAT 3′ SEQ ID NO.20，5′AGAGCTCAAG ATCTACCCGG GATCTAGATG ATATCTGCG 3′SEQ ID NO.21，5′CTTGAGCTCT ACGCAGCTGG TCGACACCTA GGAG 3′SEQ ID NO.22和5′AATTCTCCTA GGTGTCGACC AGCTGCGT 3′ SEQ ID NO.23.
導(dǎo)入一個(gè)新″多接頭″BamHI SstI。
以這種方式獲得了質(zhì)粒pTG7453(圖14)，然后用限制性酶BamHI和SstI消化。將位于BamHI和SstI之間的″多接頭″位點(diǎn)導(dǎo)入到上面獲得的并用限制性酶BamHI和SstI消化的質(zhì)粒pTG7457衍生物中，由此獲得的新質(zhì)粒含有Pvu II，Hind III，BamHI，EcoRI，XbaI，SmaI，Bgl II，Sst II(＝SacI)，MluI，Avr II，EcoRI，SnaBI，NotI，SnaBI，PvuI位點(diǎn)。
用限制性酶Bgl II和Hind III消化該新質(zhì)粒并將含有PGK啟動(dòng)子的Bgl II-Hind III片段(R.A.Hitzeman等人，Nucleic Acids Res.10，7791，1982；G.Loison等人，Yeast，5，497，1989)插入到上述消化后的質(zhì)粒中得到pTG10014質(zhì)粒中(圖15)3.啟動(dòng)子的亞克隆a)CYC1啟動(dòng)子將pTG7453質(zhì)粒的BamHI和SstI之間的″多接頭″位點(diǎn)導(dǎo)入到前面所述質(zhì)粒pTG7457衍生物中。由限制性酶SnaBI將獲得的新質(zhì)粒消化，然后導(dǎo)入一個(gè)含有f1噬菌體的復(fù)制源點(diǎn)的質(zhì)粒pEMBL8的456bp的RsaI-DraI片段(L.Dente等人，Nucleic Acid Res.，11，1645，1983)，得到質(zhì)粒pTG7503。
將歐洲專利申請(qǐng)EP0340378的實(shí)施例6中制備的并且含有釀酒酵母的CYC1啟動(dòng)子，一個(gè)″多接頭″以及乳克魯維氏酵母的乳糖酶終止子的pGBSCC-9質(zhì)粒的0.78Kb BamHI-Hind III片段亞克隆到用限制性酶Hind III和BamHI消化的質(zhì)粒pTG7503中得到質(zhì)粒pTG10004(圖16)。
然后利用下列寡核苷酸5′GCGGATCTGC TCGAAGATTG CCTGCGCGTT GGGCTTGATC 3′SEQ ID NO.24.
對(duì)質(zhì)粒pTG10004的雙鏈DNA進(jìn)行定位誘變而消除了CYC1啟動(dòng)子的XhoI和MluI位點(diǎn)。
然后用限制性酶SalI和XhoI將由此得到的質(zhì)粒pTG10005進(jìn)行消化，然后利用下列寡核苷酸5′TCGACGGACG CGTGG 3′ SEQ ID NO.255′TCGACCACGC GTCC 3′ SEQ ID NO.26導(dǎo)入一個(gè)MluI位點(diǎn)得到質(zhì)粒pTG10006。
b)GAL10/CYC1啟動(dòng)子用限制性酶XhoI將質(zhì)粒pYeDP1/8-2(C.Cullin等人，Gene，203，1988)打開。所制備的粘性末端用DNA聚合酶Klenow片段填充，然后再將質(zhì)粒連接。由此獲得的質(zhì)粒pTG10010用作為pCR擴(kuò)增的模板，該質(zhì)粒中GAL10/CYC1啟動(dòng)子不再含有XhoI位點(diǎn)。
4.表達(dá)載體pTG10031的構(gòu)建利用下列寡核苷酸5′TGGCCGTCGT TTTACTCCTG CGCCTGATGC GGTAT 3′SEQ ID NO.27進(jìn)行位點(diǎn)特異性誘變從質(zhì)粒pTG7503中消除編碼lac Z的序列的剩余部分得到質(zhì)粒pTG7549。
然后用下列寡核苷酸5′GGCCGCAAAA CCAAA 3′ SEQ ID NO.285′AGCTTTTGGT TTTGC 3′ SEQ ID NO.29消除質(zhì)粒pTG7549中存在的lacZ啟動(dòng)子，這兩個(gè)寡核苷酸插入到事先用限制性酶NotI和Hind III消化的該質(zhì)粒中并且恢復(fù)了兩個(gè)位點(diǎn)得到質(zhì)粒pTG7553。
通過用限制性酶BamHI和MluI消化質(zhì)粒pTG10006而獲得含有CYC1啟動(dòng)子的BamHI-MluI片段，從用限制性酶MluI和Hind III消化的質(zhì)粒pTG10015中分離含有PGK啟動(dòng)子的MluI-Hind III片段。將這兩個(gè)片段連接并將由此獲得的連接產(chǎn)物插入到事先用限制性酶MluI和Hind III消化的質(zhì)粒pTG7553中。
下列寡核苷酸5′GATCTATCGA TGCGGCCGCG 3′ SEQ ID NO.30與下列寡核苷酸5′CGCGCGCGGC CGCATCGATA 3′ SEQ ID NO.31相雜交，這一寡核苷酸組成了含有ClaI和NotI位點(diǎn)的BamHI-MluI″接頭″，加入該寡核苷酸并連接得到表達(dá)載體pTG10031(圖17)。
用限制性酶ClaI和SalI將上述從質(zhì)粒pYE DP1/8-2經(jīng)pCR擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行消化，然后導(dǎo)入到事先用相同限制性酶消化的質(zhì)粒pTG10031中以便得到質(zhì)粒pTG10033(圖18)。
序列表(1)總體資料(i)申請(qǐng)人(A)姓名ROUSSEL UCLAF(B)街道102，Route de Naisy(C)城市ROMAINVILLE(E)國家法國(F)郵編(ZIP)93230(G)電話49.91.49.91(H)傳真49.91.46.10(ii)發(fā)明名稱編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的A.thaliana蛋白質(zhì)的DNA序列，δ-7Red蛋白質(zhì)，生產(chǎn)方法，轉(zhuǎn)化的酵母菌株，應(yīng)用。
(iii)序列數(shù)31(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.30(EPO)(vi)以前的申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朏R9501723(B)申請(qǐng)日1995年2月15日(vi)以前的申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朏R9506517
(B)申請(qǐng)日1995年6月1日(2)SEQ ID NO.1的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1496個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(C)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型CDNA(vI)原始來源(A)生物體Arabidopsis thaliana(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置76..1365(xi)序列描述SEQ ID NO.1
GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG AATCTGAGGC TTTGGCCGAG ACGAAGAGAA60AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG GAG ACT GTA CAT TCT CCG ATC GTT ACT TAC111Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr1 5 10GCA TCG ATG TTA TCG CTT CTC GCC TTC TGT CCA CCT TTC GTC ATT CTC 159Ala Ser Met Leu Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu15 20 25CTA TGG TAC ACA ATG GTT CAT CAG GAT GGT TCT GTT ACT CAG ACC TTT 207Leu Trp Tyr Thr Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe30 35 40GGC TTC TTT TGG GAG AAT GGA GTT CAA GGA CTT ATC AAC ATA TGG CCA 255Gly Phe Phe Trp Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro45 50 55 60AGA CCC ACT TTG ATT GCT TGG AAA ATT ATA TTT TGC TAT GGA GCA TTT 303Arg Pro Thr Leu Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe65 70 75GAA GCT ATT CTT CAG CTG CTT CTG CCT GGT AAA AGA GTT GAG GGT CCA 351Glu Ala Ile Leu Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro80 85 90ATA TCT CCA GCC GGA AAC CGA CCA GTT TAC AAG GCC AAT GGT CTG GCT 399Ile Ser Pro Ala Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala95 100 105GCT TAC TTT GTG ACA CTA GCA ACC CAT CTT GGT CTT TGG TGG TTT GGA 447Ala Tyr Phe Val Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly110 115 120
ATC TTC AAC CCT GCA ATT GTC TAT GAT CAC TTG GGT GAA ATA TTT TCG 495Ile Phe Asn Pro Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser125 130 135 140GCA CTA ATA TTC GGA AGC TTC ATA TTT TGT GTT TTG TTG TAC ATA AAA 543Ala Leu Ile Phe Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys145 150 155GGC CAT GTT GCA CCT TCA TCA AGT GAC TCT GGT TCA TGT GGT AAC CTA 591Gly His Val Ala Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu160 165 170ATA ATT GAC TTC TAT TGG GGC ATG GAG TTG TAC CCT CGA ATT GGT AAG 639Ile Ile Asp Phe Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys175 180 185AGC TTT GAC ATC AAG GTG TTT ACT AAT TGC AGA TTC GGA ATG ATG TCT 687Ser Phe Asp Ile Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser190 195 200TGG GCA GTT CTT GCA GTC ACG TAC TGC ATA AAA CAG TAT GAA ATA AAT 735Trp Ala Val Leu Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gln Tyr Glu Ile Asn205 210 215 220GGC AAA GTA TCT GAT TCA ATG CTG GTG AAC ACC ATC CTG ATG CTG GTG 783Gly Lys Val Ser Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val225 230 235TAT GTC ACA AAA TTC TTC TGG TGG GAA GCT GGT TAT TGG AAC ACC ATG 831Tyr Val Thr Lys Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met240 245 250GAC ATT GCA CAT GAC CGA GCT GGA TTC TAT ATA TGC TGG GGT TGT CTA 879Asp Ile Ala His Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu255 260 265GTG TGG GTG CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA GGC ATG TAC CTT GTG AAC 927Val Trp Val Pro Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn270 275 280CAC CCC GTC GAA CTC GGA ACT CAG TTG GCA ATA TAC ATT CTC GTT GCA 975His Pro Val Glu Leu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala285 290 295 300
GGA ATT CTG TGC ATT TAC ATA AAG TAT GAC TGT GAT AGA CAA AGG CAA 1023Gly Ile Leu Cys Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gln305 310 315GAG TTC AGG AGG ACA AAC GGG AAA TGT TTG GTT TGG GGA AGA GCC CCG 1071Glu Phe Arg Arg Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro320 325 330TCA AAG ATT GTG GCG TCG TAT ACT ACA ACA TCT GGT GAA ACT AAA ACT 1119Ser Lys Ile Val Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr335 340 345AGT CTT CTC TTA ACG TCT GGA TGG TGG GGA TTG GCT CGT CAT TTC CAT 1167Ser Leu Leu Leu Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His350 355 360TAT GTT CCT GAG ATC TTA AGT GCT TTC TTC TGG ACC GTA CCG GCT CTC 1215Tyr Val Pro Glu Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu365 370 375 380TTC GAT AAC TTC TTG GCA TAC TTC TAC GTC CTC ACC CTT CTT CTC TTT 1263Phe Asp Asn Phe Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe385 390 395GAT CGA GCC AAG AGA GAC GAT GAC CGA TGC CGA TCA AAG TAT GGG AAA 1311Asp Arg Ala Lys Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys400 405 410TAT TGG AAG CTG TAT TGT GAG AAA GTC AAA TAC AGG ATC ATT CCG GGA 1359Tyr Trp Lys Leu Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly415 420 425ATT TAT TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTAATTC1415Ile Tyr430GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT GCAAATTGAT GCGATAGACA 1475TTCTTTTGCT GAAAAAAAAA A 1496(2)SEQ ID NO.2的資料。
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度430個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO.2Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr Ala Ser Met Leu1 5 10 15Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu Leu Trp Tyr Thr20 25 30Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe Gly Phe Phe Trp35 40 45Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro Arg Pro Thr Leu50 55 60Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe Glu Ala Ile Leu65 70 75 80Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro Ile Ser Pro Ala85 90 95Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala Ala Tyr Phe Val100 105 110Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly Ile Phe Asn Pro115 120 125Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser Ala Leu Ile Phe130 135 140Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys Gly His Val Ala145 150 155 160Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu Ile Ile Asp Phe165 170 175
Tyr Trp G Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys Ser Phe Asp Ile180 185 190Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser Trp Ala Val Leu195 200 205Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gln Tyr Glu Ile Asn Gly Lys Val Ser210 215 220Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val Tyr Val Thr Lys225 230 235 240Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met Asp Ile Ala His245 250 255Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu Val Trp Val Pro260 265 270Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn His Pro Val Glu275 280 285Leu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala Gly Ile Leu Cys290 295 300Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gln Glu Phe Arg Arg305 310 315 320Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro Ser Lys Ile Val325 330 335Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu340 345 350Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His Tyr Val Pro Glu355 360 365Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu Phe Asp Asn Phe370 375 380Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe Asp Arg Ala Lys385 390 395 400Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys Tyr Trp Lys Leu405 410 415Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly Ile Tyr420 425 430
(2)SEQ ID NO.3的資料。
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置7(D)其他資料/注解＝″殘基7＝Trp或Tyr″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置12(D)其他資料/注解＝″殘基12＝His或lys″(xi)序列描述SEQ ID NO.3Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa1 5 10Xaa Tyr15(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-特征(B)位點(diǎn)10.29(D)其他資料/注釋＝″SEQ ID NO.1從76-95″(xi)序列描述SEQ ID NO.4CGCGGATCCA TGGCGGAGAC TGTACATTC 29(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-特征(B)位置補(bǔ)體(10.28)(D)其他資料/注釋＝″互補(bǔ)序列ID NO.1從1350-1368″(xi)序列描述SEQ ID NO.5CAGGGTACCT CAATAAATTC CCGGAATG28
(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-特征(B)位置補(bǔ)體(1.23)(xi)序列描述SEQ ID NO.6GATTACGCCA AGCTTTTCGA AAC 23(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO.7AGATCTTGAG AAGATGCGGC CAGCAAAAC 29(2)SEQ ID NO8的資料
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度46個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO.8GGGGATCCGT GGTCGACGTA ATTTAGTGTG TGTATTTGTG TTTGCG 46(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-特征(B)位置補(bǔ)體(1.17)(xi)序列描述SEQ ID NO.9GTAAAACGAC GGCCAGT 17(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO.10TTGAAGGTTC AACATCAATT GATTG25(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度38個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-特征(B)位置襯體(1.38)(xi)序列描述SEQ ID NO.11GTGTGGCGGC CGCCTCCTTG TCAATATTAA TGTTAAAG38(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(iii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO.12CAAGGAGGCG GCCGCCACAC AAAAAGTTAG GTGT34(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置補(bǔ)體(1..25)(xi)序列描述SEQ ID NO13TCTGCTTCCC TAGAACCTTC TTATG 25(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置補(bǔ)體(1..20)(xi)序列描述SEQ ID NO14TACATTAGGT CCTTTGTAGC 20(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO15GCGCTCAGCG GCCGCTTTCC AGTCG 25(2)SEQ ID NO16的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈
(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO16AATTGCGGCC GCGTACGTAT G 21(2)SEQ ID NO17的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置補(bǔ)體(1..21)(xi)序列描述SEQ ID NO17AATTCATACG TACGCGGCCG C21(2)SEQ ID NO18的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO18CAACGCGTCC TAGG 14(2)SEQ ID NO19的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置補(bǔ)體(1..22)(xi)序列描述SEQ ID NO19AATTCCTAGG ACGCGTTGAG CT22(2)SEQ ID NO20的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸
(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO20GATCCGCAGA TATCATCTAG ATCCCGGGTA GAT33(2)SEQ ID NO21的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置補(bǔ)體(1..39)(xi)序列描述SEQ ID NO21AGAGCTCAAG ATCTACCCGG GATCTAGATG ATATCTGCG 39(2)SEQ ID NO22的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″
(xi)序列描述SEQ ID NO22CTTGAGCTCT ACGCAGCTGG TCGACACCTA GGAG34(2)SEQ ID NO23的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置補(bǔ)體(1..28)(xi)序列描述SEQ ID NO23AATTCTCCTA GGTGTCGACC AGCTGCGT 28(2)SEQ ID NO24的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO24
GCGGATCTGC TCGAAGATTG CCTGCGCGTT GGGCTTGATC40(2)SEQ ID NO25的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO25TCGACGGACG CGTGG 15(2)SEQ ID NO26的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置補(bǔ)體(1..14)(xi)序列描述SEQ ID NO26TCGACCACGC GTCC 14
(2)SEQ ID NO27的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO27TGGCCGTCGT TTTACTCCTG CGCCTGATGC GGTAT 35(2)SEQ ID NO28的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO28GGCCGCAAAA CCAAA15(2)SEQ ID NO29的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置補(bǔ)體(1..25)(xi)序列描述SEQ ID NO29AGCTTTTGGT TTTGC 15(2)SEQ ID NO30的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO30GATCTATCGA TGCGGCCGCG20(2)SEQ ID NO31的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈
(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置補(bǔ)體(1..20)(xi)序列描述SEQ ID NO31CGCGCGCGGC CGCATCGATA 20
權(quán)利要求
1.克隆方法，用于將編碼具有δ-5，7甾醇δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)的核酸克隆于一種微生物中，所述克隆方法包括篩查方法，篩選-對(duì)制霉菌素或一種類似化合物共抗性的微生物，所述類似化合物的毒性由在C-7位攜帶不飽和鍵的甾醇存在而定，-將其核酸與SEQ ID NO.1的核苷酸序列進(jìn)行雜交，-利用數(shù)據(jù)加工技術(shù)從隨機(jī)分離的DNA序列鑒別核酸，-在該蛋白質(zhì)直接表達(dá)之后利用特異于具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)。
2.DNA或RNA核酸序列，根據(jù)權(quán)利要求1定義的方法獲得。
3.由含有權(quán)利要求2的DNA序列的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中宿主是一種酵母或絲狀真菌。
5.制備具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)的方法，其中將根據(jù)權(quán)利要求3或4所述轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并分離表達(dá)的蛋白質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其中宿主細(xì)胞是一種轉(zhuǎn)化酵母，其中DNA編碼序列置于酵母啟動(dòng)子控制之下。
7.將C-7位不飽和的甾醇體外還原的方法，所述方法包括將待還原的甾醇與具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)一起保溫，并且對(duì)獲得的還原甾醇進(jìn)行分離或不分離，其中所述蛋白質(zhì)是根據(jù)權(quán)利要求5或權(quán)利要求6的方法獲得的蛋白質(zhì)，或者是通過培養(yǎng)用含有下述核酸序列的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞而獲得的蛋白質(zhì)(i)含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列及其等位基因變異體的核酸序列，(ii)具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列及其等位基因變異體的DNA序列，(iii)編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)并且在中等或高嚴(yán)緊條件下與(i)中定義的序列雜交或者具有與該序列有約60％和更高的序列同一性的序列的核酸序列，或(iv)編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)并且利用引物寡核苷酸和PCR技術(shù)擴(kuò)增得到的核酸序列，所述引物編碼具有SEQID NO.3氨基酸序列的共有序列，其中第7位的Xaa是Trp或Tyr并且第12位Xaa是His或Lys。
8.將在C-7位不飽和的外源甾醇體內(nèi)還原的方法，其中將甾醇與轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞一起培養(yǎng)，并將得到的還原甾醇進(jìn)行分離或不分離，其中所述轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞是權(quán)利要求3或4所述的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，或者是用含有選自以下一種DNA序列的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(i)含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列及其等位基因變異體的核酸序列，(ii)具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列及其等位基因變異體的DNA序列，(iii)編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)并且在中等或高嚴(yán)緊條件下與(i)中定義的序列雜交或者具有與該序列有約60％和更高的序列同一性的序列的核酸序列和(iv)編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)并且利用引物寡核苷酸和PCR技術(shù)擴(kuò)增得到的核酸序列，所述引物編碼具有SEQID NO.3氨基酸序列的共有序列，其中第7位的Xaa是Trp或Tyr并且第12位Xaa是His或Lys。
9.將在C-7位不飽和的內(nèi)源甾醇進(jìn)行體內(nèi)還原的方法，其中將權(quán)利要求4所述轉(zhuǎn)化的宿主菌株進(jìn)行培養(yǎng)并將積累的還原甾醇進(jìn)行分離或不分離。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)所述體外或體內(nèi)還原方法，其中獲得的還原甾醇是膽固醇側(cè)鏈限制性酶(P450SCC)的底物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述體內(nèi)還原方法，其中待還原的內(nèi)源甾醇是麥角甾5，7二烯3-醇、麥角甾5，7，24(28)三烯3-醇或麥角甾5，7，22三烯3-醇或它們的混合物。
12.制備孕甾烯醇酮的方法，其中將權(quán)利要求4所述轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，將在C-7位還原的積累的內(nèi)源甾醇或甾醇類進(jìn)行分離或不分離，在P450SCC存在以及有或沒有腎上腺皮質(zhì)激素還原酶(ADR)和腎上腺皮質(zhì)激素(ADX)存在下，將待還原的甾醇保溫，并對(duì)獲得的孕甾烯醇酮進(jìn)行分離或不分離。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述方法，其中宿主細(xì)胞是酵母。
14.制備孕甾烯醇酮的方法，其中將由一個(gè)或多個(gè)載體轉(zhuǎn)化的酵母進(jìn)行培養(yǎng)，所述載體能使具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性以及P450SCC活性和具有或不具有ADR和ADX活性的蛋白質(zhì)共表達(dá)，然后分離或不分離游離的或酯化的孕甾烯醇酮。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述孕甾烯醇酮的制備方法，其中將能共表達(dá)具δ-5，7甾醇，δ-7還原酶、P450SCC、ADR和ADX活性的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化酵母進(jìn)行培養(yǎng)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述方法，其中具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)是擬南芥(Arabidopsis thaliana)δ-7Red蛋白質(zhì)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述方法，其中酵母菌株是EC01/pCD63菌株。
18.轉(zhuǎn)化的酵母菌株，其共表達(dá)具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶、P450SCC、ADR和ADX活性的一種蛋白質(zhì)，并且積累游離或酯化的孕甾烯醇酮。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述酵母菌株，其中具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)是擬南芥δ-7Red蛋白質(zhì)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述酵母菌株，其命稱為EC01/pCD63。
21.一種抗體，它特異于具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO.2或其等位基因變異體；(ii)具有氨基酸序列SEQ ID NO.2并命名為δ-7Red；(iii)具有與SEQ ID NO.2序列至少有60％序列同一性的氨基酸序列；(iv)與(ii)中定義的擬南芥δ-7Red蛋白具有交叉免疫反應(yīng)性；(v)是通過在含有編碼氨基酸序列SEQ ID NO.2的DNA序列的宿主細(xì)胞中表達(dá)而獲得的；(vi)是通過在含有選自以下一種DNA序列的宿主細(xì)胞中表達(dá)獲得的(a)含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列及其等位基因變異體的DNA序列，(b)具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列及其等位基因變異體的DNA序列，(c)編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)并且編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)并且在中等或高嚴(yán)緊條件下與(i)中定義的序列雜交或者具有與該序列有約60％和更高的序列同一性的序列的DNA序列，和(d)編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)并且利用引物寡核苷酸和PCR技術(shù)擴(kuò)增得到的DNA序列，所述引物編碼具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的共有序列，其中第7位的Xaa是Trp或Tyr并且第12位Xaa是His或Lys；或(vii)(v)或(vi)的蛋白質(zhì)，其中所述宿主細(xì)胞是酵母。
全文摘要
編碼A.thaliana蛋白質(zhì)的cDNA序列，該蛋白質(zhì)具有δ－5，7甾醇，δ－7還原酶活性(SEQ ID NO.1)?？寺》椒?。在C－7位不飽和甾醇的還原方法。孕甾烯醇酮的生產(chǎn)方法。
文檔編號(hào)C12N15/81GK1664107SQ20041004883
公開日2005年9月7日 申請(qǐng)日期1996年2月14日 優(yōu)先權(quán)日1995年2月15日
發(fā)明者X·錢尼韋西, C·杜波, E·勒凱恩, D·龐彭 申請(qǐng)人:魯索-艾克勒夫公司