專利名稱：抗人內(nèi)皮抑素的單克隆抗體及其雜交瘤細(xì)胞系與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雜交瘤細(xì)胞系及其產(chǎn)生的單克隆抗體與應(yīng)用，特別是涉及一種抗人內(nèi)皮抑素的單克隆抗體和分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞系及其該抗體的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
內(nèi)皮抑素是1997年由哈佛大學(xué)的O’Reilly等發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性的血管生成抑制因子，由膠原XVIII降解產(chǎn)生，為膠原XVIII NC1結(jié)構(gòu)域C末端184個(gè)氨基酸的小分子片段，相對分子量(Mr)為20kD，可以通過位于其表面的11個(gè)精氨酸構(gòu)成的堿性區(qū)域與肝素結(jié)合。在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中內(nèi)皮抑素顯示出抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、抑制新血管形成及抑制腫瘤形成和轉(zhuǎn)移的活性，并可使已形成的腫瘤消失且不產(chǎn)生耐藥性。內(nèi)皮抑素在體液中水平的高低與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有密切的關(guān)系，特別是與腫瘤的轉(zhuǎn)移性有關(guān)，有可能被用做臨床預(yù)后的檢測指標(biāo)。最新的研究結(jié)果表明，在多發(fā)性硬化、阿爾茲海默等疾病患者體內(nèi)，存在內(nèi)皮抑素水平增高或沉積等現(xiàn)象，值得深入探討。
目前，內(nèi)皮抑素抑制內(nèi)皮細(xì)胞的作用機(jī)制尚不清楚，可能是通過某種細(xì)胞表面受體而發(fā)揮作用，也有人認(rèn)為內(nèi)皮抑素是通過阻斷VEGF受體或干擾內(nèi)皮細(xì)胞與周圍基質(zhì)的粘附而發(fā)揮作用。眾多研究人員一直在努力尋找內(nèi)皮抑素在細(xì)胞表面的直接受體，而內(nèi)皮抑素單抗在這些研究中是一個(gè)有力的工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供能與人內(nèi)皮抑素專一結(jié)合的單克隆抗體以及產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
能夠分泌與人內(nèi)皮抑素專一結(jié)合單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系已于2004年04月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC № 1137。
本發(fā)明用純度大于99％的重組人內(nèi)皮抑素作為抗原免疫小鼠，采用雜交瘤技術(shù)，經(jīng)過細(xì)胞融合并篩選得到一株能持續(xù)、穩(wěn)定分泌抗人內(nèi)皮抑素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株E47(CGMCC № 1137)。由該細(xì)胞系分泌的抗內(nèi)皮抑素的單抗名稱為mAb E47，其輕鏈序列為序列表中序列1；重鏈序列為序列表中序列2。
單抗mAb E47僅識別單一的抗原決定簇，與其它抗原無交叉反應(yīng)，用于檢測具有高特異性、高敏感性的優(yōu)點(diǎn)，可以準(zhǔn)確檢測體液中內(nèi)皮抑素的水平，在臨床檢測中將會得到廣泛應(yīng)用。由于本發(fā)明的抗體具有阻斷內(nèi)皮抑素功能的特性，可用于進(jìn)一步深入研究內(nèi)皮抑素的結(jié)構(gòu)、功能及作用機(jī)制，同時(shí)通過篩選或結(jié)構(gòu)模建分析方法還可以獲得內(nèi)皮抑素的結(jié)構(gòu)和功能類似物，具有良好的應(yīng)用前景。


圖1為抗體SDS-PAGE電泳2為抗體免疫印跡分析3為抗體用間接ELISA測定的反應(yīng)曲線圖4為細(xì)胞HUVEC的細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)5為細(xì)胞HUVEC的遷移實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)6為小鼠角膜顯微照片圖7為小鼠角膜血管長度數(shù)據(jù)圖具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、雜交瘤細(xì)胞系的建立一、實(shí)驗(yàn)材料1、免疫原畢赤酵母表達(dá)的內(nèi)皮抑素(馮怡 崔立斌 劉傳暄 馬清鈞，人內(nèi)皮抑素在畢赤酵母中的表達(dá)、純化與生物功能研究生物工程學(xué)報(bào)Vol.17 No.3278-282.)2、培養(yǎng)基RPMI1640和IMDM培養(yǎng)基購于Gibco公司產(chǎn)品；HAT、HT選擇培養(yǎng)基、降植烷購于Sigma公司。
3、實(shí)驗(yàn)動物Balb/c小鼠，8-12周齡，雌性，按一級動物喂養(yǎng)。
4、其他材料PEG 4000購于Fluka公司；HRP-山羊抗小鼠IgG購自北京中山公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。
二、雜交瘤細(xì)胞系的建立1、動物免疫1)基礎(chǔ)免疫將抗原內(nèi)皮抑素與福氏完全佐劑等體積混合并充分乳化，分點(diǎn)皮下注射，每只Balb/c小鼠每次注射量為100μg。
2)加強(qiáng)免疫加強(qiáng)免疫采用抗原與福氏不完全佐劑的乳化液。在進(jìn)行細(xì)胞融合前3天，經(jīng)腹腔注射含150μg抗原的生理鹽水溶液。
2、雜交瘤細(xì)胞的制備按常規(guī)方法收集免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞按10∶1的比例以500g/L的PEG4000進(jìn)行融合。用HAT培養(yǎng)液選擇培養(yǎng)，融合后10～15d，取上清采用間接ELISA法篩選分泌抗內(nèi)皮抑素mAb的雜交瘤細(xì)胞株。對所得陽性克隆株采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。
間接ELISA法的操作步驟如下用200μg/L內(nèi)皮抑素包被酶聯(lián)板，用免疫小鼠血清1∶100作為陽性對照，無克隆生長的培養(yǎng)上清和正常小鼠血清作為陰性對照，每孔加1∶2000HRP-山羊抗小鼠IgG100μl，最后測定490nmOD值。凡OD490值大于陰性對照2倍以上者，即可初步判定為陽性克隆。
3、雜交瘤細(xì)胞系的建立重復(fù)步驟2，進(jìn)行4次細(xì)胞融合，經(jīng)過4次亞克隆和間接ELISA篩選，得到一株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系E47。
4、應(yīng)用雜交瘤細(xì)胞系E47所得單抗的效價(jià)測定將E47細(xì)胞在含10％胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳代，每3天傳代一次，傳代到16代后進(jìn)行單抗效價(jià)測定。
1)細(xì)胞培養(yǎng)液上清效價(jià)測定將第16代細(xì)胞按1×105接種量接種到5ml含10％胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基中，在37℃含5％CO2的細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)3天；然后將細(xì)胞培養(yǎng)液在800rpm下離心10min，收集上清，用間接ELISA法測定上清中單抗效價(jià)，結(jié)果表明上清效價(jià)為1∶2000-1∶5000。
2)小鼠腹水效價(jià)測定選擇健康的Balb/c小鼠，先向小鼠腹腔注射0.5mL降植烷，7-10天后每只小鼠腹腔注射第16代雜交瘤細(xì)胞1×106-2×106個(gè)。待小鼠腹部明顯膨大到一定程度后，用9號針頭抽取腹水。收獲的腹水于4℃、13000rpm離心30min，收集上清。用間接ELISA法測定上清中單抗效價(jià)，效價(jià)為1∶10000-1∶100000。
5、E47細(xì)胞系的傳代培養(yǎng)將E47細(xì)胞系在含10％胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，培養(yǎng)到60代后，雜交瘤細(xì)胞系E47仍然能生長良好、穩(wěn)定傳代，培養(yǎng)液上清效價(jià)仍然可以達(dá)到1∶2000以上。
以上結(jié)果表明，所得E47細(xì)胞系能夠穩(wěn)定傳代，可以持續(xù)、穩(wěn)定分泌抗人內(nèi)皮抑素的單克隆抗體。
實(shí)施例2、應(yīng)用E47細(xì)胞系制備抗人內(nèi)皮抑素的單克隆抗體一、抗體制備選擇健康的Balb/c小鼠，先向小鼠腹腔注射0.5mL降植烷，7-10天后每只小鼠腹腔注射第16代雜交瘤細(xì)胞1×106-2×106個(gè)。待小鼠腹部明顯膨大到一定程度后，用9號針頭抽取腹水。收獲的腹水于4℃、13000rpm離心30min，收集上清。
收集的腹水用50mmol/LTris-HCl(PH 7.8)3mol/LNaCl按1∶8稀釋后，用ProteinA Sepharose CL-4B進(jìn)行純化，柱層析洗脫液為0.1mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH5.0)，收集洗脫液濃縮，得到抗人內(nèi)皮抑素的單克隆抗體(mAb E47)。
二、抗體mAb E47鑒定1、抗體純度鑒定將mAb E47用15％SDS-PAGE電泳鑒定純度，產(chǎn)品純度為99％，電泳圖如圖1所示，圖中1為純化的mAb E47，2為蛋白標(biāo)記物。
2、抗體IgG類和亞類鑒定用內(nèi)皮抑素包被酶聯(lián)板后，加16代雜交瘤細(xì)胞E47的培養(yǎng)上清1∶1稀釋作為一抗在37℃溫育2h，用20mmol/L PBS-T(PH 7.4)洗板4次，每次3min。將包被好抗體的酶聯(lián)板測定mAb E47亞類，測定結(jié)果表明mAb E47的Ig類型為IgG1、λ型。
3、抗體免疫印跡檢測分別取畢赤酵母、大腸桿菌表達(dá)的內(nèi)皮抑素及bFGF進(jìn)行15％SDS-PAGE，將電泳后的凝膠對NC膜電轉(zhuǎn)移(電壓15V，1h半干轉(zhuǎn)移)，再對轉(zhuǎn)移后的NC膜行間接免疫反應(yīng)，一抗為E47細(xì)胞培養(yǎng)上清1∶20稀釋液，底物為DAB。顯色適度加2mol/L硫酸終止。免疫印跡分析結(jié)果如圖2所示，圖中1-4為采用Coomassie Blue stain分析，1為蛋白標(biāo)記物；2為內(nèi)皮抑素(Endostatin)；3為內(nèi)皮抑素—硫氧環(huán)蛋白融合蛋白(Endo-Trx)；4為bFGF。圖中5-7為Western blot分析，5為內(nèi)皮抑素；6為Endo-Trx；7為bFGF。
免疫印跡結(jié)果表明，mAb E47能特異性的識別畢赤酵母表達(dá)的內(nèi)皮抑素及大腸桿菌表達(dá)的內(nèi)皮抑素-硫氧環(huán)蛋白融合蛋白(Endo-Trx)，而不識別細(xì)胞因子bFGF。
4、抗體mAb E47的反應(yīng)曲線將純化所得mAb E47抗體用0.1M含5％BSA的磷酸鹽緩沖液(PBS)從1∶1開始倍比稀釋，用間接ELISA法測定抗體反應(yīng)曲線，結(jié)果如圖3所示，圖中橫坐標(biāo)，25表示倍比稀釋到第5次，其余與此類似。
5、抗體mAb E47的親和常數(shù)測定按照Friguet等的方法(Friguet B，Alain F et al.Measurements of the TrueAffinity Constant in Solution of Antigen-Antibody Complexes by Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay.J Immunol Methods.1985，77(2)305-319.)稀釋抗原濃度梯度于2×10-7-4×10-10之間，總mAb E47的濃度為3×10-10，于37℃反應(yīng)1h，再用間接ELISA法測定游離mAb E47的濃度，根據(jù)Scatchard方程，計(jì)算方程斜率即為親和常數(shù)(Ka)，測定結(jié)果為mAb E47的親和常數(shù)為4×108mol-1。
6、抗體mAb E47的輕、重鏈可變區(qū)序列測定提取E47雜交瘤細(xì)胞的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，參考小鼠輕重鏈可變區(qū)旁側(cè)保守序列設(shè)計(jì)簡并引物，通過PCR的方法從E47cDNA中擴(kuò)增出編碼輕重鏈可變區(qū)的DNA序列，測序，用所得cDNA序列推導(dǎo)出E47輕重鏈可變區(qū)的氨基酸序列，輕鏈序列為序列表中序列1；重鏈序列為序列表中序列2。
三、抗體mAb E47的生物活性鑒定(一)抗體mAb E47抑制內(nèi)皮抑素的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)1、膠原酶消化法獲取原代人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)在無菌條件下取新生兒臍帶，剪去鉗痕和凝血塊阻塞部分，用含雙抗的PBS緩沖液初步清洗，找到臍靜脈用50ml注射器吸取PBS反復(fù)灌注沖洗，洗凈殘留的血液后用止血鉗封住一端，用注射器從另一端灌入約15ml 0.1％的II型膠原酶(D-Hanks配制，0.22μ過濾除菌，灌注體積視臍帶長短而定)。超凈臺內(nèi)溫度一般高于室溫在此條件下膠原酶作用20分鐘，期間可不時(shí)晃動，消化完畢打開止血鉗將消化液流入事先準(zhǔn)備好的離心管中，用注射器吸取一倍消化液體積的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基灌洗消化后的血管，收集合并于消化液，900轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄上清。
事先配好內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液(含20％FBS，2ng/mlbFGF，1％BSA，90μg/ml肝素鈉的IMDM培養(yǎng)基)并在孵箱內(nèi)孵育至37℃，此時(shí)加入離心得到的細(xì)胞團(tuán)中，吹打均勻，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×104/ml。六孔細(xì)胞培養(yǎng)板事先灌注1％明膠并在37℃孵箱中預(yù)熱，接種前吸去明膠，每孔加入內(nèi)皮細(xì)胞懸液2.5ml，置于5％CO2、飽和濕度的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，24h后更換培養(yǎng)液以除去未貼壁的細(xì)胞，以后每隔3天半換培養(yǎng)液1次，至細(xì)胞長至匯合。
2、原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)原代分離的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長匯合后用IMDM培養(yǎng)基洗一次，然后用0.05％胰蛋白酶/0.05％EDTA 1∶1配制的消化液每孔0.5ml消化，于倒置顯微鏡下觀察至細(xì)胞邊緣略變圓時(shí)每孔加含血清的IMDM培養(yǎng)基1ml終止消化。用吸管充分吹打后移入15ml錐底離心管中在900rpm下離心10分鐘。吸凈上清，加入事先溫至37℃的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，輕輕吹打均勻，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×104/ml按每孔2.5ml接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。置于含5％CO2、飽和濕度的37℃孵箱中靜置培養(yǎng)，每隔3天半換培養(yǎng)液1次。
3、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定在24孔塑料培養(yǎng)板孔內(nèi)放置無菌的蓋玻片0.5cm×0.6cm，每孔中接種1ml含有105個(gè)細(xì)胞的HUVEC懸液(第2代)。待內(nèi)皮細(xì)胞生長至近融合狀態(tài)時(shí)，取出蓋玻片，用PBS洗3次，投入冷丙酮中(0℃-4℃)，細(xì)胞面向上，作用5min后用PBS沖洗3次，每次1min，而后進(jìn)行免疫組化染色。先用封閉液37℃封閉4小時(shí)，第一抗體為鼠抗人vWF單克隆抗體，1∶100倍稀釋，加入50μl于蓋玻片上，放入濕盒內(nèi)4℃過夜。同時(shí)不加一抗做陰性對照。然后用含0.05％吐溫20的PBS沖洗3次后，加入1∶200倍稀釋的辣根酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗50μl，37℃孵育2小時(shí)后，用PBS洗滌3次，用SABC顯色試劑盒顯色，顯微鏡下觀察鑒定。
結(jié)果表明，所培養(yǎng)的細(xì)胞呈vWF陽性反應(yīng)，是人內(nèi)皮細(xì)胞，可用于內(nèi)皮抑素抑制試驗(yàn)。
4、細(xì)胞粘附試驗(yàn)96孔板事先分別用20μg/ml內(nèi)皮抑素、1％BSA于4℃包被過夜，用1％BSA封閉2小時(shí)。胰酶消化單層培養(yǎng)的第三代HUVEC，用無血清培養(yǎng)基洗兩次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105/孔，同時(shí)向培養(yǎng)板中分別加入20μg/ml內(nèi)皮抑素、40μg/ml抗體mAb E47、40μg/ml小鼠IgG個(gè)100μl(均以PBS溶解)，每種處理重復(fù)3組，空白對照加入同樣體積的PBS。將細(xì)胞培養(yǎng)板在37℃孵育1小時(shí)，用無血清培養(yǎng)基洗去未貼壁細(xì)胞，然后每孔用100μl 0.5％結(jié)晶紫溶液對已貼壁細(xì)胞進(jìn)行染色，然后吸去染液用PBS洗兩次，最后每孔用100μl 10％乙酸溶液溶解細(xì)胞吸附的結(jié)晶紫，在酶聯(lián)儀上490nm波長處測定OD值，結(jié)果如圖4所示，圖中1為20μg/ml內(nèi)皮抑素；2為40μg/ml抗體mAb E47；3為40μg/ml純化的小鼠IgG；4為含1％BSA的PBS。
從圖4可以看出，HUVEC可以粘附于內(nèi)皮抑素包被的細(xì)胞培養(yǎng)板上，外加PBS不影響HUVEC對內(nèi)皮抑素的粘附，1％BSA包被的培養(yǎng)板為陰性對照，HUVEC不能很好的粘附于BSA包被的培養(yǎng)板上，而游離的內(nèi)皮抑素20μg/ml可以抑制HUVEC對內(nèi)皮抑素的粘附，抗內(nèi)皮抑素的單克隆抗體E4740μg/ml也可抑制HUVEC對內(nèi)皮抑素的粘附，而同樣濃度的對照抗體不影響HUVEC對內(nèi)皮抑素的粘附。結(jié)果表明，本發(fā)明所得抗內(nèi)皮抑素的單抗mAb E47可以拮抗固定化的內(nèi)皮抑素促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)粘附的功能。
5、趨化誘導(dǎo)的HUVEC遷移試驗(yàn)?zāi)氺o脈內(nèi)皮細(xì)胞用含20％胎牛血清的IMDM傳代培養(yǎng)，用直徑6.5mm、孔徑8μm的聚碳酸酯膜的細(xì)胞遷移培養(yǎng)板進(jìn)行遷移試驗(yàn)。濾膜的底面預(yù)先鋪上一層厚度約0.1mm的基質(zhì)膠，37℃溫箱中放置30分鐘形成穩(wěn)定膠層。在遷移培養(yǎng)板下槽中加入含有1％胎牛血清及10ng/ml bFGF的IMDM培養(yǎng)基，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育1h以上后使用。生長狀態(tài)良好的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)0.05％胰酶、0.02％EDTA消化懸浮后，無血清培養(yǎng)基洗滌兩遍，用含1％胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/毫升，按表1進(jìn)行各種分組處理①PBS(下槽中無bFGF)，②PBS，③內(nèi)皮抑素20μg/ml，④內(nèi)皮抑素10μg/ml，⑤內(nèi)皮抑素20μg/ml+E4740μg/ml，⑥E4740μg/ml，室溫孵育30分鐘。上槽中每孔加入100μl細(xì)胞懸液，每種處理重復(fù)3孔，37℃、5％CO2孵育4h后，將上層小槽取出，傾去培養(yǎng)液，用棉簽擦去遷移膜上表面的細(xì)胞，再用生理鹽水輕輕洗滌。遷移膜經(jīng)甲醇固定后用0.5％結(jié)晶紫染色，再次用生理鹽水洗滌去掉不結(jié)合細(xì)胞的染料，用10％乙酸(v/v)溶解細(xì)胞中的結(jié)晶紫后，490nm測OD值，結(jié)果如圖5所示。
表1.分組實(shí)驗(yàn)條件表

圖5中縱坐標(biāo)用吸光度顯示發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)量，圖中1為不加任何刺激的對照組中HUVEC的自發(fā)遷移；2為10ng/mlbFGF刺激下的HUVEC遷移；3為在20μg/ml內(nèi)皮抑素的抑制下HUVEC受同樣濃度bFGF刺激時(shí)的遷移，可以見到抑制作用明顯；4為內(nèi)皮抑素濃度10μg/ml時(shí)的抑制效果；5顯示的是20μg/ml內(nèi)皮抑素對10ng/ml的bFGF誘導(dǎo)下HUVEC的遷移抑制作用被40μl/ml單抗E47拮抗的效果，可見內(nèi)皮抑素的抑制作用幾乎消失；6顯示的是單獨(dú)使用40μg/ml的E47對HUVEC的遷移的影響。結(jié)果表明，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)在細(xì)胞因子bFGF誘導(dǎo)下的遷移可被內(nèi)皮抑素抑制，外加單抗E47可以拮抗此抑制作用。
(二)抗體mAb E47抑制內(nèi)皮抑素的動物實(shí)驗(yàn)小鼠采用0.3-0.8ml/kg速眠新肌注全麻，0.5％丁卡因溶液局部滴眼表面麻醉，取約2毫米直徑小濾紙片于1N的NaOH中浸泡30秒，在角膜中央放置1分鐘，用大量0.9％生理鹽水沖洗角膜后，用0.15％氧氟沙星滴眼預(yù)防感染。隨機(jī)分組后滴眼給藥對照組用PBS；治療組用內(nèi)皮抑素(30μg/ml)；拮抗組用內(nèi)皮抑素30μg/ml+mAb E4740μg/ml，每天給藥6-7次，間隔時(shí)間約3-4小時(shí)，每次用藥0.003ml，連續(xù)用藥7天觀察結(jié)果。
圖6為角膜4×10倍顯微照片，其中a為正常小鼠眼睛角膜；b為堿燒傷刺激下的角膜新血管生成可見豐富血管生長(對照組)；c為內(nèi)皮抑素對堿燒傷小鼠角膜新血管生成的抑制效果，可見有較少血管生長(治療組)；d為單抗E47和內(nèi)皮抑素共同使用時(shí)，內(nèi)皮抑素對角膜新血管生成的抑制作用消失，可見豐富血管生長(拮抗組)。
將小鼠經(jīng)0.3-0.8ml/kg速眠新肌注全麻，0.5％丁卡因溶液局部滴眼表面麻醉后，在體視顯微鏡下(40×)，用游標(biāo)卡尺測量新生血管長度，每眼按12點(diǎn)、3點(diǎn)、6點(diǎn)、9點(diǎn)位置均勻測量四個(gè)檢測點(diǎn)的新生血管長度，取血管長度的平均值采用SPSS單向方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果如圖7所示。圖中1為堿燒傷后小鼠角膜新生血管平均長度(對照組)；2為內(nèi)皮抑素治療組的新生血管平均長度；3為拮抗組的血管平均長度，接近對照組。
血管密度和平均長度指標(biāo)表明，單抗mAb E47可拮抗內(nèi)皮抑素的活性。
序列表<160>2<210>1<211>85<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val1 5 10 15Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Ser Tyr Leu Ala Trp20 25 30Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Ser Ala35 40 45Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser50 55 60Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe65 70 75 80Gly Ile Tyr Tyr Cys85<210>2<211>93<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Asn Leu Ser1 5 10 15Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His Trp Met Gln Trp Val20 25 30Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro35 40 45
Gly Asp Gly Glu Thr Thr Tyr Ser Gln Lys Phe Glu Gly Lys Ala Thr50 55 60Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Gly Tyr Met Gln Leu Ser Ser65 70 75 80Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg85 90
權(quán)利要求
1.具有保藏號為CGMCC № 1137的雜交瘤細(xì)胞系E47。
2.與人內(nèi)皮抑素專一結(jié)合的單克隆抗體，由保藏號為CGMCC № 1137的雜交瘤細(xì)胞系E47產(chǎn)生。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體輕鏈的氨基酸序列為序列表中SEQ ID №.1的氨基酸殘基序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體重鏈的氨基酸序列為序列表中SEQ ID №.2的氨基酸殘基序列。
5.人內(nèi)皮抑素專一結(jié)合的單克隆抗體在內(nèi)皮抑素檢測中的應(yīng)用。
6.人內(nèi)皮抑素專一結(jié)合的單克隆抗體在篩選內(nèi)皮抑素功能類似物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了抗人內(nèi)皮抑素的單克隆抗體及其雜交瘤細(xì)胞系與應(yīng)用，目的是提供能與人內(nèi)皮抑素專一結(jié)合的單克隆抗體。本發(fā)明擁有能夠分泌與人內(nèi)皮抑素專一結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，保藏號為CGMCC № 1137。本發(fā)明所得單抗僅識別單一的抗原決定簇，與其它抗原無交叉反應(yīng)，用于檢測具有高特異性、高敏感性的優(yōu)點(diǎn)，可以準(zhǔn)確檢測體液中內(nèi)皮抑素的水平，可應(yīng)用于臨床檢測；同時(shí)可用于進(jìn)一步深入研究內(nèi)皮抑素的結(jié)構(gòu)、功能及作用機(jī)制，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N5/12GK1712523SQ20041004809
公開日2005年12月28日 申請日期2004年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月15日
發(fā)明者馮怡, 馮玉梅, 馬清鈞, 朱旭東 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所