專利名稱：：一種能夠使轉基因植物自主剔除標記基因的方法
技術領域：
：本發(fā)明公開了一種能夠使轉基因植物中自主剔除標記基因的方法，屬于植物基因工程領域。本發(fā)明具體涉及相關基因和結構元件的分離克隆、相關載體構建、植物遺傳轉化以及無標記基因轉基因植株的田間篩選和分子鑒定等方法。目的主要在于創(chuàng)造一種全新高效的方法，剔除轉基因植物體所攜帶的標記基因，獲得只含有目的基因的轉基因植株，提高轉基因農產品的生物安全性。
背景技術：
：植物轉基因過程中，由于外源DNA被植物細胞吸收和整合進入植物基因組的頻率很低，為了有效的選擇、識別和鑒定轉化的細胞和植株，導入目的基因的同時，需要引入選擇標記基因以賦予受體植物特定的抗性。目前，所用的標記基因主要是編碼抗生素或除草劑的基因。隨著轉基因植物的獲得，標記基因已不再具有利用價值，但它仍在植物中不斷指導相應的酶合成，消耗細胞資源，而且標記基因的生物安全問題也對消費心理也形成一定壓力。開發(fā)無標記基因或剔除標記基因的轉基因系統，創(chuàng)造無標記基因的轉基因植物具有重要意義。目前，獲得無標記基因轉基因植物的方法可歸納為回避策略和剔除策略兩大類，前者包括無標記基因轉化法、生理代謝基因選擇法、目的基因載體與標記基因載體共轉化法，后者包括標記基因切除法。無標記基因轉化法需借助PCR擴增直接對獲得的非選擇再生苗進行檢測鑒定，后期選擇工作量大，費用高，局限性大。生理代謝基因選擇法需轉入的生理代謝相關基因，影響植物個體發(fā)育，也不宜采用。較為實用的是后兩種方法，即雙載體共轉化法和標記基因切除法(即位點特異重組法)等。位點特異重組法是將標記基因置于特定重組位點之間，通過相應的特異識別該位點的重組酶催化，產生特異重組或特異切除，利用此特性可將標記基因剔除。在轉基因植物標記基因的剔除過程中，利用重組位點和重組酶的特點構建特異植物轉化載體系統，即將標記基因置于T-DNA片段上的兩個特異重組位點間，同時將相應的重組酶基因構建到另一個植物轉化載體上，得到的兩種轉化植株雜交，重組酶基因表達實現標記基因的特異切除。目前主要發(fā)現了來源于微生物的五類位點特異重組系統，即細菌噬菌體P1的Cre-loxP系統、酵母質粒FLP-FRT系統、Zygosaccharomycesrouxii的R/RS系統、Mu噬菌體的Gin-gix重組酶系統以及λ噬菌體attB-P系統。Cre-loxP系統的lox位點由34bp特異序列構成，其中有8bp是核心序列，Cre重組酶是一個38.5KD的蛋白質，專一性的識別和催化兩loxP位點之間序列的重組。利用了Cre-loxP特異位點重組系統切除轉基因植物中的標記基因已在煙草、擬南芥等植物上獲得成功(Gleave，A.P.，Mitra，D.S.andMorris，B.A.M.，1999，Selectablemarker-freetransgenicplantswithoutsexualcrossingtransientexpressionofCrerecombinaseanduseofaconditionallethaldominantgene.PlantMol.Biol.40，223-235)(ZuoJ，NiuQ.W.，2001，Chemical-regulated，site-specificDNAexcisionintransgenicplants.NatureBiotech.19157-161)。但有報道指出，在Cre-loxP系統中引入瞬時表達Cre重組酶的切除并不徹底、效率很低，還需要再一輪的組培再生過程，因此其可行性較差(ZuoJ，NiuQ.W.，2001，Chemical-regulated，site-specificDNAexcisionintransgenicplants.NatureBiotech.19157-161)。酵母FRT位點也是由34bp特異序列構成，其中8bp是核心序列，FLP是48KD的其專一重組酶蛋白。Lloyd等(1994)將酵母的FLP-FRT位點重組系統應用于煙草，實驗發(fā)現，FLP重組酶在植物組織中具有表達活性，可切除GUS標記基因，但重組酶表達效率較低，(Lloyd，A.M.，Davis，R.W.，1994，FunctionalexpressionoftheyeastFLP/FRTsite-specificrecombinationsysteminNicotianatabacum.Mol.Gen.Genet.242653-657)。而Zygosaccharomycesrouxii的R/RS系統和Mu噬菌體的Gin-gix重組酶系統，則與Cre-loxP和FLP-FRT系統相似，但在植物中還未見應用的報道。以上方法不僅效率低，而且均需要通過重組酶切除與后代的分離選擇過程，周期較長，工作量大。利用λ噬菌體attB-P系統不僅可以實現標記基因的自主剔除，且周期短，便于人為控制，還可以應用于無性繁殖植物。attB位點的序列段較短(21bp)，核心序列7bp，attP位點由352bp特異序列構成，同attB位點一樣，核心序列也為7bp。λ-att重組酶基因(INT)，可特異識別attB和att-P位點并進行位點間序列的特異切除。目前，利用att特異位點進行載體構建和基因克隆的申請專利僅有一項，是本申請人剔除一項發(fā)明創(chuàng)造，改發(fā)明的名稱為“一種位點重組反向克隆基因的方法及其利用”，申請?zhí)?1130855.9，改發(fā)明與本發(fā)明不同。利用att特異位點自主重組實現標記基因的剔除的文獻檢索到一篇，但其效率很低(ZubkoE，ScuttC，MeyerP.，2000，IntrachromosomalrecombinationbetweenattPregionsasatooltoremoveselectablemarkergenesfromtobaccotransgenes.NatureBiotech.18442-445)，沒有申請專利。迄今為止引入INT重組酶識別att位點切除標記基因的研究在植物上還未見相關報道和專利申請。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于利用λ噬菌體attP特異重組位點以及其重組酶基因INT，構建特殊的植物轉化載體并轉化植物，使轉基因植物能自主剔除本身攜帶的標記基因，獲得只含有目的基因的轉基因植株，有利于提高轉基因農產品的生物安全性。本發(fā)明通過下列方案實施一種能夠使轉基因植物自主剔除標記基因的方法，利用λ噬菌體識別序列(attP)特異重組位點及其重組酶基因(INT)，構建植物轉化載體pAMF，通過根癌農桿菌或其他植物遺傳轉化方法獲得該載體的轉化植株或愈傷組織。轉化植株自交選擇獲得純合，經地米塞松誘導后，從其自交分離后代中選擇剔除標記基因的植株；獲得的愈傷可通過地米塞松誘導，選取非抗性愈傷誘導成苗獲得無標記基因轉基因植株；通過PCR或Southern雜交分子鑒定方法進一步確認。能夠使轉基因植物自主剔除標記基因的方法按照下列步驟(1)根據λ噬菌體基因組序列設計引物分別獲得重組酶基因及其識別序列(attP)。擴增INT的正反引物分別是INTF5′-ATGGGAAGAAGGCGAAGTC-3′，INTB5′-TTATTTGATTTCAATTTTGTCCCAC-3′，擴增attP位點的正反引物分別是attPF5′-GATTGCGAGGCTTTGTGCTT-3′，attPB5′-GGCAGGGAGTGGGACAAAAT-3′；(2)構建植物轉化載體pAMF以pBI121質粒為基本載體，對其以PmeI酶切并用CIAP去磷酸化處理，以EcoRI酶切pGTP得到attP片段，并用T4DNA聚合酶末端補平。兩者回收產物連接后定名為pPBIP。以SdaI對pPBIP酶切，T4DNA聚合酶末端補平并用CIAP去磷酸化處理，以EcoRI酶切pGTP得到attP片段，并用T4DNA聚合酶末端補平。兩者回收產物連接后即構建成載體pMFB；質粒pTA7002進行SpeI酶切后用T4DNA聚合酶末端補平，以XhoI進行第二酶切，切膠回收；質粒pMDTINT以SacI酶切后用T4DNA聚合酶補平末端，以SalI進行第二酶切，切膠回收小片段；兩者回收產物連接，命名為pTAINT。對pTAINT進行SdaI和StuI雙酶切后T4DNA聚合酶補平末端，切膠回收小片段；對pMFB以HindIII酶切后T4DNA聚合酶補平末端，切膠回收；兩者回收產物連接從而將標記基因與重組酶基因一同構建至位點特異性重組識別序列之間，其中重組酶基因由地米塞松特異誘導表達，命名為pAMF，其中的GUS可替換成任意目的基因；(3)植物的遺傳轉化與純化通過基因槍或農桿菌介導方法，利用構建的植物轉化載體進行轉化，獲得轉基因植株，再通過篩選抗生素或篩選除草劑噴施法，進一步自交純化選擇，獲得該基因純合的單株或株系；(4)標記基因的剔除利用地米塞松誘導愈傷組織后，選取非抗性愈傷組織誘導成苗，即為剔除標記基因的轉基因植株；或通過對獲得的純合轉基因植株噴施地米塞松誘導，然后對其自交后代的幼苗噴施相應的選擇抗生素(例如在本發(fā)明的其中一個實施例番茄中，所采用的抗生素為100mg/L卡那霉素)，選擇對該抗生素敏感的植株，即為剔除標記基因的植株。(5)分子鑒定根據目的基因和標記基因設計特異引物或合成特異探針，同時對獲得的植株進行PCR擴增或Southern雜交檢測，標記基因為陰性而目的基因呈陽性的植株即為剔除標記基因的轉基因植株。更詳細的操作步驟如下列所述1.λ噬菌體位點特異性重組系統所需元件的克隆。根據λ噬菌體基因組序列(美國生物技術信息中心基因注冊號NC_001416)設計引物，分別獲得重組酶基因(INT)及其識別序列(attP)。擴增INT的正反引物分別是INTF5′-ATGGGAAGAAGGCGAAGTC-3′INTB5′-TTATTTGATTTCAATTTTGTCCCAC-3′attP位點的正反引物分別是attPF5′-GATTGCGAGGCTTTGTGCTT-3′attPB5′-GGCAGGGAGTGGGACAAAAT-3′PCR反應體系為在20μL反應體系中，分別加入13.65μLddH2O，1.5mM/LMgCl2，0.2mM/LdNTPs，0.5μM/L正向和反向引物，0.25μLλ噬菌體裂解物，0.5UTqDNA聚合酶。擴增INT的反應循環(huán)參數為94℃預變性3min，然后94℃1min，62℃1min，72℃1min30s，反應30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。擴增attP反應循環(huán)參數94℃預變性3min，然后94℃1min，56℃1min，72℃40s，反應30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。INT和attP的PCR特異片段經切膠回收。前者片段回收產物與pMD18-T載體(Takara公司)連接，而后者回收產物和pGEM-TEasy載體(Promega公司)連接，分別轉化大腸桿菌DH5α，抽提質粒進行酶切后電泳分析鑒定，獲得插入目的片段的重組克隆，分別命名為pMDTINT和pGTP。進一步序列分析證明，重組克隆pMDTINT和pGTP中插入片段分別為INT和attP位點。其序列分別如下INT序列(1071bp)ATGGGAAGAAGGCGAAGTCATGAGCGCCGGGATTTACCCCCTAACCTTTATATAAGAAACAATGGATATTACTGCTACAGGGACCCAAGGACGGGTAAAGAGTTTGGATTAGGCAGAGACAGGCGAATCGCAATCACTGAAGCTATACAGGCCAACATTGAGTTATTTTCAGGACACAAACACAAGCCTCTGACAGCGAGAATCAACAGTGATAATTCCGTTACGTTACATTCATGGCTTGATCGCTACGAAAAAATCCTGGCCAGCAGAGGAATCAAGCAGAAGACACTCATAAATTACATGAGCAAAATTAAAGCAATAAGGAGGGGTCTGCCTGATGCTCCACTTGAAGACATCACCACAAAAGAAATTGCGGCAATGCTCAATGGATACATAGACGAGGGCAAGGCGGCGTCAGCCAAGTTAATCAGATCAACACTGAGCGATGCATTCCGAGAGGCAATAGCTGAAGGCCATATAACAACAAACCATGTCGCTGCCACTCGCGCAGCAAAATCAGAGGTAAGGAGATCAAGACTTACGGCTGACGAATACCTGAAAATTTATCAAGCAGCAGAATCATCACCATGTTGGCTCAGACTTGCAATGGAACTGGCTGTTGTTACCGGGCAACGAGTTGGTGATTTATGCGAAATGAAGTGGTCTGATATCGTAGATGGATATCTTTATGTCGAGCAAAGCAAAACAGGCGTAAAAATTGCCATCCCAACAGCATTGCATATTGATGCTCTCGGAATATCAATGAAGGAAACACTTGATAAATGCAAAGAGATTCTTGGCGGAGAAACCATAATTGCATCTACTCGTCGCGAACCGCTTTCATCCGGCACAGTATCAAGGTATTTTATGCGCGCACGAAAAGCATCAGGTCTTTCCTTCGAAGGGGATCCGCCTACCTTTCACGAGTTGCGCAGTTTGTCTGCAAGACTCTATGAGAAGCAGATAAGCGATAAGTTTGCTCAACATCTTCTCGGGCATAAGTCGGACACCATGGCATCACAGTATCGTGATGACAGAGGCAGGGAGTGGGACAAAATTGAAATCAAATAA。②attP序列為(353bp)GATTGCGAGGCTTTGTGCTTCTCTGGAGTGCGACAGGTTTGATGACAAAAAATTAGCGCAAGAAGACAAAAATCACCTTGCGCTAATGCTCTGTTACAGGTCACTAATACCATCTAAGTAGTTGATTCATAGTGACTGCATATGTTGTGTTTTACAGTATTATGTAGTCTGTTTTTTATGCAAAATCTAATTTAATATATTGATATTTATATCATTTTACGTTTCTCGTTCAGCTTTTTTATACTAAGTTGGCATTATAAAAAAGCATTGCTTATCAATTTGTTGCAACGAACAGGTCACTATCAGTCAAAATAAAATCATTATTTGATTTCAATTTTGTCCCACTCCCTGCC。2.構建表達載體構建植物轉化載體pAMF。pAMF的T-DNA區(qū)內含有λ噬菌體重組酶基因(INT)、選擇標記基因和目的基因，INT和標記基因位于兩個λ噬菌體位點特異性重組位點attP正向重復序列之間，目的基因位于兩attP外側。其中重組酶基因(INT)由地米塞松誘導啟動子pDEX驅動(如圖2)。(1)pMFB的T-DNA區(qū)含有目的基因(圖中為GUS，可替換成任何目的基因)和選擇標記基因(可以是任何選擇標記基因)，選擇標記基因位于λ噬菌體位點特異性重組位點attP正向重復序列之間。其構建具體步驟如下以pBI121質粒(美國生物技術信息中心注冊號AF485783)為基本載體，對其以PmeI酶切并CIAP去磷酸化處理，以EcoRI酶切pGTP得到attP片段，并用T4DNA聚合酶末端補平。兩者回收產物連接從而將片段attP插入pBI121的PmeI位點，定名為pPBIP。以SdaI對pPBIP酶切，T4DNA聚合酶末端補平并用CIAP去磷酸化處理，以EcoRI酶切pGTP得到attP片段，并用T4DNA聚合酶末端補平。兩者回收產物連接從而將attP插入pPBIP的SdaI位點，構建成載體pMFB。(2)質粒pTA7002進行SpeI酶切后用T4DNA聚合酶末端補平，以XhoI進行第二酶切，切膠回收。質粒pMDTINT以SacI酶切后用T4DNA聚合酶補平末端，以SalI進行第二酶切，切膠回收小片段。兩者回收產物連接從而將INT構建至pTA7002的誘導性啟動子下游，命名為pTAINT。(3)對pTAINT進行SdaI和StuI雙酶切后T4DNA聚合酶補平末端，切膠回收小片段。對pMFB以HindIII酶切后T4DNA聚合酶補平末端，切膠回收。兩者回收產物連接從而將標記基因與重組酶基因一同構建至位點特異性重組識別序列attP之間，其中重組酶基因(INT)由地米塞松特異誘導表達，命名為pAMF，其中的GUS可替換成任意目的基因。3.植物的遺傳轉化通過農桿菌介導或其他轉基因方法把pAMF轉入植物，獲得轉化愈傷組織或轉基因植株，轉基因植株純化，獲得純合的轉基因植株或株系。農桿菌介導的遺傳轉化獲得轉基因番茄的步驟如下準備無菌苗子葉或下胚軸外植體，于KCMS上煙草懸浮細胞看護培養(yǎng)過夜(也可不用看護培養(yǎng))。用以MS0.2稀釋至O.D.≈0.3的農桿菌浸染外植體5分鐘，濾紙吸干，回接到預培養(yǎng)基(看護培養(yǎng)基)共培養(yǎng)2天，轉移到選擇再生培養(yǎng)基，待再生芽長至1cm左右，轉移至生根培養(yǎng)基。生根后煉苗移栽。轉基因植株純化步驟如下對于pAMF轉化的植株，收獲第一代種子即T1代。由于T1代進行了分離，利用選擇抗生素噴施法對轉基因植株的T1代植株進行了篩選，具有該抗生素抗性的植株為含有轉基因的純合與雜合植株，從T1代抗性植株上按單株收獲種子，即T2代。繼續(xù)利用抗生素噴施法選擇T2代植株，在T2代不再分離的株系，證明其對應的T1代植株為純合單株，該株系為純合株系。4.標記基因的剔除如果是轉化的愈傷組織，可利用地米塞松誘導，使INT重組酶表達，識別attP位點，特異切除兩位點間的重組酶本身和標記基因，切除標記基因的愈傷組織不具有標記基因相應的抗性，選取非抗性愈傷誘導成苗，即為剔除標記基因的轉基因植株。如果獲得了純合的轉基因植株，則通過噴施地米塞松誘導植株或種子，使INT重組酶表達，識別attP位點，特異切除兩位點間的重組酶本身和標記基因。切除標記基因的植株不具有標記基因相應的抗性，在選擇誘導植株的自交后代中即可選擇出來。即通過幼苗期間噴施一定濃度的相應的選擇抗生素(如卡那霉素或除草劑)，不具備抗性的植株通常出現白斑，這些植株即是剔除標記基因的植株。5.分子鑒定根據目的基因和標記基因設計特異引物或合成特異探針，同時對獲得的植株進行PCR擴增或Southern雜交檢測，標記基因為陰性而目的基因呈陽性的植株即可確定為剔除標記基因的轉基因植株。具體步驟可參見圖1所示。圖1.是本發(fā)明的流程圖；圖2.本發(fā)明的可自主剔除標記基因的植物轉化載體pAMF，GUS可替換成目的基因；圖3.本發(fā)明的可自主剔除標記基因NPTII的植物轉化載體pAMF1，目的基因為GNA；圖4.本發(fā)明的可自主剔除標記基因NPTII的植物轉化載體pAMF2，目的基因為CHITINASE；圖5.本發(fā)明實施例1分子鑒定結果，圖中1--未剔除標記基因的純合植株，2--剔除標記基因植株；380bp片段GNA片段，740bp片段標記基因NPTII片段。圖6.本發(fā)明實施例2分子鑒定結果，1、2未剔除標記基因的純合植株，3剔除標記基因植株；1180bp片段p35S-CHITINASE嵌合基因片段，740bp片段標記基因NPTII片段，400bp片段INT片段。具體實施例方式實例1無標記抗蚜蟲轉基因(GNA)油菜植株的獲得同翅目蚜蟲不僅咬傷作物，堵塞氣孔，更為嚴重的是，由于傷口導致病原體侵染，引起作物多種病害。據統計，蚜蟲是100多種不同病毒病害的傳播載體。雪花蓮凝集素基因(GalanthusnivalidAgglutinin，GNA)來源與植物雪花蓮，其表達產物專一抵抗同翅目昆蟲，對人和高等動物無害。目前該基因由水稻韌皮部特異表達啟動子驅動，已經轉移到水稻、番茄等作物中，具有良好的抗蚜蟲和抗病毒病效果。獲得無標記基因轉GNA的油菜步驟如下1.、構建載體利用本發(fā)明的載體pAMF進行改造，把水稻韌皮部特異啟動子RSsl與GNA構建成嵌合基因，替換pAMF中的目的基因及其啟動子，選擇標記基因NPTII和INT位于兩個attP位點之間，INT由地米塞松誘導型啟動子驅動。該載體命名為pAMF1。2.、油菜遺傳轉化利用根癌農桿菌介導的遺傳轉化法，把pAMF1載體中T-DNA區(qū)段導入油菜，以卡那霉素為選擇抗生素，獲得轉基因植株；3、轉基因植株的純化根據孟得爾的基因分離定律，利用選擇標記基因為篩選標記，通過卡那霉素噴施法(50mg/L)，在T1代中選擇出純合的單株和株系；4、標記基因的剔除對純合單株噴施地米塞松誘導表達，切除NPTII和INT本身，該單株進行自交，通過葉面噴施50mg/L的卡那霉素，后代中選擇對于卡那霉素沒有抗性的植株；5、分子鑒定選取對卡那霉素沒有抗性的植株，提取DNA，以NPTII、INT和GNA特異引物進行擴增，GNA鑒定為陽性而NPTII和INT鑒定為陰性的植株即為無標記基因的轉GNA油菜植株。PCR鑒定結果圖5。實例2無標記基因抗真菌病害轉基因(幾丁質酶基因，CHITINASE)番茄材料的選育幾丁質酶基因編碼產物為幾丁質酶EC.3.2.11.14是以幾丁質(聚乙酰氨基葡萄糖)為底物的一種水解酶幾丁質酶，可以分為不同的類別，總體上可分為酸性幾丁質酶和堿性幾丁質酶兩大類。幾丁質是許多病原真菌菌絲細胞壁的組成成分，幾丁質酶一方面可以直接降解真菌菌絲頂端的幾丁質從而抑制真菌的生長，另一方面則通過降解幾丁質后釋放大量的寡糖，寡糖作為激發(fā)子誘導植物產生抗病反應，從而有效抵擋病原真菌的進攻。因此，植物幾丁質酶對于防治農作物真菌性病害具有重要意義。1.、構建載體利用本發(fā)明的載體pAMF進行改造，把CHITINASE基因替換pAMF中的目的基因，選擇標記基因NPTII和INT位于兩個attP位點之間，INT由地米塞松誘導型啟動子驅動。該載體命名為pAMF2。2.、番茄遺傳轉化利用根癌農桿菌介導的遺傳轉化法，把pAMF2載體中T-DNA區(qū)段導入番茄，以卡那霉素為選擇抗生素，獲得轉基因植株；3、轉基因植株的純化根據孟得爾的基因分離定律，利用選擇標記基因為篩選標記，通過卡那霉素噴施法(100mg/L)，在T1代中選擇出純合的單株和株系；4、標記基因的剔除對純合單株噴施地米塞松誘導表達，切除NPTII和INT本身，該單株進行自交，后代中選擇對于卡那霉素沒有抗性的植株；5、分子鑒定提取對卡那霉素沒有抗性的植株DNA，以NPTII、INT和CHITINASE特異引物進行擴增，CHITINASE鑒定為陽性而NPTII和INT鑒定為陰性的植株即為無標記基因的轉CHITINASE番茄植株。PCR鑒定結果如圖6。權利要求1.一種能夠使轉基因植物自主剔除標記基因的方法，其特征在于，利用λ噬菌體識別序列(attP)特異重組位點及其重組酶基因(INT)，構建植物轉化載體pAMF，通過根癌農桿菌或其他植物遺傳轉化方法獲得該載體的轉化植株或愈傷組織。轉化植株自交選擇獲得純合，經地米塞松誘導后，從其自交分離后代中選擇剔除標記基因的植株；獲得的愈傷可通過地米塞松誘導，選取非抗性愈傷誘導成苗獲得無標記基因轉基因植株；通過PCR或Southern雜交分子鑒定方法進一步確認。2.根據權利要求1所述的方法，按照下列步驟(1)根據λ噬菌體基因組序列設計引物分別獲得重組酶基因及其識別序列(attP)。擴增INT的正反引物分別是INTF5′-ATGGGAAGAAGGCGAAGTC-3′，INTB5′-TTATTTGATTTCAATTTTGTCCCAC-3′，擴增attP位點的正反引物分別是attPF5′-GATTGCGAGGCTTTGTGCTT-3′，attPB5′-GGCAGGGAGTGGGACAAAAT-3′。(2)構建植物轉化載體pAMF以pBI121質粒為基本載體，對其以PmeI酶切并用CIAP去磷酸化處理，以EcoRI酶切pGTP得到attP片段，并用T4DNA聚合酶末端補平；兩者回收產物連接后命名為pPBIP；以SdaI對pPBIP酶切，T4DNA聚合酶末端補平并用CIAP去磷酸化處理，以EcoRI酶切pGTP得到attP片段，并用T4DNA聚合酶末端補平；兩者回收產物連接后即構建成載體pMFB；質粒pTA7002進行SpeI酶切后用T4DNA聚合酶末端補平，以XhoI進行第二酶切，切膠回收；質粒pMDTINT以SacI酶切后用T4DNA聚合酶補平末端，以SalI進行第二酶切，切膠回收小片段；兩者回收產物連接，命名為pTAINT；對pTAINT進行SdaI和StuI雙酶切后T4DNA聚合酶補平末端，切膠回收小片段；對pMFB以HindIII酶切后T4DNA聚合酶補平末端，切膠回收；兩者回收產物連接從而將標記基因與重組酶基因一同構建至位點特異性重組識別序列之間，其中重組酶基因由地米塞松特異誘導表達，命名為pAMF，其中的GUS可替換成任意目的基因；(3)植物的遺傳轉化與純化通過基因槍或農桿菌介導方法，利用構建的植物轉化載體進行轉化，獲得轉基因植株，再通過篩選抗生素或篩選除草劑噴施法，進一步自交純化選擇，獲得該基因純合的單株或株系；(4)標記基因的剔除利用地米塞松誘導愈傷組織后，選取非抗性愈傷組織誘導成苗，即為剔除標記基因的轉基因植株；或通過對獲得的純合轉基因植株噴施地米塞松誘導，然后對其自交后代的幼苗噴施相應的選擇抗生素，選擇對該抗生素敏感的植株，即為剔除標記基因的植株。(5)分子鑒定根據目的基因和標記基因設計特異引物或合成特異探針，同時對獲得的植株進行PCR擴增或Southern雜交檢測，標記基因為陰性而目的基因呈陽性的植株即為剔除標記基因的轉基因植株。全文摘要本發(fā)明屬于植物基因工程領域。利用λ噬菌體attP特異重組位點以及其重組酶基因INT，構建植物轉化載體pAMF，它含有重組酶基因INT、目的基因和選擇標記基因，INT由地米塞松特異誘導型啟動子驅動，和選擇標記基因共同位于兩個attP位點之間，目的基因位于attP位點外側。通過農桿菌轉化或其他方法獲得該載體的轉化植株或愈傷。轉化植株自交純化后，地米塞松誘導INT表達特異切除兩attP位點間的標記基因和本身，自交后從其分離后代中選無標記基因植株?；蚶玫孛兹烧T導愈傷使INT表達，特異切除兩位點間的INT本身和標記基因，切除標記基因的愈傷無標記基因抗性，選取非抗性愈傷誘導成苗即為無標記基因的轉基因植株，最后經過PCR或Southern分子檢測確認。文檔編號C12N15/52GK1618961SQ20031011141公開日2005年5月25日申請日期2003年11月19日優(yōu)先權日2003年11月19日發(fā)明者葉志彪,李漢霞,張俊紅,盧永恩,歐陽波申請人:華中農業(yè)大學