專利名稱：高親和力抗腫瘤壞死因子單克隆抗體的可變區(qū)基因及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種單克隆抗體基因，特別涉及一種高親和力抗腫瘤壞死因子單克隆抗體的可變區(qū)基因其制備方法。
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子(TNF)是由3個(gè)分子量為17kDa的亞單位組成的同源三聚體的可溶型蛋白質(zhì)，主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。體內(nèi)還存在分子量為26kDa的膜結(jié)合形式的TNF。TNF通過(guò)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)等黏附分子的表達(dá)，增加中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的黏附作用，刺激巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子和介質(zhì)，引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致骨和軟骨等組織的損傷。目前認(rèn)為革蘭氏陰性桿菌或腦膜炎球菌引起的彌漫性血管內(nèi)凝血、中毒性休克主要是由于細(xì)菌內(nèi)毒素刺激單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的TNF，引起發(fā)熱，心臟、腎上腺嚴(yán)重?fù)p害，呼吸循環(huán)衰竭，甚至引起死亡。TNF又稱惡液素(cachectin)，可誘發(fā)機(jī)體發(fā)生惡液質(zhì)(cachexia)。惡液質(zhì)主要表現(xiàn)為進(jìn)行性體重下降，食欲減退和頑固性機(jī)體消耗，其特征是肌肉和脂肪細(xì)胞衰竭(這是由于TNF使食欲減退，脂蛋白酶合成抑制所致)等。惡液質(zhì)導(dǎo)致腫瘤患者死亡率升高。高濃度TNF還可引起心臟血管的變化和代謝紊亂。引起人類艾滋病的人類免疫缺陷病毒(HIV)感染時(shí)，血清中TNF可升高，而且與腦部病變的嚴(yán)重程度相關(guān)。TNF與移植排斥有關(guān)，人骨髓移植后，如果TNF水平升高，常有合并癥發(fā)生；腎移植后發(fā)生排斥的患者，血清中TNF水平常見(jiàn)升高。局部缺血再灌注的動(dòng)物可引起TNF增加；TNF可能是急性肝壞死形成的重要因素。成人呼吸窘迫綜合征可能與缺血有關(guān)，其病情與支氣管肺泡液中TNF水平相關(guān)。心肌梗死和急性腦梗塞患者TNF水平升高與病情嚴(yán)重程度有關(guān)。TNF與多種自身免疫性疾病有關(guān)。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎局部TNF升高。TNF轉(zhuǎn)基因小鼠可誘發(fā)慢性炎癥性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，此變化可被有中和活性的TNF單克隆抗體(mAb)所阻斷。多發(fā)性硬化癥發(fā)病過(guò)程中，TNF可能與脫髓鞘病理變化有關(guān)。銀屑病局部和血清中TNF水平均見(jiàn)升高。節(jié)段性腸炎與TNF水平的升高有關(guān)。重癥肌無(wú)力和系統(tǒng)紅斑狼瘡(SLE)患者TNF可見(jiàn)升高。由此可見(jiàn)，TNF與感染性疾病、自身免疫性疾病、病毒感染、細(xì)菌感染、寄生蟲(chóng)感染、腫瘤等多種疾病有關(guān)。制定多種疾病生物學(xué)治療的策略中，TNF成為關(guān)鍵的靶位。
抗TNF抗體于1987年由Cerami等報(bào)導(dǎo)，并獲得專利(EPO Patentpublication 0212489，Mar.4，1987)。這些抗體被認(rèn)為在免疫診斷和治療細(xì)菌感染性休克方面具有重要的作用。同年，Rubin等報(bào)導(dǎo)了抗TNF的單克隆抗體，同時(shí)報(bào)導(dǎo)了分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞系、制備該抗體的方法，以及在免疫實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用，該抗體獲得了專利(EPO Patent publication 028868，Apr.22，1987)。Yone等于1988年報(bào)導(dǎo)了可用于免疫診斷的抗體，并獲得EPO專利。該抗體特別用于Kawasaki′s和細(xì)菌感染的診斷。Kawasaki′s病人的體液中TNF含量升高，與病情的發(fā)展有關(guān)。另外，還有許多針對(duì)重組TNF的單克隆抗體，其中一些具有中和活性，還有一些通過(guò)表位的篩選，構(gòu)建了測(cè)定TNF的ELISA方法和純化重組TNF的親和層析技術(shù)。
針對(duì)TNF的中和性抗血清或單克隆抗體在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)內(nèi)毒素和細(xì)菌引起的病理改變有明顯的阻斷作用。TNF通過(guò)與細(xì)胞表面的TNF受體結(jié)合發(fā)揮作用，目前認(rèn)為T(mén)NF與受體結(jié)合存在4個(gè)位點(diǎn)。中和性抗體主要通過(guò)對(duì)這4個(gè)位點(diǎn)的遮蓋而阻斷TNF的作用。TNF分子有20多種結(jié)合B細(xì)胞的表位，其中部分表位與受體結(jié)合位點(diǎn)重疊，結(jié)合這些表位的抗體具有中和活性，發(fā)揮對(duì)TNF的阻斷作用。具有中和活性鼠源性mAb以及來(lái)源于它們的片段均具有潛在的治療價(jià)值。然而，這些鼠源性mAb在人體使用時(shí)，由于其具有免疫原性，易引起人體的免疫反應(yīng)，這種免疫反應(yīng)可引起對(duì)抗體的清除以及免疫復(fù)合物介導(dǎo)的超敏反應(yīng)。為了解決上述問(wèn)題，建立了對(duì)鼠源性抗體改造的多種方法，如構(gòu)建嵌合抗體或人源化抗體。在嵌合抗體構(gòu)建過(guò)程中，最為重要的是獲得具有良好特異性和中和活性鼠源性親本抗體，克隆其輕鏈和重鏈可變區(qū)基因，然后將這兩條基因與人的抗體恒定區(qū)基因連接，構(gòu)建重組抗體基因。最后，將構(gòu)建好的人-鼠嵌合抗體基因?qū)胝婧思?xì)胞中表達(dá)。在臨床實(shí)驗(yàn)中，用抗TNF嵌合抗體治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和節(jié)段性腸炎取得了良好的效果，很好地控制了炎性反應(yīng)。美國(guó)FDA于1998年和1999年分別批準(zhǔn)抗TNF嵌合抗體用于臨床治療節(jié)段性腸炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。因此，篩選出高親和力及中和活性的鼠源單克隆抗體，從中克隆出輕、重鏈可變區(qū)基因，具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種高親和力抗TNF的可變區(qū)基因及其制備方法，并獲得有高親和力小鼠抗人TNF單克隆抗體(mAb)的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因的核苷酸序列(包括其高變區(qū)的核苷酸序列)以及該基因編碼的氨基酸序列。
實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)方案是(1)制備一組小鼠抗人TNF單克隆抗體，從中篩選出具有高親和力的抗人TNF單克隆抗體；(2)克隆該單克隆抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因；(3)獲得該單克隆抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因序列和氨基酸序列，確認(rèn)該基因序列和相應(yīng)蛋白序列的惟一性。
本發(fā)明選用高親和力F6雜交瘤細(xì)胞株，從中克隆出輕、重鏈可變區(qū)基因，測(cè)序后，得到其獨(dú)特的核苷酸序列，為構(gòu)建具有良好藥用價(jià)值的抗人TNF嵌合抗體和人源化抗體等打下了良好的基礎(chǔ)。高親和力F6mAb可制備測(cè)定體液中TNF的ELISA試劑盒，在自身免疫性疾病的診斷方面有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。另外，高親和力F6mAb可用于制備純化重組TNF的親和層析柱，在制備藥用重組人TNF等領(lǐng)域有很大的應(yīng)用價(jià)值。


圖1是本發(fā)明的F6VL基因(包括CDR1、CDR2和CDR3)序列及其編碼的氨基酸序列；圖2是本發(fā)明的F6VH基因序列(包括CDR1、CDR2和CDR3)及其編碼的氨基酸序列；圖3是F6VL基因序列和與其同源性最高的基因序列的同源性比較；圖4是F6VH基因序列和與其同源性最高的基因序列的同源性比較；圖5是F6VL氨基酸序列和與其同源性最高的氨基酸序列的同源性比較；圖6是F6VH氨基酸序列和與其同源性最高的氨基酸序列的同源性比較?；蛐蛄蠪6VL基因(包括CDR1、CDR2和CDR3)序列及其編碼的氨基酸序列10 ctgacccagtctccatcctccctggctatgtcagtaggacagaagL T Q S P S S L A M S V G Q K55 gtcactatgaactgcaagtccagtcagagccttttaaatagttacV T M N CK S S Q S L L N S Y100 actcagaagaactatttggcctggtaccagcagaaaccaggacagT Q K N Y L AW Y Q Q K P G Q145 tctcctaaacttctggtatactttgcatccactagggagtctgggS P K L L V YF A S T R E SG190 gtccctgatcgcttcatgggcagtggatctgggacagatttcactV P D R F M G S G S G T D F T235 cttaccatcagcagtgtgcagactgaagacctggcagattacttcL T I S S V Q T E D L A D Y F280 tgtcagcaacattataggattccattcacgttcggctcggggaccCQ Q H Y R I P F TF G S G T325 aagctggagatctaa 339K L E I *CDR1aagtccagtcagagccttttaaatagttacactcagaagaactatttggccK S S Q S L L N S Y T Q K N Y L ACDR2tttgcatccactagggagtctF A S T R E SCDR3cagcaacattataggattccattcacgQ Q H Y R I P F TF6VH基因序列(包括CDR1、CDR2和CDR3)及其編碼的氨基酸序列9 ctgcaggagtcaggacctggcctcgtgaaaccttctcagtctctg
L Q E S G P G L V K P S Q S L54 tctctcacctgctctgtctctggctactccatcaccagtggttatS L T C S V S G Y S I TS G Y99 ttctggaactggatccggcagttttcaggaaacaaattggaatggF W NW I R Q F S G N K L E W144 atgggctacataagctacgacggtagcaataactacaacccatctM GY I S Y D G S N N Y N P S189 ctcaaaaatcgaatctccatcactcgtgacacatctaagaaccagL K NR I S I T R D T S K N Q234 tttttcctgaagttgaattctgtgactcctgaggacacagctacaF F L K L N S V T P E D T A T279 tattactgtgcaagagatggtgactactactttgactactggggcY Y C A RD G D Y Y F D YW G324 caagggaccacggtcaccgtctcctca 350Q G T T V T V S SCDR1agtggttatttctggaacS G Y F W NCDR2tacataagctacgacggtagcaataactacaacccatctctcaaaaatY I S Y D G S N N Y N P S L K NCDR3gatggtgactactactttgactacD G D Y Y F D Y具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
可變區(qū)基因的完整核苷酸序列、其功能性片段的核苷酸序列(如CDR等)以及抗體可變區(qū)的氨基酸序列等，是嵌合抗體和人源化抗體構(gòu)建的基礎(chǔ)。為此，申請(qǐng)人用重組人TNF免疫BALB/c小鼠，制備了一組小鼠抗人TNF單克隆抗體。利用間接ELISA方法篩選出高親和力F6 mAb，并利用單抗阻斷TNF誘導(dǎo)L929細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)，單抗阻斷TNF誘導(dǎo)ECV304細(xì)胞ICAM-1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)，以及單抗阻斷TNF誘導(dǎo)NF-κB核轉(zhuǎn)位的實(shí)驗(yàn)等，鑒定F6 mAb具有較高的中和活性。該株雜交瘤細(xì)胞，具有穩(wěn)定分泌抗體的能力。
1.技術(shù)方案及其路線1.1小鼠抗人TNF高中和活性單克隆抗體的制備1.1.1單克隆抗體的制備、純化按常規(guī)方法，用重組人TNF(購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)生物技術(shù)中心)免疫BALB/c小鼠(購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，制備一組小鼠抗人TNF單克隆抗體。按常規(guī)方法制備腹水。腹水經(jīng)硫酸銨沉淀后，采用QFF陰離子交換層析法純化。用SDS-PAGE鑒定純化抗體的純度，純化的F6 mAb純度達(dá)到94％。
1.1.2 TNF mAb親和力的測(cè)定用間接ELISA方法測(cè)定純化前后單抗的相對(duì)親和力的大小。篩選出高親和力F6 mAb，純化前的效價(jià)為1×10-7，純化后效價(jià)為2ng/ml。
1.1.3 TNF mAb抑制TNF誘導(dǎo)L929細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)用10％FCS DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)L929細(xì)胞(購(gòu)置于武漢CCTCC)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，加入至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl，培養(yǎng)過(guò)夜。另取96孔板，加入TNF(購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)生物技術(shù)中心)、放線菌素D(購(gòu)自華美公司)、不同濃度mAb或?qū)φ湛贵w，37℃孵育1h后轉(zhuǎn)入已鋪有L929細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl，TNF和放線菌素D的濃度分別為20U/ml和0.35μg/ml。同時(shí)設(shè)TNF(無(wú)mAb)和空白對(duì)照(無(wú)mAb和TNF)，繼續(xù)培養(yǎng)16h，鏡檢后，用結(jié)晶紫染色，用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm波長(zhǎng)的OD值。結(jié)果顯示，F(xiàn)6 mAb對(duì)TNF(20U/ml)誘導(dǎo)L929細(xì)胞凋亡的抑制作用呈劑量依賴關(guān)系，能夠使50％L929細(xì)胞存活的F6 mAb的濃度為0.50μg/ml。
1.1.4 TNF mAb抑制TNF上調(diào)ECV304細(xì)胞ICAM-1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)ECV304細(xì)胞(購(gòu)置于武漢CCTCC)用10％FCS RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/ml，鋪于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)5h，使細(xì)胞貼壁。另取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入TNF、不同濃度mAb和對(duì)照抗體，37℃孵育1h后，轉(zhuǎn)入已鋪有ECV304細(xì)胞的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，TNF濃度為200U/ml，并設(shè)TNF(無(wú)mAb)和空白(無(wú)mAb和TNF)對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，消化、洗滌，用滅活兔血清封閉后，加入FITC標(biāo)記的抗人ICAM-1抗體(購(gòu)置于Ancell公司)或抗小鼠IgGl對(duì)照抗體(購(gòu)自Serotec公司)，洗滌后，加入固定液，采用流式細(xì)胞術(shù)分析。結(jié)果表明，濃度為1.0μg/ml的F6 mAb對(duì)TNF上調(diào)ICAM-1表達(dá)水平的抑制率為60.1％。即使F6 mAb在0.1μg/ml的低濃度條件下，抑制率仍可達(dá)到59.0％，抑制作用呈劑量依賴關(guān)系。
1.1.5 TNF mAb抑制TNF誘導(dǎo)ECV304細(xì)胞NF-κB核轉(zhuǎn)位的實(shí)驗(yàn)ECV304細(xì)胞用10％FCS RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。調(diào)整對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ECV304細(xì)胞濃度為5×104/ml，鋪于75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。待細(xì)胞鋪滿80％培養(yǎng)瓶底面積時(shí)，加入預(yù)先用不同濃度F6 mAb和對(duì)照mAb孵育的TNF，同時(shí)設(shè)立TNF(無(wú)mAb)和靜止細(xì)胞(無(wú)mAb和TNF)對(duì)照。細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF的濃度為200U/ml，mAb的濃度為10μg/ml或0.1μg/ml。刺激細(xì)胞1h后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用4℃預(yù)冷的0.15M pH7.4 PBS洗滌細(xì)胞2次，以除去殘留培養(yǎng)液。將細(xì)胞在冰浴上刮至10ml PBS中，4℃ 1200rpm離心6min后棄上清，并于細(xì)胞沉淀中加入400μl 4℃預(yù)冷的緩沖液A(10mM pH7.9 HEPES、10mM KCl、0.1mM EDTA、1mM DTT和0.5mM PMSF)。冰浴放置15min后，加入25μl 10％NP-40，渦旋振蕩15s。4℃ 13 000rpm離心30min后棄上清，并用緩沖液A洗滌沉淀。于沉淀中加入100μl緩沖液B(20mM pH7.9 HEPES、400mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT和1mM PMSF)，冰浴放置15min，間以渦旋攪拌。4℃ 13 000rpm離心10min后收集上清液，用Bradford法測(cè)定其蛋白含量后，置-70℃保存。凝膠遷移試劑盒和DNA 5′-端探針標(biāo)記試劑盒均購(gòu)自Promega公司。[γ-32P]ATP購(gòu)自Amersham公司。用凝膠遷移實(shí)驗(yàn)鑒定mAb抑制TNF誘導(dǎo)ECV304細(xì)胞NF-κB核轉(zhuǎn)位的作用，按試劑盒說(shuō)明書(shū)所述操作。結(jié)果顯示，F(xiàn)6 mAb在濃度為10μg/ml和0.1μg/ml的抑制率分別為70.3％和49.5％。
總之，用上述3種方法在不同水平的鑒定結(jié)果表明，F(xiàn)6 mAb有良好的中和活性。
1.2 F6 mAb輕、重鏈可變區(qū)基因的克隆按下述方案，克隆編碼其輕、重鏈可變區(qū)基因。
1.2.1 F6雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)按常規(guī)方法復(fù)蘇F6細(xì)胞，用含10％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)。
1.2.2總RNA的提取用TRIZOL Reagent(購(gòu)自GIBCO公司)，按說(shuō)明書(shū)提取總RNA。
1.2.3 RT-PCR法擴(kuò)增F6VL和F6VH基因一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自TakaRa公司，按試劑盒說(shuō)明書(shū)擴(kuò)增F6VL和F6VH基因。以VLFOR和VLBACK以及VHFOR和VHBACK兩對(duì)引物，以總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)體積50μl，反應(yīng)條件為94℃ 5min；95℃ 30s，58℃ 1min，72℃ 1min，循環(huán)35次；72℃ 7min。引物序列為VLFOR Gtt aga tct cca gct tgg tcc cVLBACKGac att cag ctg acc cag tct ccaVHFOR Tga gga gac ggt gac cgt ggt ccc ttg gcc cca gVHBACKAgg tsm arc tgc ags agt cwg g1.2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和篩選PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，用小量膠回收試劑盒(購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司)回收所需的片段，用DNA連接試劑盒(購(gòu)自TakaRa公司)將該片段按說(shuō)明書(shū)插入pMD-T18載體(購(gòu)自TakaRa公司)中。連接物轉(zhuǎn)化E.coli XL-10(購(gòu)自北京CGMCC)。以1μl細(xì)菌液為模板，用前述引物，用PCR法篩選重組陽(yáng)性克隆。用雙脫氧核酸末端終止法測(cè)定基因序列(由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成)，測(cè)定結(jié)果參見(jiàn)附圖1和附圖2。
1.3 F6 mAb輕、重鏈可變區(qū)基因的同源性分析確定測(cè)序無(wú)誤后，按下述技術(shù)方案，鑒定基因的同源性。
1.3.1在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行核苷酸序列同源性分析(Blastn)分析結(jié)果表明，F(xiàn)6 mAb輕鏈可變區(qū)基因與編號(hào)為gi|5853199|gb|AF178608.1|AF178608的重排的小鼠Ig的輕鏈可變區(qū)同源性最高，同源性為309/322(95％)，(見(jiàn)附圖3)；F6 mAb重鏈可變區(qū)基因與編號(hào)為gi|11464724|gb|AF261879.1|AF261879的小鼠Ig重鏈可變區(qū)同源性最高，同源性為336/350(96％)(見(jiàn)附圖4)。
1.3.2將可變區(qū)基因翻譯成氨基酸序列，在non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+PIR+PRF蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行氨基酸序列同源性分析(B1astp)。分析結(jié)果表明，F(xiàn)6 mAb輕鏈氨基酸序列與編號(hào)為gi|7513693|pir||S68212小鼠Igκ鏈(Mab03-1)同源性最高，同源性為98/109(89％)，(見(jiàn)附圖5)；F6 mAb重鏈氨基酸序列與編號(hào)為gi|12805257|gb|AAH02091.1|的小鼠Ig重鏈蛋白的同源性最高，同源性為100/114(87％)(見(jiàn)附圖6)。
2.技術(shù)效果本發(fā)明采用重組人TNF免疫BALB/c小鼠，制備出一組小鼠抗人TNF mAbs。采用間接ELISA方法篩選出高親和力F6 mAb，純化前的效價(jià)為1×10-7，純化后效價(jià)為2ng/ml。高親和力F6 mAb可制備測(cè)定體液中TNF的ELISA試劑盒，在自身免疫性疾病的診斷方面有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。另外，高親和力F6 mAb可用于制備純化重組TNF的親和層析柱。依據(jù)TNF參與炎癥性病理?yè)p傷的主要機(jī)制，通過(guò)體外阻斷實(shí)驗(yàn)，證實(shí)F6 mAb具有較高的中和活性。在20U/ml TNF誘導(dǎo)L929細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)中，能保護(hù)50％L929細(xì)胞存活的F6 mAb的濃度為0.50μg/ml。在200U/ml TNF上調(diào)ECV304細(xì)胞ICAM-1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中，濃度為的1.0μg/ml的F6 mAb對(duì)誘導(dǎo)性ICAM-1表達(dá)的抑制率為60.1％。在200U/ml TNF誘導(dǎo)ECV304細(xì)胞NF-κB核轉(zhuǎn)位的實(shí)驗(yàn)中，濃度為的10μg/m1的F6 mAb對(duì)NF-κB的抑制率為70.3％。表明F6單抗對(duì)TNF的生物學(xué)作用有中和活性，編碼該可變區(qū)的基因序列在構(gòu)建對(duì)炎癥、自身免疫性疾病等有治療作用的嵌合抗體和人源化抗體等方面有巨大的潛在價(jià)值。
另外，編碼F6 mAb的輕、重鏈可變區(qū)基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分析，未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明相同的基因序列，因此本發(fā)明具有惟一性和自主的知識(shí)產(chǎn)權(quán)。
3.最佳實(shí)施方式(1)人-鼠抗TNF嵌合抗體的構(gòu)建將本發(fā)明的F6 mAb輕、重鏈可變區(qū)基因可插入通用型嵌合抗體的表達(dá)載體中，獲得的嵌合基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，用于制備對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和節(jié)段性腸炎等疾病有治療作用的嵌合抗體。
(2)人源化抗體的構(gòu)建將本發(fā)明的F6 mAb輕、重鏈可變區(qū)基因的CDR區(qū)移植到人源可變區(qū)的FR中，形成CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)也稱重構(gòu)抗體(reshaping antibody)或人源化抗體(humanized antibody)。利用CDR移植技術(shù)改造抗體，可以獲得保持鼠源性親本mAb的特異性，而又更加接近人抗體的新型抗體，用于制備對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和節(jié)段性腸炎等疾病有治療作用的人源化抗體。
(3)可能根據(jù)本發(fā)明的基因序列及其編碼的氨基酸序列，制備針對(duì)人TNF功能表位的其它生物制品(如單鏈抗體等)。
(4)TNF的ELISA試劑盒的制備采用F6 mAb與結(jié)合不同表位的抗TNFmAb配對(duì)，建立夾心ELISA試劑盒，可測(cè)定病人體液中TNF含量，在炎癥、自身免疫性疾病的診斷方面有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
(5)純化重組TNF的親和層析柱制備用高親和力F6 mAb交聯(lián)固相載體，填充分離柱，制備親和層析柱，在重組人TNF的制備方面有很大的應(yīng)用價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一種高親和力抗腫瘤壞死因子單克隆抗體的可變區(qū)基因，其特征在于，包括F6VL和F6VH基因序列和氨基酸序列分別為F6VL基因序列和氨基酸序列包括CDR1、CDR2和CDR3核苷酸序列和氨基酸序列如下10 ctgacccagtctccatcctccctggctatgtcagtaggacagaagL T Q S P S S L A M S V G Q K55 gtcactatgaactgcaagtccagtcagagccttttaaatagttacV T M N CK S S Q S L L N S Y100 actcagaagaactatttggcctggtaccagcagaaaccaggacagT Q K N Y L AW Y Q Q K P G Q145 tctcctaaacttctggtatactttgcatccactagggagtctgggS P K L L V YF A S T R E SG190 gtccctgatcgcttcatgggcagtggatctgggacagatttcactV P D R F M G S G S G T D F T235 cttaccatcagcagtgtgcagactgaagacctggcagattacttcL T I S S V Q T E D L A D Y F280 tgtcagcaacattataggattccattcacgttcggctcggggaccCQ Q H Y R I P F TF G S G T325 aagctggagatctaa 339K L E I *CDR1aagtccagtcagagccttttaaatagttacactcagaagaactatttggccK S S Q S L L N S Y T Q K N Y L ACDR2tttgcatccactagggagtctF A S T R E SCDR3cagcaacattataggattccattcacgQ Q H Y R I P F TF6VH基因序列和氨基酸序列包括CDR1、CDR2和CDR3核苷酸序列和氨基酸序列如下9 ctgcaggagtcaggacctggcctcgtgaaaccttctcagtctctgL Q E S G P G L V K P S Q S L54 tctctcacctgctctgtctctggctactccatcaccagtggttatS L T C S V S G Y S I TS G Y99 ttctggaactggatccggcagttttcaggaaacaaattggaatggF W NW I R Q F S G N K L E W144 atgggctacataagctacgacggtagcaataactacaacccatctM GY I S Y D G S N N Y N P S189 ctcaaaaatcgaatctccatcactcgtgacacatctaagaaccagL K NR I S I T R D T S K N Q234 tttttcctgaagttgaattctgtgactcctgaggacacagctacaF F L K L N S V T P E D T A T279 tattactgtgcaagagatggtgactactactttgactactggggcY Y C A RD G D Y Y F D YW G324 caagggaccacggtcaccgtctcctca 350Q G T T V T V S SCDR1agtggttatttctggaacS G Y F W NCDR2tacataagctacgacggtagcaataactacaacccatctGtcaaaaatY I S Y D G S N N Y N P S L K NCDR3gatggtgactactactttgactacD G D Y Y F D Y
2.一種高親和力抗腫瘤壞死因子單克隆抗體的可變區(qū)基因的制備方法，其特征在于，按以下步驟進(jìn)行1)TNF單克隆抗體的制備、純化和篩選用重組人TNF免疫BALB/c小鼠，制備一組小鼠抗人TNF單克隆抗體mAbs，按常規(guī)方法制備腹水；腹水經(jīng)硫酸銨沉淀后，采用QFF陰離子交換層析法純化，用SDS-PAGE鑒定抗體純度；用間接ELISA法，從中篩選出高親和力F6mAb；用mAb抑制TNF誘導(dǎo)L929細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)，mAb抑制TNF上調(diào)ECV304細(xì)胞ICAM-1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)，以及mAb抑制TNF誘導(dǎo)ECV304細(xì)胞NF-κB核轉(zhuǎn)位的實(shí)驗(yàn)，鑒定mAb的中和活性。2)F6 mAb輕、重鏈可變區(qū)基因的克隆按下述步驟克隆編碼其輕、重鏈可變區(qū)基因①F6雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)按常規(guī)方法復(fù)蘇F6細(xì)胞，用含10％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)；②總RNA的提取用TRIZOL Reagent提取總RNA；③RT-PCR法擴(kuò)增F6VL和F6VH基因用VLFOR和VLBACK以及VHFOR和VHBACK兩對(duì)引物，以總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR；反應(yīng)條件為94℃ 5min；95℃ 30s，58℃ 1min，72℃ 1min，循環(huán)35次；72℃7min。引物序列為VLFOR Gtt aga tct cca gct tgg tcc cVLBACKGac att cag ctg acc cag tct ccaVHFOR Tga gga gac ggt gac cgt ggt ccc ttg gcc cca gVHBACKAgg tsm arc tgc ags agt cwg g④PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和篩選PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，回收所需的片段，并將該片段插入pMD-T18載體中，連接物轉(zhuǎn)化E.coli XL-10，用PCR篩選重組陽(yáng)性克隆，用雙脫氧核酸末端終止法測(cè)定基因序列；3)F6 mAb輕、重鏈可變區(qū)基因的同源性分析確定測(cè)序無(wú)誤后，在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行核苷酸序列同源性分析，并將可變區(qū)基因翻譯成氨基酸序列，在non-redundantGenBank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行氨基酸序列同源性分析，鑒定基因的同源性。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種高親和力抗腫瘤壞死因子(TNF)單克隆抗體(F6 mAb)的可變區(qū)基因的制備方法。用重組人TNF免疫BALB/c小鼠，制備一組小鼠抗人TNF單克隆抗體。應(yīng)用間接ELISA方法篩選出高親和力的F6 mAb。體外阻斷實(shí)驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)6 mAb具有較高中和活性。克隆該單克隆抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因，獲得該單克隆抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因序列和氨基酸序列，確認(rèn)該基因序列和蛋白序列的唯一性。編碼該可變區(qū)的基因序列在構(gòu)建對(duì)炎癥、自身免疫性疾病等有治療作用的嵌合抗體和人源化抗體等方面有巨大的潛在價(jià)值。高親和力F6 mAb可制備測(cè)定體液中TNF的ELISA試劑盒，在炎癥、自身免疫性疾病的診斷方面有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。另外，高親和力F6 mAb可用于制備純化重組TNF的親和層析柱。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1544466SQ200310105919
公開(kāi)日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2003年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月13日
發(fā)明者金伯泉, 劉雪松, 朱參勝, 楊琨 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)