專利名稱：：用于在植物中表達(dá)基因的種子特異性u(píng)sp啟動(dòng)子的制作方法本申請(qǐng)要求享有2002年5月3日申請(qǐng)的在先臨時(shí)申請(qǐng)US60/377,236的優(yōu)先權(quán)和利益。本發(fā)明涉及植物遺傳工程領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明涉及種子特異性基因表達(dá)。本發(fā)明提供能夠在種子中轉(zhuǎn)錄異源核酸序列的啟動(dòng)子，和改進(jìn)、制備和使用該啟動(dòng)子的方法。種子給人和家畜提供重要的食物蛋白來源。但是，種子中的蛋白含量往往是不完全的。例如，許多種子蛋白缺乏一種或多種必需氨基酸?？朔@種缺陷可以通過遺傳改進(jìn)天然或非天然的蛋白質(zhì)，使之具有營養(yǎng)更加全面的氨基酸組成(或某些其他的期望特性)，并且在轉(zhuǎn)基因植物中過量表達(dá)改進(jìn)的蛋白質(zhì)。此外，一種或多種基因可以被導(dǎo)入到農(nóng)作物中來控制代謝路徑和改進(jìn)游離氨基酸的含量。這些方法可以用于制備具有重要的農(nóng)業(yè)(如產(chǎn)量)、營養(yǎng)學(xué)和藥學(xué)特性的農(nóng)作物。盡管許多分子工具是有效的，種子的遺傳修飾常常受到不能有效沉積被加工的蛋白的限制。許多細(xì)胞內(nèi)過程可能影響蛋白質(zhì)的總沉積，包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)組裝和折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)和蛋白質(zhì)水解。干擾這些過程的一種或多種能夠增加在遺傳工程種子中生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的含量?；?qū)霑?huì)對(duì)植物生長和發(fā)育產(chǎn)生有害作用。在這種情況下，基因表達(dá)需要被限制在期望的目標(biāo)組織中。例如，有必要以種子特異性或種子增強(qiáng)的方式表達(dá)氨基酸異?；?，以避免產(chǎn)生影響產(chǎn)量或其他農(nóng)學(xué)性狀的不期望的表型?；虻膯?dòng)子部分在控制基因表達(dá)中起關(guān)鍵作用。在啟動(dòng)子區(qū)，轉(zhuǎn)錄元件被組裝，轉(zhuǎn)錄被起始。相對(duì)于隨后的基因表達(dá)階段，該早期步驟通常是關(guān)鍵的調(diào)控步驟。啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始可以以多種方式被調(diào)控。例如，啟動(dòng)子可以被存在特定化合物誘導(dǎo)，僅在特定組織中表達(dá)基因，或者組成型地表達(dá)編碼序列。因此，改進(jìn)編碼序列的轉(zhuǎn)錄可以通過可操作地將編碼序列連接到具有不同調(diào)控特性的啟動(dòng)子上。發(fā)明概述本發(fā)明包括和提供含有包含啟動(dòng)子的核酸分子的被轉(zhuǎn)化的植物，該啟動(dòng)子包含在嚴(yán)緊條件下與選自SEQIDNO1，2，3，4，9，10，或11的核酸序列及其互補(bǔ)體雜交的核酸序列。本發(fā)明包括和提供含有包含被可操作地連接到結(jié)構(gòu)性核酸序列的啟動(dòng)子的核酸分子的被轉(zhuǎn)化的植物，該啟動(dòng)子包含選自SEQIDNO1，2，3，4，9，10，或11及其互補(bǔ)體的核酸序列。本發(fā)明包括和提供含有包含啟動(dòng)子的核酸分子的被轉(zhuǎn)化的植物，該啟動(dòng)子包含的核酸序列選自與SEQIDNO1或其互補(bǔ)體具有超過約85.5％同一性的核酸序列，與SEQIDNO2或其互補(bǔ)體具有超過約85.5％同一性的核酸序列，與SEQIDNO3或其互補(bǔ)體具有超過約97.1％同一性的核酸序列，與SEQIDNO4或其互補(bǔ)體具有超過約96.4％同一性的核酸序列。本發(fā)明包括和提供制備被轉(zhuǎn)化的植物的方法，包括提供包含被可操作地連接到結(jié)構(gòu)性核酸序列的啟動(dòng)子的核酸分子，該啟動(dòng)子包含選自SEQIDNO1，2，3，4，9，10，或11及其互補(bǔ)體的核酸序列；和用所述核酸分子轉(zhuǎn)化植物。本發(fā)明包括和提供在種子中表達(dá)結(jié)構(gòu)核酸分子的方法，包括種植含有包含被可操作地連接到結(jié)構(gòu)性核酸序列的啟動(dòng)子的核酸分子的被轉(zhuǎn)化植物，該啟動(dòng)子包含選自SEQIDNO1，2，3，4，9，10，或11及其互補(bǔ)體的核酸序列，其中所述被轉(zhuǎn)化的植物生產(chǎn)所述種子，并且所述結(jié)構(gòu)核酸分子在所述分子中被轉(zhuǎn)錄；和分離所述種子。本發(fā)明包括和提供一種獲得結(jié)構(gòu)核酸分子的產(chǎn)物生成升高的種子的方法，包括種植含有包含被可操作地連接到所述結(jié)構(gòu)性核酸分子的啟動(dòng)子的核酸分子的被轉(zhuǎn)化植物，該啟動(dòng)子包含選自SEQIDNO1，2，3，4，9，10，或11及其互補(bǔ)體的核酸序列，其中所述被轉(zhuǎn)化的植物生產(chǎn)所述種子，并且所述結(jié)構(gòu)核酸分子在所述種子中被轉(zhuǎn)錄；和從所述轉(zhuǎn)化植物中分離所述種子。本發(fā)明包括和提供獲得結(jié)構(gòu)核酸分子的產(chǎn)物生成升高的食物(meal)的方法，包括種植含有包含被可操作地連接到所述結(jié)構(gòu)性核酸序列的啟動(dòng)子的核酸分子的被轉(zhuǎn)化植物，該啟動(dòng)子包含選自SEQIDNO1，2，3，4，9，10，或11及其互補(bǔ)體的核酸序列，其中所述被轉(zhuǎn)化的植物生產(chǎn)所述種子，并且所述結(jié)構(gòu)核酸分子在所述種子中被轉(zhuǎn)錄；和制備包含所述被轉(zhuǎn)化植物或其部分的所述食物。本發(fā)明包括和提供獲得促進(jìn)結(jié)構(gòu)核酸分子的產(chǎn)物生成的原種的方法，包括種植含有包含被可操作地連接到所述結(jié)構(gòu)性核酸分子的啟動(dòng)子的核酸分子的被轉(zhuǎn)化植物，該啟動(dòng)子包含選自SEQIDNO1，2，3，4，9，10，或11及其互補(bǔ)體的核酸序列，其中所述被轉(zhuǎn)化的植物生產(chǎn)所述種子，并且所述結(jié)構(gòu)核酸分子在所述種子中被轉(zhuǎn)錄；和制備包含所述被轉(zhuǎn)化植物或其部分的所述原種。本發(fā)明包括和提供獲得結(jié)構(gòu)核酸分子的產(chǎn)物生成升高的油的方法，包括種植含有包含被可操作地連接到所述結(jié)構(gòu)性核酸序列的啟動(dòng)子的核酸分子的被轉(zhuǎn)化植物，該啟動(dòng)子包含在嚴(yán)緊條件下與選自SEQIDNO1，2，3，4，9，10，或11及其互補(bǔ)體的核酸序列雜交的核酸序列，其中所述被轉(zhuǎn)化的植物生產(chǎn)種子，并且所述結(jié)構(gòu)核酸分子在所述種子中被轉(zhuǎn)錄；和分離所述油。本發(fā)明包括和提供一種含有載體的細(xì)胞，該載體包含選自SEQIDNO1，2，3，4，9，10，或11及其互補(bǔ)體的核酸序列。本發(fā)明包括和提供由一種或多種被轉(zhuǎn)化的植物的種子制備的油，該被轉(zhuǎn)化的植物含有包含啟動(dòng)子的核酸序列，該啟動(dòng)子包含選自SEQIDNO1，2，3，4，9，10，或11及其互補(bǔ)體的核酸序列。本發(fā)明包括和提供由一種或多種被轉(zhuǎn)化的植物的種子制備的油，該被轉(zhuǎn)化的植物含有包含可操作地連接到結(jié)構(gòu)性核酸序列的啟動(dòng)子的核酸序列，該啟動(dòng)子包含選自SEQIDNO1，2，3，4，9，10，或11及其互補(bǔ)體的核酸序列，其中該啟動(dòng)子相對(duì)于結(jié)構(gòu)性核酸序列來說是異源的。本發(fā)明包括和提供從含有核酸分子的被轉(zhuǎn)化植物中生成的種子，該核酸分子包括包含選自SEQIDNO1，2，3，4，9，10，或11及其互補(bǔ)體的核酸序列的啟動(dòng)子。本發(fā)明包括和提供包含含有核酸分子的被轉(zhuǎn)化植物或其部分的原種，該核酸分子包含啟動(dòng)子，啟動(dòng)子包含選自SEQIDNO1，2，3，4，9，10，或11及其互補(bǔ)體的核酸序列。本發(fā)明包括和提供包含來自含有核酸分子的被轉(zhuǎn)化植物的植物原料的食物，該核酸分子包含啟動(dòng)子，啟動(dòng)子包含選自SEQIDNO1，2，3，4，9，10，或11及其互補(bǔ)體的核酸序列。本發(fā)明包括和提供種子容器(container)，其中至少約25％的所述種子包含被可操作地連接到結(jié)構(gòu)性核酸序列的包含選自SEQIDNO1，2，3，4，9，10，或11及其互補(bǔ)體的核酸序列的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子相對(duì)于結(jié)構(gòu)性核酸序列來說是異源的。本發(fā)明包括和提供一種基本上純的核酸分子，其包含選自SEQIDNO1，2，3，4，9，10，或11及其互補(bǔ)體的核酸序列本發(fā)明包括和提供一種基本上純的核酸分子，該核酸分子具有的核酸序列選自與SEQIDNO1或其互補(bǔ)體具有超過約85.5％同一性的核酸序列，與SEQIDNO2或其互補(bǔ)體具有超過約85.5％同一性的核酸序列，與SEQIDNO3或其互補(bǔ)體具有超過約97.1％同一性的核酸序列，與SEQIDNO4或其互補(bǔ)體具有超過約96.4％同一性的核酸序列。本發(fā)明包括和提供含有包含啟動(dòng)子的核酸分子的被轉(zhuǎn)化的大豆植物，該啟動(dòng)子包含在嚴(yán)緊條件下與選自SEQIDNO1，2，3，4，9，10，或11及其互補(bǔ)體的核酸序列雜交的核酸序列。本發(fā)明包括和提供含有的核酸分子的被轉(zhuǎn)化的大豆植物，核酸分子包含被可操作地連接到結(jié)構(gòu)性核酸序列的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子包含選自SEQIDNO1，2，3，4，9，10，或11及其互補(bǔ)體的核酸序列。附圖簡(jiǎn)介附圖1是載體pMON13773的示意圖。附圖2是載體pMON58101的示意圖。附圖3是載體pMON58102的示意圖。附圖4是載體pMON58106的示意圖。附圖5是載體pMON58110的示意圖。附圖6是載體pMON58100的示意圖。附圖7是載體pMON58107的示意圖。附圖8是載體pMON58113的示意圖。附圖9是載體pMON55526的示意圖。附圖10是載體pMON58108的示意圖。附圖11是載體pMON39319的示意圖。附圖12表示在多個(gè)啟動(dòng)子控制下在轉(zhuǎn)基因大豆中表達(dá)的GUS的相對(duì)活性的圖。附圖13是載體pMON58130的示意圖。附圖14表示各種構(gòu)建體的GUS的相對(duì)活性的圖。附圖15是載體pMON63604的示意圖。附圖16是載體pMON63605的示意圖。附圖17是載體pMON55542的示意圖。附圖18是載體pMON63821的示意圖。附圖19是載體pMON63819的示意圖。附圖20是載體pMON63820的示意圖。附圖21是載體pMON63654的示意圖。序列簡(jiǎn)介SEQIDNO1是來自蠶豆(Viciafaba)的USP88啟動(dòng)子序列。SEQIDNO2是來自蠶豆的eUSP88啟動(dòng)子序列。SEQIDNO3是來自蠶豆的USP99啟動(dòng)子序列。SEQIDNO4是來自蠶豆的USP91啟動(dòng)子序列。SEQIDNO5是來自蠶豆的USP啟動(dòng)子序列。SEQIDNO6是用于擴(kuò)增來自蠶豆的USP啟動(dòng)子的引物序列。SEQIDNO7是用于擴(kuò)增來自蠶豆的USP啟動(dòng)子的引物序列。SEQIDNO8是用于擴(kuò)增來自蠶豆的USP啟動(dòng)子的引物序列。SEQIDNO9是來自蠶豆的USP99.5啟動(dòng)子序列。SEQIDNO10是來自蠶豆的USP95啟動(dòng)子序列。SEQIDNO11是來自蠶豆的USP68啟動(dòng)子序列。SEQIDNO12是用于擴(kuò)增來自蠶豆的USP啟動(dòng)子的引物序列。SEQIDNO13是用于擴(kuò)增來自蠶豆的USP啟動(dòng)子的引物序列。SEQIDNO14是用于擴(kuò)增來自蠶豆的USP啟動(dòng)子的引物序列。SEQIDNO15是用于擴(kuò)增來自蠶豆的USP啟動(dòng)子的引物序列。SEQIDNO16是用于擴(kuò)增是來自蠶豆的USP啟動(dòng)子的引物序列。定義提供如下定義來幫助理解對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述。短語“編碼序列”、“結(jié)構(gòu)序列”和“結(jié)構(gòu)性核酸序列”是指包含核苷酸順序排列的物理結(jié)構(gòu)。核苷酸以一系列的三聯(lián)體排列，每個(gè)三聯(lián)體構(gòu)成密碼子。每個(gè)密碼子編碼特定氨基酸。因此，編碼序列、結(jié)構(gòu)序列和結(jié)構(gòu)性核酸序列編碼一系列氨基酸，構(gòu)成蛋白質(zhì)、多肽和肽序列。編碼序列、結(jié)構(gòu)序列和結(jié)構(gòu)性核酸序列可以被包含在較大的核酸分子、載體等中。此外，這些序列中核苷酸的順序排列可以以序列表、附圖、表格、電子介質(zhì)等形式表述。短語“DNA序列”、“核酸序列”和“核酸分子”是指包含核苷酸順序排列的物理結(jié)構(gòu)。DNA序列或核苷酸序列可以被包含在較大的核苷酸分子、載體等中。此外，這些序列中核酸的順序排列可以以序列表、附圖、表格、電子介質(zhì)等形式表述。術(shù)語“表達(dá)”是指基因轉(zhuǎn)錄來制備相應(yīng)的mRNA，以及該mRNA被翻譯來生產(chǎn)相應(yīng)的基因產(chǎn)物(即肽、多肽和蛋白質(zhì))。短語“反義RNA的表達(dá)”是指DNA轉(zhuǎn)錄來生成能夠雜交到第二個(gè)RNA分子的第一個(gè)RNA分子術(shù)語“同源性”是指按照位置相同的百分比，兩條或多條核酸或氨基酸序列之間的相似水平(即序列相似性或同一性)。同源性還指不同核酸或蛋白質(zhì)之間的相似功能特性的概念。術(shù)語“異源的”是指來自不同來源的兩條或多條核酸或蛋白質(zhì)序列之間的關(guān)系。例如，如果啟動(dòng)子與編碼序列的組合通常不是天然存在的，則啟動(dòng)子對(duì)于編碼序列來說是異源的。此外，特定序列對(duì)于其所插入的細(xì)胞或生物體來說是“異源的”(即不是自然地存在于特定的細(xì)胞或生物體中)。術(shù)語“雜交”是指當(dāng)兩條核酸鏈具有足夠大的序列同一性時(shí)，第一條核酸鏈通過氫鍵堿基配對(duì)與第二條鏈結(jié)合的能力。當(dāng)兩條核酸分子在合適條件下相互退火時(shí)，發(fā)生雜交。短語“被可操作地連接”是指兩個(gè)或多個(gè)核酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。例如，啟動(dòng)子區(qū)被置于相對(duì)于核酸序列的位置，使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受該啟動(dòng)子區(qū)域引導(dǎo)。從而，啟動(dòng)子區(qū)域“被可操作地連接”到該核酸序列上。術(shù)語或短語“啟動(dòng)子”或“啟動(dòng)子區(qū)域”是指核酸序列，通常存在于編碼序列的上游(5′)，能夠引導(dǎo)核酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA。一般地，啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)域提供RNA聚合酶和正確起始轉(zhuǎn)錄所必需的其他因子的識(shí)別位點(diǎn)。如本文所預(yù)期，啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)域包括啟動(dòng)子的變體，其通過插入或刪除調(diào)控區(qū)域，進(jìn)行隨機(jī)或定點(diǎn)突變啟動(dòng)子等來獲得。啟動(dòng)子的活性或強(qiáng)度可以根據(jù)其相對(duì)于轉(zhuǎn)錄活性預(yù)先已經(jīng)被評(píng)價(jià)的啟動(dòng)子所產(chǎn)生的RNA的量、或者細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)沉積的含量來測(cè)定。短語“5′UTR”是指DNA上游的非翻譯區(qū)，或者基因的編碼區(qū)的5’端的非翻譯區(qū)。短語“3′UTR”是指DNA下游的非翻譯區(qū)，或者基因的編碼區(qū)的3’端的非翻譯區(qū)。短語“重組載體”是指任何介質(zhì)，如質(zhì)粒、粘粒、病毒、自主復(fù)制序列、噬菌體、線性單鏈的、環(huán)狀單鏈的、線性雙鏈的、或環(huán)狀雙鏈的DNA或RNA核苷酸序列。重組載體可以來自任何來源，能夠進(jìn)行基因組整合或自主復(fù)制。短語“調(diào)控序列”是指位于編碼序列的上游(5′)、內(nèi)部或下游(3′)的核苷酸序列。編碼序列的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)通常受到調(diào)控序列存在與否的影響。短語“基本上同源的”是指兩條序列在序列上至少約90％相同，這通過本文描述的BestFit程序測(cè)定(版本10；GeneticsComputerGroup，Inc.，UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter，Madison，WI)，采用默認(rèn)的參數(shù)。術(shù)語“轉(zhuǎn)化”是指將核酸導(dǎo)入到受體宿主中。術(shù)語“宿主”是指細(xì)菌細(xì)胞、真菌、動(dòng)物或動(dòng)物細(xì)胞、植物或種子、或任何植物部分或組織，包括植物細(xì)胞、原生質(zhì)體、愈傷組織、根、塊莖、種子、莖、葉子、幼苗、胚和花粉。如在此所用，短語“轉(zhuǎn)基因植物”是指具有被導(dǎo)入的核酸的植物，該核酸被穩(wěn)定地導(dǎo)入到植物的基因組中，例如，核或質(zhì)體基因組。如在此所用，短語“基本上被純化的”是指基本上與通常在天然狀態(tài)下與之相關(guān)的所有其他分子分開的分子。更優(yōu)選地，基本上被純化的分子是存在于制備物中的占優(yōu)勢(shì)種類。基本上被純化的分子約60％，優(yōu)選約75％，更加優(yōu)選約90％和最優(yōu)選約95％以上地不含天然混合物中存在的其他分子(不計(jì)溶劑)。短語“基本上被純化的”不指包含在天然狀態(tài)下存在的分子。優(yōu)選實(shí)施方案的詳述本發(fā)明提供能夠在種子中轉(zhuǎn)錄異源結(jié)構(gòu)核酸分子的啟動(dòng)子，以及改進(jìn)、制備和使用這些啟動(dòng)子的方法。本發(fā)明還提供含有種子特異性啟動(dòng)子的組合物、被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞和植物，以及制備和使用它們的方法。核酸分子本發(fā)明提供包含選自SEQIDNO1，2，3，4，9，10，或11及其互補(bǔ)體的序列的核酸分子。SEQIDNO5表示被報(bào)道的USP啟動(dòng)子。核酸雜交是DNA操作領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的技術(shù)。特定的一對(duì)核酸的雜交特性指示它們的相似性或同一性。低嚴(yán)緊條件可以被用于選擇與靶核酸序列具有低序列同一性的核酸序列。可以采用條件如約0.15M到約0.9M氯化鈉，溫度范圍在約20℃到約55℃。高嚴(yán)緊條件可以被用于選擇與被公開的核酸序列具有較大同一性的核酸序列(Sambrook等，1989)。高嚴(yán)緊條件通常包括在約2X-約10XSSC(用蒸餾水稀釋含有3M氯化鈉和0.3M檸檬酸鈉的20XSSC母液，pH7.0得到)，約2.5X-約5XDenhardt溶液(用蒸餾水稀釋含有1％(w/v)牛血清白蛋白、1％(w/v)ficoll、和1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮的50X母液得到)，約10mg/mL-約100mg/mL魚精子DNA，和約0.02％(w/v)-約0.1％(w/v)SDS的核酸雜交，在約50℃-約70℃下溫育數(shù)小時(shí)至過夜。高嚴(yán)緊條件優(yōu)選通過6XSSC，5XDenhardt液，100mg/mL魚精子DNA和0.1％(w/v)SDS，在55℃下溫育數(shù)小時(shí)產(chǎn)生。雜交后通常進(jìn)行多個(gè)洗滌步驟。洗滌組合物通常包含0.5X-約10XSSC，和0.01％(w/v)-約0.5％(w/v)SDS，在約20℃-70℃下溫育15min。優(yōu)選地，在0.1XSSC、65℃下至少洗滌一次后，核酸片段仍然被雜交。本發(fā)明的核酸分子優(yōu)選在高嚴(yán)緊條件下與具有選自SEQIDNO1，2，3，4，9，10，或11及其互補(bǔ)體的序列的核酸分子雜交。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子在高嚴(yán)緊條件下與包含SEQIDNO1的核酸分子雜交。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子在高嚴(yán)緊條件下與包含SEQIDNO2的核酸分子雜交。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子在高嚴(yán)緊條件下與包含SEQIDNO3的核酸分子雜交。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子在高嚴(yán)緊條件下與包含SEQIDNO4的核酸分子雜交。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子在高嚴(yán)緊條件下與包含SEQIDNO9的核酸分子雜交。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子在高嚴(yán)緊條件下與包含SEQIDNO10的核酸分子雜交。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子在高嚴(yán)緊條件下與包含SEQIDNO11的核酸分子雜交。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含與SEQIDNO1的序列同一性大于約85.5％，或大于約87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，或約99％的核酸序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含與SEQIDNO2的序列同一性大于約85.5％，或大于約87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，或約99％的核酸序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含與SEQIDNO3的序列同一性大于約97.1％，98，98.5，或大于約99％的核酸序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含與SEQIDNO4的序列同一性大于約96.4％，97，98，或約99％的核酸序列。序列同一性的百分比優(yōu)選采用如下方法確定。采用Dnastar軟件包中的EditSeq應(yīng)用程序(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)將序列轉(zhuǎn)化為EditSeqDNA序列文件。轉(zhuǎn)化的文件被輸入到Dnastar軟件包的Megalign應(yīng)用程序中。采用Clustal方法在默認(rèn)設(shè)定(defaultsetting)下將輸入的序列與加權(quán)(weighted)的殘基權(quán)重(weight)表比對(duì)。這種方法被用于確定本發(fā)明的啟動(dòng)子序列與其他序列以及相互之間的百分同一性。用于確定百分同一性的另一種方法采用序列分析軟件包的“BestFit”或“Gap”程序(版本10；GeneticsComputerGroup，Inc.，UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter，Madison，WI)?！癎ap”采用Needleman和Wunsch(1970)的算法來確定兩條序列之間的排列，最大化匹配的數(shù)量并且最小化缺口數(shù)量?！癇estFit”采用Smith和Waterman的局部同源性算法(Smith和Waterman，1981；Smith等，1983)，進(jìn)行兩條序列之間的最好相似性片段的最佳排列，并且插入缺口來最大化匹配數(shù)量。百分同一性最優(yōu)選采用“BestFit”程序在默認(rèn)參數(shù)下確定。本發(fā)明還提供具有與任何SEQIDNO1，2，3，4，9，10，或11，以及其互補(bǔ)體的百分同一性大于與SEQIDNO5的百分同一性的核酸分子片段。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，片段與任何SEQIDNO1-4的百分同一性至少比該片段與SEQIDNO5的百分同一性大至少約1％，優(yōu)選至少約2，3，4，5，10，15，20，或大于至少約30％。在一個(gè)實(shí)施方案中，片段為本發(fā)明的核酸分子的約50個(gè)到約600個(gè)之間的連續(xù)核苷酸，約50個(gè)到約550個(gè)之間的連續(xù)核苷酸，約50個(gè)到約500個(gè)之間的連續(xù)核苷酸，約50個(gè)到約450個(gè)之間的連續(xù)核苷酸，約50個(gè)到約400個(gè)之間的連續(xù)核苷酸，約50個(gè)到約350個(gè)之間的連續(xù)核苷酸，約50個(gè)到約300個(gè)之間的連續(xù)核苷酸，約50個(gè)到約250個(gè)之間的連續(xù)核苷酸，約50個(gè)到約200個(gè)之間的連續(xù)核苷酸，約50個(gè)到約150個(gè)之間的連續(xù)核苷酸，約50個(gè)到約100個(gè)之間，約15個(gè)到約100個(gè)之間，約15個(gè)到約50個(gè)之間，約15個(gè)到約25個(gè)之間的連續(xù)核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，片段包含本發(fā)明的核酸序列的至少約15，20，30，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，或約650個(gè)連續(xù)核苷酸。本發(fā)明包括編碼具有酶活性的多肽的核酸序列，該酶活性為類固醇途徑酶鯊烯環(huán)氧酶、固醇甲基轉(zhuǎn)移酶I、固醇C4脫甲基酶、鈍葉鼠曲草醇(obtusifoliol)C14α脫甲基酶、固醇C5去飽和酶和固醇甲基轉(zhuǎn)移酶II。鯊烯環(huán)氧酶(也稱作鯊烯單加氧酶)催化鯊烯轉(zhuǎn)化為環(huán)氧化鯊烯(2，3-氧化鯊烯)，環(huán)氧化鯊烯是植物甾醇類合成路徑中的起始固醇分子的前體，環(huán)阿屯醇。這是該路徑中首次報(bào)道的步驟，該路徑是需氧的。環(huán)氧化鯊烯的形成也是最近經(jīng)常報(bào)道的動(dòng)物、真菌和植物的固醇生物合成中步驟。近來報(bào)道一些擬南芥屬(Arabidopsis)和蕓苔屬(Brassica)環(huán)氧化鯊烯基因的同系物(Schafer，U.A.，Reed，D.W.，Hunter，D.G.，Yao，K.，Weninger，A.M.，Tsang，E.W.，Reaney，M.J.，MacKenzie，S.L.，和Covello，P.S.(1999)，PlantMol.Biol.，39(4)721-728)。這些作者還進(jìn)行PCT申請(qǐng)，其中公開了使用環(huán)氧化鯊烯的反義技術(shù)來評(píng)價(jià)植物中的鯊烯水平的用途(WO97/34003)。鯊烯環(huán)氧化酶，也稱作鯊烯單加氧酶，是參考號(hào)為1.14.99.7的酶，EnzymeNomenclature，1992，146。一些鯊烯環(huán)氧化酶是本領(lǐng)域已知的。它們包括擬南芥鯊烯環(huán)氧化酶蛋白質(zhì)序列登錄號(hào)AC004786擬南芥屬(Arabidopsis)鯊烯環(huán)氧化酶登錄號(hào)N64916，和擬南芥鯊烯環(huán)氧化酶登錄號(hào)T44667。日本專利申請(qǐng)07194381A公開了編碼哺乳動(dòng)物的鯊烯環(huán)氧化酶的DNA。本發(fā)明的另一個(gè)方面是包含編碼鯊烯環(huán)氧化酶的核酸序列的重組構(gòu)建體和載體，以及制備新的鯊烯環(huán)氧化酶方法，包括在使生成鯊烯環(huán)氧化酶的條件下培養(yǎng)用新的構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞一段時(shí)間，和回收由此生成的鯊烯環(huán)氧化酶。S-腺苷L-甲硫氨酸固醇C24甲基轉(zhuǎn)移酶(SMT1和SMT2)催化將甲基從輔助因子S-腺苷L-甲硫氨酸上轉(zhuǎn)移到固醇側(cè)鏈的C24中心(Bach，T.J.和Benveniste，P.(1997)，Prog.LipidRes.，36197-226)。在高等植物細(xì)胞中，SMT表示產(chǎn)生24-甲基和24-乙基固醇的能力(Schaffer，A.，Bouvier-Nave，Benveniste，P.，Schaller，H.(2000)Lipids，35263-269)。采用酵母erg6表達(dá)系統(tǒng)的SMT功能性特征清楚地證明，在特定植物種類中，SMT1序列編碼環(huán)阿屯醇-C24-甲基轉(zhuǎn)移酶和SMT2序列編碼C24-亞甲基烯膽烷醇(methylenelophenol)-C24-甲基轉(zhuǎn)移酶(Bouvier-Nave，P.，Husselstein，T.，和Benveniste，P.(1998)，Eur.J.Biochem.，246518-529)。一些編碼SMT1和SMT2的基因已經(jīng)被報(bào)道和評(píng)論(Schaffer，A.，Bouvier-Nave，Benveniste，P.，Schaller，H.(2000)Lipids，35263-269)。表達(dá)SMT1或SMT2的同系物的轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)被試驗(yàn)(Schaffer，A.，Bouvier-Nave，Benveniste，P.，Schaller，H.(2000)Lipids，35263-269)。這些基因用于改進(jìn)植物固醇組成的用途也被兩個(gè)專利申請(qǐng)覆蓋(WO98/45457和WO00/61771)。本領(lǐng)域已知的固醇甲基轉(zhuǎn)移酶I可被用于本發(fā)明。示例性的序列包括已知的擬南芥固醇甲基轉(zhuǎn)移酶I蛋白序列登錄號(hào)U71400(以SEQIDNO19公開)、已知的煙草固醇甲基轉(zhuǎn)移酶I蛋白序列登錄號(hào)U81312(以SEQIDNO20公開)和蓖麻(RicinusCommunis)固醇C甲基轉(zhuǎn)移酶，Eur.J.Biochem.，246(2)518-529(1997)(Completecds，登錄號(hào)g2246457)。S-腺苷L-甲硫氨酸固醇C24甲基轉(zhuǎn)移酶—一種編碼擬南芥S-腺苷L-甲硫氨酸固醇C24甲基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列已經(jīng)被Husselstein等，(1996)FEBSLetters38187-92發(fā)表。Δ24固醇甲基轉(zhuǎn)移酶是編號(hào)為2.1.1.41的酶，EnzymeNomenclature，1992，160。固醇C4脫甲基酶催化個(gè)別脫甲基反應(yīng)的前面反應(yīng)，導(dǎo)致C4上的兩個(gè)甲基基團(tuán)去除。雖然在動(dòng)物和真菌中，連續(xù)發(fā)生兩個(gè)C4甲基基團(tuán)的去除，但是已經(jīng)報(bào)道在植物中，在第一次和第二次C4脫甲基之間還有其他步驟(Bach，T.J.和Benveniste，P.(1997)，Prog.LipidRes.，36197-226)。C4脫甲基是由單加氧酶、NAD+依賴的固醇4-脫羧酶和NADPH依賴的3-類固酮還原酶組成的微粒體酶復(fù)合物催化的。固醇C14脫甲基酶催化C14處的脫甲基，去除C14的甲基基團(tuán)并且在該位置上產(chǎn)生雙鍵。在真菌和動(dòng)物中，這是固醇合成路徑的第一步。但是，在高等植物中，14α-甲基在一個(gè)C4甲基缺失后被去除。因此，雖然羊毛固醇是動(dòng)物和真菌細(xì)胞中的C14脫甲基酶的底物，植物酶利用鈍葉鼠曲草醇(obtusifoliol)作為底物。固醇C14脫甲基化通過細(xì)胞色素P-450復(fù)合物調(diào)節(jié)。去除14甲基的機(jī)制包括兩個(gè)氧化步驟，在C29生成乙醇，然后轉(zhuǎn)化為乙醛，以及另一個(gè)氧化步驟，涉及產(chǎn)生甲酸和典型的8，14-雙烯固醇的去甲?；?Aoyama，Y，Yoshida，Y，Sonoda，Y.，和Sato，Y.(1989)J；Biol.Chem.，26418502-18505)。來自Sorghumbicolor(L)Moench的鈍葉鼠曲草醇(obtusifoliol)C14α-脫甲基酶已經(jīng)采用由從內(nèi)在14氨基酸序列設(shè)計(jì)的PCR引物生成的基因特異性探針克隆，并且在大腸桿菌中被功能性地表達(dá)(Bak，S.，Kahn，R.A.，Olsen，C.E.，和Halkier，B.A.(1997)ThePlantJournal，11(2)191-201)。此外，編碼羊毛甾醇14-脫甲基酶的釀酒酵母CYP51A1在煙草中被功能性地表達(dá)(Grausem，B.，Chaubet，N.，Gigot，C.，Loper，J.C.，和Benveniste，P.(1995)ThePlantJournal，7(5)761-770)。固醇C14脫甲基酶和序列是本領(lǐng)域已知的。例如，Sorghumbicolor鈍葉鼠曲草醇C14α脫甲基酶CYP51mRNA在PlantJ.，11(2)191-201(1997)中被描述(全編碼序列(cds)登錄號(hào)U74319)。本發(fā)明的另一個(gè)方面在于包含編碼新的鈍葉鼠曲草醇C14α脫甲基酶的核酸序列的重組構(gòu)建體和載體，以及制備新的鈍葉鼠曲草醇C14α脫甲基酶的方法，包括在使生成鈍葉鼠曲草醇C14α脫甲基酶的條件下培養(yǎng)用新的構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞一段時(shí)間，和回收由此生成的鈍葉鼠曲草醇C14α脫甲基酶。固醇C5去飽和酶催化Δ5雙鍵的插入，這通常在Δ7-固醇水平上發(fā)生，從而形成Δ5，7固醇(Parks等，Lipids，30227-230(1995))。該反應(yīng)被報(bào)道包括立體特異地去除5α和6α氫原子，這兩個(gè)氫原子分別由(+)和(-)R-甲羥戊酸4pro-R和5pro-S氫生物合成地產(chǎn)生(Goodwin，T.W.(1979)Annu.Rev.PlantPhysio.，30369-404)。該反應(yīng)顯然是需要氧和NADPH或NADH的。去飽和酶已經(jīng)被報(bào)道是一種存在于微粒體中的多酶復(fù)合物。由去飽和酶本身、細(xì)胞色素b5和吡啶核苷酸依賴的黃素蛋白組成。Δ5-去飽和酶被報(bào)道是單加氧酶，其通過細(xì)胞色素b利用來自被還原的吡啶核苷酸的電子(Taton，M.，和Rahier，A.(1996)Arch.Biochem.Biophys.，325279-288)。編碼固醇-C5去飽和酶的擬南芥cDNA通過ERG3中缺乏erg3的酵母突變體的功能性互補(bǔ)物被克隆，ERG3是編碼麥角固醇生物合成必需的固醇C5去飽和酶的基因(GachotteD.，Husselstein，T.，Bard，M.，LacrouteF.，和Benveniste，P.(1996)ThePlantJournal，9(3)391-398)。已知的固醇C5去飽和酶可用于本發(fā)明，包括擬南芥固醇C5去飽和酶蛋白質(zhì)序列登錄號(hào)X90454，以SEQIDNO22公開，和在ThePlantJ.9(3)391-398(1996)中描述的固醇C5去飽和酶的擬南芥mRNA(全編碼序列登錄號(hào)g1061037)。NCBI(國家生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫顯示了37條固醇去飽和酶的序列，它們可以被用于本發(fā)明。如下是這種序列的示例。來自酵母C5固醇去飽和酶NP_013157(釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae))；推定的C5固醇去飽和酶裂殖體(fission)T40027(粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe))；C5固醇去飽和酶裂殖體T37759(粟酒裂殖酵母)；C5固醇去飽和酶JQ1146(釀酒酵母)；C5固醇去飽和酶BAA21457(粟酒裂殖酵母)；C5固醇去飽和酶CAA22610(粟酒裂殖酵母)；推定的C5固醇去飽和酶CAA16898(粟酒裂殖酵母)；可能的C5固醇去飽和酶O13666(erg3_schpo)；C5固醇去飽和酶P50860(Erg3_canga)；C5固醇去飽和酶P32353(erg3_yeast)；C5，6去飽和酶AAC99343(白色假絲酵母(candidaalbicans))；C5固醇去飽和酶BAA20292(釀酒酵母)；C5固醇去飽和酶AAB39844(釀酒酵母)；C5固醇去飽和酶AAB29844(釀酒酵母)；C5固醇去飽和酶CAA64303(釀酒酵母)；C5固醇去飽和酶AAA34595(釀酒酵母)；C5固醇去飽和酶AAA34594(釀酒酵母)。來自植物的C5固醇去飽和酶S71251(擬南芥)；推定的固醇C5去飽和酶AAF32466(擬南芥)；固醇C5去飽和酶AAF32465(擬南芥)；推定的固醇去飽和酶AAF22921(擬南芥(Arabidopsisthaliana))；Δ7-固醇C5去飽和酶(擬南芥)；固醇C5，6去飽和酶同系物AAD20458(煙草)；固醇C5去飽和酶AAD12944(擬南芥)；固醇C5，6去飽和酶AAD04034(煙草)；固醇C5去飽和酶CAA62079(擬南芥)。來自哺乳動(dòng)物的固醇C5去飽和酶(Musmusculus)BAA33730；固醇C5去飽和酶BAA33729(Homosapiens)；7-烯膽(甾)烷醇氧化酶CAB65928(Leishmaniamajor)；7-烯膽(甾)烷醇氧化酶(7-烯膽(甾)烷醇C5去飽和酶)088822(家鼠)；7-烯膽(甾)烷醇C5去飽和酶075845(Homosapiens)；Δ7-固醇C5去飽和酶AAF00544(Homosapiens)。其他真菌固醇C5去飽和酶同系物BAA18970(Homosapiens)。對(duì)于可用于本發(fā)明的編碼固醇C5去飽和酶的DNA序列，NCBI核苷酸檢索“固醇去飽和酶”獲得110條序列。如下是這些序列的示例。NC_001139(釀酒酵母)；NC_001145(釀酒酵母)；NC_001144(釀酒酵母)；AW700015(physcomitrellapatens)；AB004539(粟酒裂殖酵母)；和AW596303(大豆(Glycinemax)；AC012188(擬南芥)。結(jié)合導(dǎo)入HMG-CoA還原酶基因以及固醇甲基轉(zhuǎn)移酶II基因到細(xì)胞中，來除了減少24-甲基固醇如菜油甾醇的沉積外，還減少固醇路徑中間的化合物沉積。已知的固醇甲基轉(zhuǎn)移酶II可以被用于本發(fā)明，包括擬南芥固醇甲基轉(zhuǎn)移酶II蛋白質(zhì)序列(來自FEBSLett.381(12)87-92(1996)登錄號(hào)X89867的完整mRNA編碼序列)，以SEQIDNO21公開。編碼任何一種前述的影響固醇生物合成路徑的酶的重組構(gòu)建體可以被結(jié)合到包含重組構(gòu)建體的重組載體中，該重組構(gòu)建體包含分離的DNA分子。這種載體可以是細(xì)菌的或植物的表達(dá)載體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，任何一種本發(fā)明的植物或生物體用本發(fā)明的核酸和編碼選自鯊烯環(huán)氧酶、固醇甲基轉(zhuǎn)移酶I、固醇C4脫甲基酶、鈍葉鼠曲草醇(obtusifoliol)C14α脫甲基酶、固醇C5去飽和酶和固醇甲基轉(zhuǎn)移酶II的一種成員的基因轉(zhuǎn)化。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物或生物體用SEQIDNO1-5的一種或多種和編碼選自鯊烯環(huán)氧酶、固醇甲基轉(zhuǎn)移酶I、固醇C4脫甲基酶、鈍葉鼠曲草醇C14α脫甲基酶、固醇C5去飽和酶和固醇甲基轉(zhuǎn)移酶II的一種成員的基因轉(zhuǎn)化。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物或生物體用SEQIDNO1-5的一種或多種，編碼選自鯊烯環(huán)氧酶、固醇甲基轉(zhuǎn)移酶I、固醇C4脫甲基酶、鈍葉鼠曲草醇C14α脫甲基酶、固醇C5去飽和酶或固醇甲基轉(zhuǎn)移酶II的一種成員的基因，和在本文別處公開的編碼生育酚途徑酶的基因的一種或多種轉(zhuǎn)化。在還有一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物或生物體用SEQIDNO1-5的一種或多種和編碼選自鯊烯環(huán)氧酶、固醇甲基轉(zhuǎn)移酶I、固醇C4脫甲基酶、鈍葉鼠曲草醇C14α脫甲基酶、固醇C5去飽和酶或固醇甲基轉(zhuǎn)移酶II的一種成員的兩種基因和在本文別處公開的編碼生育酚途徑酶的兩種基因轉(zhuǎn)化。任何上述的生育酚和固醇生物合成基因的結(jié)合可以在一種或多種本領(lǐng)域已知和在本文描述的構(gòu)建體或載體中被導(dǎo)入到植物。啟動(dòng)子在一個(gè)實(shí)施方案中，任何被公開的核酸分子可以是啟動(dòng)子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該啟動(dòng)子是組織或器官特異性的，并且優(yōu)選是種子特異性的。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子優(yōu)先在胚乳或胚芽中表達(dá)相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因。在優(yōu)選實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是USP啟動(dòng)子。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是蠶豆(viciafaba)USP啟動(dòng)子。在一個(gè)方面，如果在該組織或器官中mRNA以比在其他組織或器官中至少高10倍，優(yōu)選至少高100倍或至少高1000倍水平被表達(dá)，則該啟動(dòng)子被認(rèn)為是組織或器官特異性的?？梢栽趩蝹€(gè)時(shí)間點(diǎn)上或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上測(cè)定mRNA水平，同樣倍數(shù)增加可以是平均倍數(shù)增加或來自試驗(yàn)測(cè)定值的推定值。由于是進(jìn)行水平的比較，可以采用任何測(cè)定mRNA水平的方法。在優(yōu)選方面，被比較的組織或器官是種子或種子組織和葉片或葉片組織。在另一個(gè)優(yōu)選方面，比較多個(gè)組織或器官。優(yōu)選的多種比較是種子或種子組織與2，3，4，或多種組織或器官之間比較，這些組織或器官選自花組織、花原端、花粉、葉片、胚、苗、葉原基、苗端、根、根尖、維管組織和子葉。如在此所用，植物器官的例子是種子、葉片、根等。組織的例子是葉原基、根尖、維管組織等。啟動(dòng)子的活性和強(qiáng)度可以根據(jù)mRNA或蛋白質(zhì)沉積的含量來測(cè)定，其相對(duì)于mRNA或蛋白質(zhì)沉積的總含量，特別地產(chǎn)生。啟動(dòng)子優(yōu)選以超過2.5％的水平表達(dá)被可操作地連接的核酸序列；更加優(yōu)選超過約5，6，7，8，或約9％；甚至更加優(yōu)選超過約10，11，12，13，14，15，16，17，18，或約19％，和最優(yōu)選超過約20％的總mRNA。此外，啟動(dòng)子的活性或強(qiáng)度可以相對(duì)于被清楚確定的啟動(dòng)子(其轉(zhuǎn)錄活性預(yù)先被評(píng)價(jià))來表達(dá)。例如，目標(biāo)啟動(dòng)子可以被可操作地連接到報(bào)道序列(如GUS)上，并被導(dǎo)入到特定細(xì)胞類型中。可以類似地制備已知的啟動(dòng)子，并導(dǎo)入到相同的細(xì)胞物質(zhì)(context)中。然后通過比較相對(duì)于已知啟動(dòng)子報(bào)道基因的表達(dá)量來確定目標(biāo)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。細(xì)胞物質(zhì)優(yōu)選為大豆。結(jié)構(gòu)性核酸序列本發(fā)明的啟動(dòng)子可以被可操作地連接到結(jié)構(gòu)性核酸序列上，該核酸序列相對(duì)于啟動(dòng)子是異源的。結(jié)構(gòu)性核酸序列一般可以是任何核酸序列，其轉(zhuǎn)錄水平有望被提高。結(jié)構(gòu)性核酸序列優(yōu)選編碼適合于被結(jié)合到人類或動(dòng)物的食物(diet)中的多肽，或該多肽產(chǎn)生某些其他農(nóng)業(yè)上的重要特性。合適的結(jié)構(gòu)性核酸序列包括但是不限于編碼種子貯存蛋白、脂肪酸途徑酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶、固醇途徑酶和淀粉分支酶的核酸序列。優(yōu)選的種子儲(chǔ)存蛋白包括玉米蛋白(美國專利4,886,878；4,885,357；5,215,912；5,589,616；5,508,468；5,939,599；5,633,436；和5,990,384；專利申請(qǐng)WO90/01869，WO91/13993，WO92/14822，WO93/08682，WO94/20628，WO97/28247，WO98/26064，和WO99/40209)，7S蛋白(美國專利5,003,045和5,576,203)，巴西堅(jiān)果(brazilnut)蛋白(美國專利5,850,024)，不含苯丙氨酸的蛋白質(zhì)(專利申請(qǐng)WO96/17064)，白蛋白(專利申請(qǐng)WO97/35023)，β-伴球蛋白(conglycinin)(專利申請(qǐng)WO00/19839)，11S(美國專利6,107,051)，α-hordothionin(美國專利5,885,802和5885801)，arcelin種子儲(chǔ)存蛋白(美國專利5,270,200)，凝集素(美國專利6,110,891)，和麥谷蛋白(美國專利5,990,389和5,914,450)。優(yōu)選脂肪酸途徑酶包括硫酯酶(美國專利5,512,482；5,530,186；5,945,585；5,639,790；5,807,893；5,955,650；5,955,329；5,759,829；5,147,792；5,304,481；5,298,421；5,344,771；和5,760,206)，和去飽和酶(美國專利5,689,050；5,663,068；5,614,393；5,856,157；6,117,677；6,043,411；6,194,167；5,705,391；5,663,068；5,552,306；6,075,183；6,051,754；5,689,050；5,789,220；5,057,419；5,654,402；5,659,645；6,100,091；5,760,206；6,172,106；5,952,544；5,866,789；5,443,974；和5,093,249)。優(yōu)選生育酚生物合成途徑酶包括tyrA，slr1736，ATPT2，dxs，dxr，GGPPS，HPPD，GMT，MT1，tMT2，AANT1，slr1737，和尿黑酸的雙加氧酶的反義構(gòu)建體(Kridl等，SeedSci.Res.，1209219(1991)；Keegstra，Cell，56(2)247-53(1989)；Nawrath，等.，Proc，Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，9112760-12264(1994)；Xia等J.Gen.Microbiol.，1381309-1316(1992)；cyanobasehttp//www.kazusa.or.jp/cyanobase；Loisetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，95(5)2105-2110(1998)；Takahashi等Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，95(17)，9879-9884(1998)；Norris等，PlantPhysiol.，1171317-1323(1998)；Bartley和Scolnik，PlantPhysiol.，1041469-1470(1994)；Smith等，PlantJ.，1183-92(1997)；WO00/32757；WO00/10380；SaintGuily，等，PlantPhysiol.，100(2)1069-1071(1992)；Sato等，J.DNARes.，7(1)31-63(2000))。各種基因及其編碼的參與生育酚生物合成的蛋白質(zhì)被列舉在下面的表1中。表1基因及其編碼的參與生育酚生物合成的蛋白質(zhì)上表給出的“基因ID”確定與所列酶相關(guān)的基因。任何列于表1中的出現(xiàn)在本公開中的基因ID是指編碼在表1中與基因ID相關(guān)的酶的基因。優(yōu)選的氨基酸生物合成酶包括鄰氨基苯甲酸合成酶(美國專利5,965,727；專利申請(qǐng)WO97/26366，WO99/11800，和WO99/49058)，色氨酸脫羧酶(專利申請(qǐng)WO99/06581)，蘇氨酸脫羧酶(美國專利5,534,421和5,942,660，專利申請(qǐng)WO95/19442)，蘇氨酸脫氨酶(專利申請(qǐng)WO99/02656，和WO98/55601)，和天門冬氨酸激酶(美國專利5,367,110；5,858,749；和6,040,160)。優(yōu)選的淀粉分支酶包括那些列舉在美國專利6,232,122和6,147,279；和專利申請(qǐng)WO97/22703中的酶。此外，啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)性核酸序列可以設(shè)計(jì)成下調(diào)特定核酸序列。這一般是通過將啟動(dòng)子連接到結(jié)構(gòu)性核酸序列上來實(shí)現(xiàn)，該序列以反義方向被引導(dǎo)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟悉這種反義技術(shù)。任何核酸序列可以以這種方式被反面調(diào)節(jié)。這種調(diào)控的靶點(diǎn)可能包括具有低必需氨基酸含量的多肽，但是這種多肽在特定組織中以相對(duì)較高水平被表達(dá)。例如，β-伴球蛋白和大豆球蛋白在種子被豐富地表達(dá)，但是從必需氨基酸角度考慮是缺乏營養(yǎng)的。這種反義方法還可以被用于有效地從植物來源的飼料中去除不期望的蛋白質(zhì)，如拒食素(如凝集素)、白蛋白和過敏原，或者下調(diào)參與降解期望的化合物如必需氨基酸的分解代謝酶。改進(jìn)的結(jié)構(gòu)性核酸序列本發(fā)明的啟動(dòng)子還可以被可操作地連接到被改進(jìn)的結(jié)構(gòu)性核酸序列上，該核酸序列相對(duì)于啟動(dòng)子是異源的。這種結(jié)構(gòu)性核酸序列可以被改進(jìn)來產(chǎn)生各種期望的特性。例如，結(jié)構(gòu)性核酸序列可以被改進(jìn)來增加必需氨基酸的含量、提高氨基酸序列的翻譯、改變翻譯后的修飾(如磷酸化位點(diǎn))、將翻譯產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)外的腔室、改善蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、插入或刪除細(xì)胞信號(hào)基序等。在優(yōu)選實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)性核酸序列被增強(qiáng)來編碼至少一種和更加優(yōu)選2，3，或4種必需氨基酸含量升高的多肽，這些必需氨基酸選自組氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸或苯丙氨酸。如果需要，還可以添加非必需氨基酸，從結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)上提高該多肽。特別適合于這種升高的結(jié)構(gòu)性核酸序列包括那些編碼天然多肽的序列，這些多肽以相對(duì)高的水平被表達(dá)，具有特別低的必需氨基酸含量或包含這兩種情況。這種多肽的例子是種子貯存蛋白，如大豆球蛋白和β-伴球蛋白。其他合適的靶包括arcelin、菜豆蛋白、凝集素、玉米蛋白和白蛋白。結(jié)構(gòu)性核酸序列中的密碼子使用由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，不同核苷酸密碼子可以被用于編碼特定氨基酸。宿主細(xì)胞通常具有密碼子使用的選擇模式。結(jié)構(gòu)性核酸序列優(yōu)選被構(gòu)建來利用特定宿主細(xì)胞的密碼子選擇模式。這通常在被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中增強(qiáng)結(jié)構(gòu)性核酸序列的表達(dá)。任何上述核酸和氨基酸序列可以被改進(jìn)來體現(xiàn)含有它們的宿主細(xì)胞或生物體的優(yōu)選密碼子選擇。在植物中進(jìn)行最佳密碼子使用的對(duì)結(jié)構(gòu)性核酸序列的修飾在美國專利5,689,052中被描述。結(jié)構(gòu)性核酸序列的其他修飾上述結(jié)構(gòu)性核酸序列中的其他變體可以編碼當(dāng)與用于加工得到它們的蛋白質(zhì)比較時(shí)具有相當(dāng)或更好特性的蛋白質(zhì)。突變包括刪除、插入、截?cái)?、取代、融合、基序序列改組等。對(duì)結(jié)構(gòu)性核酸序列的突變可以以特定或隨機(jī)的方式被導(dǎo)入，這兩種方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。還有許多定點(diǎn)突變技術(shù)，一般采用寡核苷酸來在結(jié)構(gòu)性核酸序列的特定位點(diǎn)上導(dǎo)入突變。例子包括單鏈拯救(Kunkel等，1985)，特定位點(diǎn)消除(Deng和Nickloff，1992)，缺口保護(hù)(Vandeyar等，1988)，和PCR(Costa等，1996)。隨機(jī)或非特異性突變可以化學(xué)試劑產(chǎn)生(綜述，參見Singer和Kusmierek，1982)如亞硝基胍(Cerda-Olmedo等，1968；Guerola等，1971)，和2-氨基嘌呤(Rogan和Bessman，1970)；或通過生物學(xué)方法如通過增變株傳代(Greener等，1997)。用于制備上面描述的改變的其他方法被描述在Ausubel等(1995)；Bauer等(1985)；Craik(1985)；FritsEckstein等(1982)；Sambrook等(1989)；Smith等(1981)；和Osuna等(1994)。這種修飾可能在氨基酸序列上產(chǎn)生保守或非保守的變化。保守變化是不改變最終的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的變化。在優(yōu)選實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)具有5個(gè)和500個(gè)之間的保守變化，更加優(yōu)選10個(gè)和300個(gè)之間的保守變化，甚至更加優(yōu)選25個(gè)和150個(gè)之間的保守變化和最優(yōu)選在5個(gè)和25個(gè)之間的保守變化或在1個(gè)和5個(gè)之間的保守變化。非保守變化包括添加、刪除和取代，這產(chǎn)生被改變的氨基酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)具有5個(gè)和500個(gè)之間的非保守變化，更加優(yōu)選10個(gè)和300個(gè)之間的非保守變化，甚至更加優(yōu)選25個(gè)和150個(gè)之間的非保守變化和最優(yōu)選在5個(gè)和25個(gè)之間的非保守變化或在1個(gè)和5個(gè)之間的非保守變化?？梢詫?duì)本文公開的蛋白質(zhì)序列和編碼它們的核酸序列進(jìn)行修飾，保留這些分子的期望特性。如下是基于改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列來產(chǎn)生相當(dāng)?shù)幕蚩赡苁歉倪M(jìn)的第二代分子的討論。氨基酸變化可以根據(jù)表2中給出的密碼子來改變結(jié)構(gòu)性核酸序列的密碼子來實(shí)現(xiàn)。表2氨基酸的密碼子簡(jiǎn)并性一些氨基酸可以被用于取代蛋白質(zhì)序列中的其他氨基酸，而不使期望活性產(chǎn)生可評(píng)估的損失。因此，可預(yù)期地在肽序列或蛋白質(zhì)序列或者它們的相應(yīng)核酸序列中進(jìn)行各種改變，而不使生物活性產(chǎn)生可檢測(cè)的損失。在進(jìn)行這種改變時(shí)，考慮氨基酸的親水指數(shù)。親水氨基酸指標(biāo)在賦予一種蛋白質(zhì)交互式生物學(xué)功能中的重要性是本領(lǐng)域認(rèn)可的(Kyte和Doolittle，1982)。一般認(rèn)為，氨基酸的相對(duì)親水性特性產(chǎn)生生成的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，該二級(jí)結(jié)構(gòu)隨后限定該蛋白質(zhì)與其他分子的互作，例如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等。可以根據(jù)每種氨基酸的疏水性和電荷特征賦予其親水指數(shù)。即異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸/谷氨酰胺/天冬氨酸/天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。本領(lǐng)域已知，一些氨基酸可以被其他具有相似親水指數(shù)或值的氨基酸取代，并且仍然能夠生成具有相似生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，即仍然獲得具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)。在進(jìn)行這種改變中，親水指數(shù)在±2內(nèi)的氨基酸取代是優(yōu)選的，親水指數(shù)在±1內(nèi)的氨基酸取代是更加優(yōu)選的，親水指數(shù)在±0.5內(nèi)的氨基酸取代是最優(yōu)選的。本領(lǐng)域還理解，類似氨基酸的取代可以根據(jù)親水性有效地進(jìn)行。美國專利4,554,101指出蛋白質(zhì)的最大局部平均親水性受其鄰近的氨基酸的控制，與蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)相關(guān)。如下親水性值被賦予氨基酸精氨酸/賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸/谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺/谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸/組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸/異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。一般認(rèn)為，一些氨基酸可以被其他具有相似親水性值的氨基酸取代，并且仍然能夠生成具有相似生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，即仍然獲得具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)。在進(jìn)行這種改變中，親水指數(shù)在±2內(nèi)的氨基酸取代是優(yōu)選的，親水指數(shù)在±1內(nèi)的氨基酸取代是更加優(yōu)選的，親水指數(shù)在±0.5內(nèi)的氨基酸取代是最優(yōu)選的。如上簡(jiǎn)要描述，氨基酸取代是基于氨基酸側(cè)鏈取代的相對(duì)相似性，如，其疏水性、親水性、電荷、大小等?？紤]各種前述特性的示例性取代是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；和纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。如果相對(duì)于加工獲得它們的未改進(jìn)的多肽，生成的蛋白質(zhì)具有改進(jìn)的對(duì)瘤胃的抗性，增強(qiáng)對(duì)蛋白質(zhì)水解降解的抵抗，或者同時(shí)具有改進(jìn)的對(duì)瘤胃的抗性并增強(qiáng)對(duì)蛋白質(zhì)水解降解的抵抗，被認(rèn)為是不期望的改變也可以被使用。或者，進(jìn)行改變以改善代謝酶的動(dòng)力學(xué)。在一個(gè)優(yōu)選方面，被改進(jìn)的蛋白質(zhì)選自種子貯存蛋白質(zhì)、脂肪酸途徑酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶或淀粉分支酶。重組載體任何一種上面描述的啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)性核酸序列可以在重組載體中被提供。重組載體一般包括，從5′到3′方向引導(dǎo)結(jié)構(gòu)性核酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)性核酸序列。合適的啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)性核酸序列包括本文描述的那些。如果需要，重組載體還可以包括3′轉(zhuǎn)錄終止子、3′多聚腺苷酸化信號(hào)、其他非翻譯核酸序列、轉(zhuǎn)運(yùn)和靶向核酸序列、可選擇標(biāo)記、增強(qiáng)子和操作子。用于制備重組載體的方法是本領(lǐng)域熟知的。用于制備特別適合于植物轉(zhuǎn)化的重組載體的方法被描述在美國專利4,971,908；4,940,835；4,769,061；和4,757,011中。這些類型的載體也已經(jīng)被評(píng)述(Rodriguez等，1988；Glick等，1993)。用于在高等植物中表達(dá)核酸的典型載體是本領(lǐng)域熟知的，包括來自根癌農(nóng)桿菌的腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒的載體(Rogers等，1987)。其他可以用于植物轉(zhuǎn)化的重組多肽包括pCaMVCN轉(zhuǎn)化控制載體，也已經(jīng)被描述(Fromm等，1985)。在一個(gè)實(shí)施方案中，多個(gè)USP啟動(dòng)子在單構(gòu)建體中被可操作地連接到任何結(jié)構(gòu)基因的組合上。在優(yōu)選實(shí)施方案中，任何1，2，3，4，5，或6或多種包含SEQIDNO1，2，3，4，9，10，或11的核酸分子的組合在單個(gè)構(gòu)建體中被可操作地連接到任何結(jié)構(gòu)基因的組合上。在優(yōu)選實(shí)施方案的另一個(gè)方面，核酸分子被修飾。這種修飾包括例如去除或添加一種或多種結(jié)構(gòu)性或功能性的元件。重組載體中的其他啟動(dòng)子還可以在重組載體中提供一種或多種其他啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子可以被可操作地連接到，例如但不限于，任何上述的結(jié)構(gòu)性核酸序列上?？蛇x擇地，啟動(dòng)子可以被可操作地連接到其他核酸序列上，如那些編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽、可選擇的標(biāo)記蛋白的序列或反義序列。這些其他的啟動(dòng)子可以根據(jù)將插入載體的細(xì)胞的類型來選擇。此外，在細(xì)菌、酵母和植物中起作用的啟動(dòng)子都在本領(lǐng)域中被充分地教導(dǎo)。其他啟動(dòng)子還可以根據(jù)其調(diào)控特性來選擇。這種特性的例子包括增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性、可誘導(dǎo)性、組織特異性和發(fā)育階段特異性。在植物中，可誘導(dǎo)的、病毒的或合成來源的、組成型活性的、時(shí)間調(diào)控的和空間調(diào)控的啟動(dòng)子都已經(jīng)被描述(Poszkowski等，1989；Odell等，1985；Chau等，1989)。常用的組成型啟動(dòng)子包括CaMV35S啟動(dòng)子(Odell等，1985)、增強(qiáng)的CaMV35S啟動(dòng)子、玄參(Figwort)花葉病毒(FMV)啟動(dòng)子(Richins等，1987)、甘露堿合成酶(mas)啟動(dòng)子，胭脂堿合成酶(nos)啟動(dòng)子和章魚堿合成酶(ocs)啟動(dòng)子。有用的可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子包括被水楊酸或聚丙烯酸誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(PR-1；Williams等，1992)，由應(yīng)用安全劑誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(替代苯磺酰胺除草劑；Hershey和Stoner，1991)、熱休克啟動(dòng)子(Ou-Lee等，1986；Ainley等，1990)、來自菠菜亞硝酸鹽還原酶結(jié)構(gòu)性核酸序列的硝酸鹽誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(Back等，1991)、激素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(Yamaguchi-Shinozaki等，1990；Kares等，1990)、和與RuBP羧化酶小亞基和LHCP家族相關(guān)的光誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(Kuhlemeier等，1989；Feinbaum等，1991；Weisshaar等，1991；Lam和Chua，1990；Castresana等，1988；Schulze-Lefert等，1989)。有用的組織或器官特異性啟動(dòng)子的例子包括β-伴球蛋白，(Doyle等，1986；Slighton和Beachy，1987)和其他種子特異性啟動(dòng)子(Knutzon等，1992；Bustos等，1991；Lam和Chua，1991)。用于在種子中優(yōu)先表達(dá)的植物功能性啟動(dòng)子包括來自植物儲(chǔ)存蛋白和來自參與油料種子中的脂肪酸生物合成的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子的例子包括來自這種的結(jié)構(gòu)性核酸序列的5′調(diào)控區(qū)，如napin(Kridl等，1991)、菜豆蛋白、玉米蛋白、大豆胰島素抑制劑、ACP、硬酯酰-ACP去飽和酶和oleosin。種子特異性調(diào)控還在EP0255378中被討論。另一種示例性的種子特異性啟動(dòng)子是凝集素啟動(dòng)子。大豆種子中的凝集素啟動(dòng)子由單一的結(jié)構(gòu)性核酸序列(Lel)編碼，該序列僅在種子發(fā)育過程中被表達(dá)。凝集素結(jié)構(gòu)性核酸序列和種子特異性啟動(dòng)子已經(jīng)被表征，并被用于在轉(zhuǎn)基因煙草植物中引導(dǎo)種子特異性表達(dá)(Vodkin等，1983；Lindstrom等，1990)。重組載體中的其他特別優(yōu)選的啟動(dòng)子包括胭脂堿合成酶(nos)、甘露堿合成酶(mas)和章魚堿合成酶(ocs)啟動(dòng)子，在根癌農(nóng)桿菌的腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒中攜帶這些啟動(dòng)子；花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S啟動(dòng)子；增強(qiáng)的CaMV35S啟動(dòng)子；玄參花葉表達(dá)病毒(FMV)35S啟動(dòng)子；來自核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的小亞基的光誘導(dǎo)啟動(dòng)子(ssRUBISCO)；煙草EIF-4A啟動(dòng)子(Mandel等，1995)；玉米蔗糖合成酶1(Yang和Russell，1990)；玉米乙醇脫氫酶1(Vogel等，1989)；玉米集光(lightharvesting)復(fù)合物(Simpson，1986)；玉米熱休克蛋白(Odell等，1985)；來自擬南芥的幾丁質(zhì)酶啟動(dòng)子(Samac等，1991)；來自椰菜的LTP(脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)啟動(dòng)子(Pyee等，1995)；矮牽牛查耳酮異構(gòu)酶(VanTunen等，1988)；豆富含甘氨酸的蛋白1(Keller等，1989)；馬鈴薯patatin(Wenzler等，1989)；來自玉米的泛素啟動(dòng)子(Christensen等，1992)；和來自稻的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(McElroy等，1990)。其他啟動(dòng)子優(yōu)選是種子選擇性的、組織選擇性的、組成型的或可誘導(dǎo)的。啟動(dòng)子最優(yōu)選為胭脂堿合成酶(nos)、章魚堿合成酶的(ocs)、甘露氨酸合成酶(mas)的花椰菜花葉病毒19S和35S(CaMV19S，CaMV35S)、增強(qiáng)的CaMV(eCaMV)、核酮糖1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)、玄參花葉病毒(FMV)、CaMV來源的AS4、煙草RB7、小麥POX1、煙草EIF-4、凝集素蛋白(Lel)或稻RC2啟動(dòng)子。具有其他結(jié)構(gòu)性核酸序列的重組載體重組載體可能還含有一種或多種其他結(jié)構(gòu)性核酸序列。這些其他結(jié)構(gòu)性核酸序列一般是適合于用在重組載體中的任何序列。這種結(jié)構(gòu)性核酸序列包括但是不限于上述序列。其他結(jié)構(gòu)性核酸序列還可以被可操作地連接到任何上述啟動(dòng)子上。一種或多種結(jié)構(gòu)性核酸序列可以各自地被連接到各個(gè)啟動(dòng)子上?？蛇x擇地，結(jié)構(gòu)性核酸序列可以被可操作地連接到單一啟動(dòng)子上(即單一操縱子)。其他結(jié)構(gòu)性核酸序列包括但是不限于那些編碼種子儲(chǔ)存蛋白、脂肪酸途徑酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶和淀粉分支酶的核酸。優(yōu)選的種子儲(chǔ)存蛋白質(zhì)包括玉米蛋白(美國專利4,886,878；4,885,357；5,215,912；5,589,616；5,508,468；5,939,599；5,633,436；和5,990,384；專利申請(qǐng)WO90/01869，WO91/13993，WO92/14822，WO93/08682，WO94/20628，WO97/28247，WO98/26064,和WO99/40209)，7S蛋白質(zhì)(美國專利5,003,045和5,576,203)，巴西堅(jiān)果蛋白(美國專利5,850,024)，無苯丙氨酸蛋白(專利申請(qǐng)WO96/17064)，白蛋白(專利申請(qǐng)WO97/35023)，β-伴球蛋白(專利申請(qǐng)WO00/19839)，11S(美國專利6,107,051)，α-hordothionin(美國專利5,885,802和5,88,5801)arcelin種子儲(chǔ)存蛋白(美國專利5,270,200)凝集素(美國專利6,110,891)和麥谷蛋白(美國專利5,990,389和5,914,450)。優(yōu)選的脂肪酸途徑酶包括硫酯酶(美國專利5,512,482；5,530,186；5,945,585；5,639,790；5,807,893；5,955,650；5,955,329；5,759,829；5,147,792；5,304,481；5,298,421；5,344,771；和5,760,206)和去飽和酶(美國專利5,689,050；5,663,068；5,614,393；5,856,157；6,117,677；6,043,411；6,194,167；5,705,391；5,663,068；5,552,306；6,075,183；6,051,754；5,689,050；5,789,220；5,057,419；5,654,402；5,659,645；6,100,091；5,760,206；6,172,106；5,952,544；5,866,789；5,443,974；和5,093,249)。優(yōu)選的生育酚生物合成酶包括tyrA，slr1736，ATPT2，dxs，dwr，GGPPS，HPPD，GMT，MT1，tMT2，AANT1，slr1737和尿黑酸雙加氧酶的反義構(gòu)建體(Kridl等，SeedSci.Res.，1209219(1991)；Keegstra，Cell，56(2)247-53(1989)；Nawrath，等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，9112760-12764(1994)；Xia等，J.Gen.Microbiol.，1381309-1316(1992)；Cyanobasehttp//www.kazusa.or.jp/cyanobase；Lois等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，95(5)2105-2110(1998)；Takahashi等Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，95(17)9879-9884(1998)；Norris等，PlantPhysiol.，1171317-1323(1998)；Bartley和Scolnik，PlantPhysiol，1041469-1470(1994)；Smith等，PlantJ.，1183-92(1997)；WO00/32757；WO00/10380；SaintGuily等，PlantPhysiol.，100(2)1069-1071(1992)；Sato等.，J.DNARes.，7(1)31-63(2000))。優(yōu)選的氨基酸生物合成酶包括鄰氨基苯甲酸合成酶(美國專利5,965,727，專利申請(qǐng)WO97/26366，WO99/11800和WO99/49058)，色氨酸脫羧酶(專利申請(qǐng)WO99/06581)，蘇氨酸脫羧酶(美國專利5,534,421和5,942,660；專利申請(qǐng)WO95/19442)，蘇氨酸脫氨酶(專利申請(qǐng)WO99/02656和WO98/55601)，和天冬氨酸激酶(美國專利5,367,110；5,858,749和6,040,160)。優(yōu)選的淀粉分支酶包括在美國專利6,232,122和6,147,279以及專利申請(qǐng)WO97/22703中列舉的那些?？蛇x擇地，第二條結(jié)構(gòu)性核酸序列可能被設(shè)計(jì)來下調(diào)特定核酸序列。這一般通過將該第二條結(jié)構(gòu)性氨基酸以反義方向可操作地與啟動(dòng)子連接來實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這種反義技術(shù)。任何核酸序列以這種方式被負(fù)調(diào)控。優(yōu)選的靶核酸序列含有低含量的必需氨基酸，但是在特定組織中以較高水平被表達(dá)。例如，β-伴球蛋白和大豆球蛋白在種子中被豐富地表達(dá)，但是從必需氨基酸來考慮是缺乏營養(yǎng)的。這種反義方法也可以被用于有效地從植物來源的foodstuff去除其他不期望的蛋白質(zhì)，如拒食素(如凝集素)、白蛋白和過敏原，或者下調(diào)參與降解期望的化合物如必需氨基酸的分解代謝酶?？蛇x擇的標(biāo)記載體或構(gòu)建體還可以包括可選擇的標(biāo)記?？蛇x擇的標(biāo)記還可以被用于選擇含有外源遺傳物質(zhì)的植物或植物細(xì)胞。這種例子包括但是不限于neo基因(Potrykus等，1985)，其編碼卡那霉素抗性，可以用卡那霉素、RptII、G418、hpt等選擇；bar基因，其編碼bialaphos抗性；突變EPSP合成酶基因(Hinchee等，1988；Reynaerts等，1988)；aadA(Jones等，1987)，其編碼草甘膦抗性；腈水解酶基因，其賦予對(duì)bromoxynil的抗性(Stalker等，1988)；突變的乙酰乙酸合成酶基因(ALS)，其賦予咪唑酮和磺脲抗性(歐洲專利申請(qǐng)154,204(1985))，ALS(D′Halluin等，1992)，和甲氨蝶呤抗性DHFR基因(Thillet等，1988)。可選擇的標(biāo)記優(yōu)選是GUS、綠色熒光蛋白(GFP)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(nptII)，熒光素酶(LUX)，抗生素抗性編碼序列或除草劑(例如，草甘膦)抗性編碼序列?？蛇x擇的標(biāo)記最優(yōu)選為卡那霉素、潮霉素或除草劑抗性標(biāo)記。載體或構(gòu)建體還可以包括篩選標(biāo)記。篩選標(biāo)記可以被用以監(jiān)控表達(dá)。示例性的篩選標(biāo)記包括β-葡萄糖苷酸酶或uidA基因(GUS)，其編碼其各種發(fā)光底物已知的酶(Jefferson，1987)；R-基因座基因，其編碼在植物組織中調(diào)節(jié)花色苷色素(紅色)生成的產(chǎn)物(Dellaporta等，1988)；β-內(nèi)酰胺酶基因(Sutcliffe等，1978)，編碼一種各種發(fā)光底物已知的酶的基因(例如PADAC，發(fā)光頭孢菌素(cephalosporin))；熒光素酶基因(Ow等，1986)；xylE基因(Zukowsky等，1983)，其編碼能夠轉(zhuǎn)化發(fā)光的兒茶酚的兒茶酚雙加氧酶；α-淀粉酶基因(Ikatu等，1990)；酪氨酸酶基因(Katz等，1983)，其編碼能夠?qū)⒗野彼嵫趸癁镈OPA和多巴醌的酶，隨后多巴醌濃縮為黑色素；α-半乳糖苷酶，其轉(zhuǎn)化發(fā)光的α半乳糖底物。術(shù)語或短語“可選擇的或篩選的標(biāo)記基因”中包括的還有編碼可選擇標(biāo)記的基因，這些可選擇標(biāo)記的分泌可以被檢測(cè)來作為鑒定或選擇被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的手段。例子包括編碼可以被抗體作用確定的可分泌抗原標(biāo)記，或者甚至是可以酶促地檢測(cè)的可分泌酶?？煞置诘鞍追譃樵S多種類，包括可檢測(cè)的小的擴(kuò)散性蛋白(如通過ELISA)，在細(xì)胞外溶液中可檢測(cè)的小的活性酶(如α-淀粉酶，β-內(nèi)酰胺酶，膦絲菌素轉(zhuǎn)移酶)或者被插入或捕獲在細(xì)胞壁上的蛋白質(zhì)(例如包括先導(dǎo)序列的蛋白質(zhì)如存在于延展的表達(dá)單位中的蛋白或煙草PR-S)。其他可能的可選擇的和/或可篩選的標(biāo)記基因?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。重組載體中的其他元件各種順式作用非翻譯的5′和3′調(diào)控序列可以被包括在重組核酸載體中。任何一種這樣調(diào)控序列可以與其他調(diào)控序列一起被提供在重組載體中。這種組合可以被設(shè)計(jì)和改進(jìn)來產(chǎn)生期望的調(diào)控特性。3′非翻譯區(qū)通常具有轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和聚腺苷酸化信號(hào)，聚腺苷酸化信號(hào)在植物中起作用來將腺苷酸添加到mRNA的3′端。這些元件可以從胭脂堿合成酶(nos)編碼序列、大豆7Sα′儲(chǔ)存蛋白編碼序列、arcelin-5編碼序列、白蛋白編碼序列和豌豆ssRUB1SCOE9編碼序列的3′區(qū)獲得。一般地，位于多聚腺苷酸化位點(diǎn)下游的數(shù)百個(gè)堿基對(duì)的核酸序列起終止轉(zhuǎn)錄的作用。這些區(qū)域是被轉(zhuǎn)錄mRNA有效多聚腺苷酸化所必需的。轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子也可以被結(jié)合作為重組載體的一部分。因此，重組載體優(yōu)選地含有一個(gè)或多個(gè)5′非翻譯前導(dǎo)序列，其起增強(qiáng)核酸序列表達(dá)的作用。這種增強(qiáng)子序列可能有望增加或改變生成的mRNA的轉(zhuǎn)錄效率。優(yōu)選的5′核酸序列包括dSSU5′、PetHSP705′和GmHSP17.95′(美國專利5,362,865)。重組載體可能還包含編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸序列。這種肽可以被用于引導(dǎo)蛋白質(zhì)到細(xì)胞外區(qū)域、質(zhì)體或到細(xì)胞內(nèi)外的一些其他腔室(參見，如EP0218571、美國專利4,940,835；5,88,624；5,610,041；5,618,988和6,107,060)。重組載體中的結(jié)構(gòu)核酸序列可能包含內(nèi)含子。該內(nèi)含子對(duì)于結(jié)合性核酸序列來說可能是異源的。優(yōu)選的內(nèi)含子包括水稻肌動(dòng)蛋白內(nèi)含子和玉米HSP70內(nèi)含子。融合蛋白任何上述的結(jié)構(gòu)性核酸序列及其改進(jìn)形式可以與其他核酸序列連接來編碼融合蛋白。其他核酸序列優(yōu)選編碼至少1種氨基酸、肽或蛋白質(zhì)。存在許多可能的融合組合。例如，融合蛋白可能提供一種“標(biāo)記”的表位來方便融合蛋白的檢測(cè)，例如，GST，GFP，F(xiàn)LAG，或多聚HIS。這種融合優(yōu)選編碼1-50個(gè)氨基酸，更加優(yōu)選5-30個(gè)其他的氨基酸，甚至最優(yōu)選在5-20個(gè)氨基酸?？蛇x擇地，融合可能具有調(diào)控、酶促、細(xì)胞信號(hào)或細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。例如，編碼質(zhì)粒轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列可以被添加來引導(dǎo)融合蛋白到種子中的葉綠體中。這種融合配偶體優(yōu)選編碼1-1000個(gè)其他氨基酸，更加優(yōu)選5-500個(gè)其他氨基酸，和甚至更加優(yōu)選10-250個(gè)氨基酸。序列分析在本發(fā)明中，序列相似性或同一性優(yōu)選采用序列分析軟件包TM的“BestFit”或“Gap”程序來確定(版本10；GeneticsComputerGroup，Inc.，UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter，Madison，WI)?！癎ap”采用Needleman和Wunsch(1970)的算法來尋找兩條序列的排列，這種排列使匹配數(shù)量最大化和缺口數(shù)量最小化。“BestFit”進(jìn)行兩條序列之間的相似性的最好片段的最佳排列。最佳排列采用Smith和Waterman(SmithandWaterman，1981；Smith等，1983)的局部同源性算法通過插入缺口來最小化匹配數(shù)量來發(fā)現(xiàn)。上面描述的序列分析軟件包含有大量其他有用的序列分析工具來確定本公開的核苷酸和氨基酸序列的同系物。例如，“BLAST”程序在特定數(shù)據(jù)庫(例如由Bethesda，MD的國家生物信息中心(NCBI)維護(hù)的序列數(shù)據(jù)庫)中檢索與被檢索的序列(肽或核酸)相似的序列；“FastA”(Lipman和Pearson，1985；參見還有Pearson和Lipman，1988；Pearson，1990)進(jìn)行Pearson和Lipman檢索來確定被檢索序列與一組相同類型(核酸或蛋白質(zhì))的序列之間的相似性?！癟fastA”進(jìn)行Pearson和Lipman檢索來確定一種蛋白質(zhì)的被查詢序列與任何一組核苷酸序列(在進(jìn)行比較之前，以所有6種閱讀框翻譯核苷酸序列)之間的相似性；“FastX”進(jìn)行Pearson和Lipman檢索來確定被檢索的核酸序列與一組蛋白質(zhì)序列之間的相似性，考慮移碼?！癟fastX”進(jìn)行Pearson和Lipman檢索來確定被檢索的蛋白質(zhì)序列與任何一種核苷酸序列之間的相似性，考慮移碼(在進(jìn)行比較之前，翻譯核酸序列的兩條鏈)。探針和引物能夠特異性地雜交到互補(bǔ)性核酸序列上的短核酸序列可以被制備，并被用于本發(fā)明。這種短的核酸分子可以被用作探針來鑒定在特定樣本中是否存在互補(bǔ)的核酸序列。因此，通過構(gòu)建與特定核酸序列的小部分互補(bǔ)的核酸探針，核酸序列的存在可以被檢測(cè)和評(píng)價(jià)。可選擇地，短的核酸序列可以被用作寡核苷酸引物，采用PCR技術(shù)來擴(kuò)增或突變互補(bǔ)的核酸序列。這些引物可能還方便擴(kuò)增相關(guān)互補(bǔ)的核酸序列(例如，來自其他物種的相關(guān)核酸序列)。短的核酸序列可以被用作引物和特異地作為PCR引物。PCR探針是能夠在雙鏈結(jié)構(gòu)中與其他核酸一起起始聚合酶活性的核酸分子。本領(lǐng)域存在各種用于確定PCR引物結(jié)構(gòu)的方法和PCR技術(shù)。采用程序如Primer3問(www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi)，STSPipeline(www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/www.STSPipeline)或者GeneUp(Pesole等，1998)在計(jì)算機(jī)中進(jìn)行的檢索可以被用于確定潛在的PCR引物。任何本文公開的核酸序列可以被用作引物或探針。這些探針或引物的使用極大地方便確定轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因植物含有本發(fā)明公開的啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)性核酸序列。這種探針或引物還可以被用于篩選與本申請(qǐng)公開的啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)性核酸序列相關(guān)或具有同源性的其他核酸序列的cDNA或基因組文庫。引物或探針通常與被鑒定、擴(kuò)增或突變的核酸序列的一部分互補(bǔ)，該序列足夠長以與其互補(bǔ)體形成穩(wěn)定的和序列特異性的雙鏈核酸分子。引物或探針優(yōu)選為長約10到約200個(gè)核苷酸，更加優(yōu)選為長約10到約100個(gè)核苷酸，甚至更加優(yōu)選為長約10到約50個(gè)核苷酸，和最優(yōu)選為長約14到約30個(gè)核苷酸。引物或探針例如但是不限于通過直接化學(xué)合成、通過PCR(美國專利4,683,195和4,683,202)或通過從較大的核酸分子上切除核酸特異性片段來制備。轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)化的植物宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包含被可操作地連接到異源的結(jié)構(gòu)性核酸序列的啟動(dòng)子。其他核酸序列也可能與啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)性核酸序列一起被導(dǎo)入到植物或宿主細(xì)胞中。這些其他序列可能包括3′轉(zhuǎn)錄終止子、3′多聚腺苷酸信號(hào)、其他的非翻譯核酸序列、轉(zhuǎn)運(yùn)或靶向序列、可選擇標(biāo)記、增強(qiáng)子和操縱子。上面描述了本發(fā)明的優(yōu)選核酸序列，包括重組載體、結(jié)構(gòu)性核酸序列、啟動(dòng)子和其他調(diào)控元件。在優(yōu)選實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物和被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞包含來自蠶豆的啟動(dòng)子。在更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物和被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞包含任何本文描述的本發(fā)明的核酸分子，包括選自SEQIDNO1，2，3，4，9，10，或11和其互補(bǔ)體的核酸序列。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物是大豆植物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的大豆植物包括一種或多種被導(dǎo)入的本發(fā)明的核酸分子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的被轉(zhuǎn)化大豆植物包含選自SEQIDNO1，2，3，4，5，9，10，或11的核酸分子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化大豆植物包含由SEQIDNO4組成的核酸分子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化大豆植物包含由SEQIDNO5組成的核酸分子。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，一種植物、細(xì)胞或生物體的一種或多種成分與具有“相似遺傳背景”的植物、細(xì)胞或生物體比較。在優(yōu)選方面，“相似遺傳背景”是被比較的生物體共同具有50％或更多的其核酸遺傳物質(zhì)的背景。在更加優(yōu)選方面，相似遺傳背景是被比較的生物體共同具有75％或更多，甚至更加優(yōu)選約90％或更多的其核酸遺傳物質(zhì)的背景。在另一個(gè)甚至更加優(yōu)選方面，相似的遺傳背景是被比較的生物體是植物背景，除了采用植物轉(zhuǎn)化技術(shù)導(dǎo)入最先導(dǎo)入的任何遺傳物質(zhì)外，該植物是同基因的。用于制備這種重組載體的方法在本領(lǐng)域是熟知的。例如，用于制備突變特別適合于植物轉(zhuǎn)化的重組載體的方法被描述在美國專利4,971,908；4,940,835；4,769,061；和4,757,011中。這些載體也被評(píng)述(Rodriguez等，1988；Glick等，1993)。用于在細(xì)胞和高等植物中表達(dá)核酸的典型載體在本領(lǐng)域是熟知的，包括來自根癌農(nóng)桿菌的腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒的載體(Rogers等，1987)?？捎糜谥参镛D(zhuǎn)化的其他重組載體也已經(jīng)被描述(Fromm等，1985)。這種重組載體的元件包括但是不限于上面討論的那些。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞通常是任何與本發(fā)明相容的細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的宿主植物或細(xì)胞可以是或來源于單子葉植物或雙子葉植物，包括但是不限于，canola、海甘藍(lán)(crambe)、玉米、芥菜、蓖麻子、芝麻、棉籽、亞麻子、大豆、Arabidopsisphaseolus、花生、紫花苜蓿、小麥、稻、燕麥、高梁、油菜籽、黑麥、tritordeum、粟類(millet)、酥油草(fescue)、多年生黑麥草(perennialryefrass)、甘蔗、酸果(cranberry)、番木瓜(papaya)、香蕉、紅花、油椰子(oilpalms)、亞麻(flax)、香瓜(muskmelon)、蘋果、黃瓜、石斛蘭(dendrobium)、唐菖蒲(gladiolus)、菊花(chrysanthemum)、百合(liliacea)、棉花、桉樹(eucalyptus)、向日葵、蕓苔(Brassicacampestris)、歐洲油菜(Brassicanapus)、草坪草(turfgrass)、甜菜(sugarbeet)、咖啡樹(coffee)和薯蕷屬(dioscorea)(Christou，ParticleBombardnzentforGeneticEngineeringofPlants，BiotechnologyIntelligenceUnit，學(xué)院出版社，圣地亞哥，加利福尼亞(1996))，canola、玉米、蕓苔、歐洲油菜、油菜籽、大豆、紅花、小麥，水稻和向日葵是優(yōu)選的，而canola、油菜籽、玉米、蕓苔，歐洲油菜、大豆、向日葵、紅花、油椰子和花生是更加優(yōu)選的。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，植物或細(xì)胞是或者來源于canola。在另一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，植物或細(xì)胞是或來源于歐洲油菜。在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，植物或細(xì)胞是或者來源于大豆。大豆細(xì)胞或植物優(yōu)選是原種(elite)大豆品系。“原種品系”是任何從繁育和從優(yōu)良的農(nóng)學(xué)操作選擇中獲得的品系。原種品系的例子是農(nóng)場(chǎng)主和大豆育種工作者能夠購買到的品系，如HARTZTM品種H4994，HARTZTM品種H5218，HARTZTM品種H5350，HARTZTM品種H5545，HARTZTM品種H5050，HARTZTM品種H5454，HARTZTM品種H5233，HARTZTM品種H5488，HARTZTM品種HLA572，HARTZTM品種H6200，HARTZTM品種H6104，HARTZTM品種H6255，HARTZTM品種H6586，HARTZTM品種H6191，HARTZTM品種H7440，HARTZTM品種H4452RoundupReadyTM，HARTZTM品種H4994RoundupReadyTM，HARTZTM品種H4988RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5000RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5147RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5247RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5350RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5545RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5855RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5088RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5164RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5361RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5566RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5181RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5889RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5999RoundupReadyTM，HARTZTM品種H6013RoundupReadyTM，HARTZTM品種H6255RoundupReadyTM，HARTZTM品種H6454RoundupReadyTM，HARTZTM品種H6686RoundupReadyTM，HARTZTM品種H7152RoundupReadyTM，HARTZTM品種H7550RoundupReadyTMHARTZTM品種H8001RoundupReadyTM(HARTZSEED，Stuttgart，AR)；A0868，AG0901，A1553，A1900，AG1901，A1923，A2069，AG2101，AG2201，A2247，AG2301，A2304，A2396，AG2401，AG2501，A2506，A2553，AG2701，AG2702，A2704，A2833，A2869，AG2901，AG2902，AG3001，AG3002，A3204，A3237，A3244，AG3301，AG3302，A3404，A3469，AG3502，A3559，AG3601，AG3701，AG3704，AG3750，A3834，AG3901，A3904，A4045AG4301，A4341，AG4401，AG4501，AG4601，AG4602，A4604，AG4702，AG4901，A4922，AG5401，A5547，AG5602，A5704，AG5801，AG5901，A5944，A5959，AG6101，QR4459，andQP4544(AsgrowSeeds，DesMoines，IA)；DeKalb品種CX445(DeKalb，IL)。本發(fā)明還涉及一種制備轉(zhuǎn)化植物的方法，該植物從5′到3′方向包括被可操作地連接到異源結(jié)構(gòu)性核酸序列的啟動(dòng)子。其他序列也可以與啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)性核酸來一起被導(dǎo)入到植物中。這些其他可能包括3′轉(zhuǎn)錄終止子、3′多聚腺苷酸化信號(hào)、其他非翻譯序列、轉(zhuǎn)運(yùn)或靶向序列、可選擇標(biāo)記、增強(qiáng)子和操作子。優(yōu)選的重組載體、結(jié)構(gòu)性核酸序列、啟動(dòng)子和其他調(diào)控序列包括但是不限于本文描述的那些。這種方法通常包括選擇合適的植物、用重組載體轉(zhuǎn)化植物，獲得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的步驟。有許多用于將核酸導(dǎo)入植物的方法。合適方法包括細(xì)菌感染(如農(nóng)桿菌)、雙元人工染色體載體、直接呈遞核酸(如通過PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、干燥/抑制介導(dǎo)的核酸攝取、電穿孔、用碳化硅纖維激發(fā)，和加速核酸包被的粒子等(在Potrykus等，1991中被評(píng)述))。用于將核酸導(dǎo)入細(xì)胞中的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。一般可以將方法分為四類(1)化學(xué)方法(Graham和vanderEb，1973；Zatloukal等，1992)；(2)物理方法如微注射(Capecchi，1980)、電穿孔(Wong和Neumann，1982；Fromm等，1985；美國專利5,384,253)和粒子加速(Johnston和Tang，1994；Fynan等，1993)；(3)病毒載體(Clapp，1993；Lu等，1993；Eglitis和Anderson，1988)；和(4)受體介導(dǎo)的機(jī)制(Curiel等，1992；Wagner等，1992)?？蛇x擇地，可以通過直接注射植物生殖器官將核酸直接導(dǎo)入到花粉中(Zhou等，1983；Hess，1987；Luo等，1988；Pena等，1987)。在另一個(gè)方面，核酸還可以被注射到未成熟的胚中(Neuhaus等，1987)。本領(lǐng)域已經(jīng)教導(dǎo)了從被轉(zhuǎn)化的植物原生質(zhì)體或外植體再生、發(fā)育和培養(yǎng)植物(Weissbach和Weissbach，1988；Horsch等，1985)。轉(zhuǎn)化株通常在存在選擇性培養(yǎng)液時(shí)被培養(yǎng)，該培養(yǎng)液選擇被成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并且包括再生植物幼苗(Fraley等，1983)。這種幼苗通常在2-4個(gè)月之內(nèi)獲得。然后幼苗被轉(zhuǎn)移到合適的誘導(dǎo)根的培養(yǎng)液中，該培養(yǎng)液含有選擇試劑和防止細(xì)菌生長的抗生素。許多幼苗將會(huì)生長出根來。然后這些幼苗被轉(zhuǎn)移到土壤或者其他介質(zhì)中，使根繼續(xù)發(fā)育。所概述的方法通常根據(jù)所選用的特定植物而改變。優(yōu)選地，再生的轉(zhuǎn)基因植物是自花授粉的，產(chǎn)生純合的轉(zhuǎn)基因植物?？蛇x擇地，從再生轉(zhuǎn)基因植物中獲得的花粉可以與非轉(zhuǎn)基因植物雜交，優(yōu)選與農(nóng)業(yè)上重要的品種的近交系雜交。相反，來自非轉(zhuǎn)基因植物的花粉可以被用于對(duì)再生的轉(zhuǎn)基因植物授粉。轉(zhuǎn)基因植物可以將編碼增強(qiáng)基因表達(dá)的核酸序列傳遞給其后代。轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)選是編碼增強(qiáng)基因表達(dá)的核酸純合的，并且通過有性繁殖將該序列傳遞給所有其后代。后代可能從由轉(zhuǎn)基因植物生成的種子中生長得到。然后，這些額外的植物被自花授粉來產(chǎn)生該植物的真正繁殖品系。評(píng)價(jià)來自這些植物的后代的基因表達(dá)。基因表達(dá)可以通過許多常規(guī)方法如western印跡、northern印跡、免疫沉淀和ELISA來檢測(cè)。本發(fā)明的植物或試劑可以被用于方法中，例如但是不限于，來獲得在其中表達(dá)結(jié)合核酸分子的種子，獲得結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)生升高的種子，獲得結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)生升高的食物，獲得結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)生升高的原種和獲得結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)生升高的油。被用于這種方法中的植物可以被加工。植物或植物部分可以被與其他植物部分分開或分離。用于該目的的優(yōu)選植物部分是種子。一般認(rèn)為，甚至在與其他植物部分分開或分離后，被分離或分開的植物部分可能被其他植物部分污染。在優(yōu)選方面，被分開的植物部分超過被分開的物質(zhì)的約50％(w/w)，更加優(yōu)選地，超過被分開的物質(zhì)的約75％(w/w)，和甚至更加優(yōu)選超過被分開的物質(zhì)的約90％(w/w)。通過這種方法生成的本發(fā)明的植物或植物部分可以用已知技術(shù)加工成產(chǎn)品。優(yōu)選的產(chǎn)品是食物、原種(feedstock)和油。飼料、食物、蛋白質(zhì)和油的制備物任何本發(fā)明的植物或其部分可以被加工來制備飼料、食物、蛋白質(zhì)或油制備物。用于該目的的特別優(yōu)選的植物部分是種子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，飼料、食物、蛋白質(zhì)或油制備物是給反芻動(dòng)物設(shè)計(jì)的。制備飼料、食物、蛋白質(zhì)或油制備物的方法在本領(lǐng)域是熟知的。參見，如美國專利4,957,748；5,100,679；5,219,596；5,936,069；6,005,076；6,146,669；和6,156,227。在優(yōu)選實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)制備物是高蛋白制備物。這種高蛋白制備物優(yōu)選具有超過約5％w/v的蛋白質(zhì)含量，更加優(yōu)選超過約10％w/v，和甚至更加優(yōu)選超過約15％w/v。在優(yōu)選的油制備物中，油制備物是高油含量的制備物，具有來自本發(fā)明的植物或其部分的油成分，超過約5％w/v，更加優(yōu)選超過約10％w/v，和甚至更加優(yōu)選超過約15％w/v。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，油制備物是液體，體積超過1，5，10，或50L。本發(fā)明提供從本發(fā)明的植物制備或通過本發(fā)明的方法生成的油。這種油可以是任何生成的產(chǎn)物的次要或主要成分。而且，這種油可以與其他油混合。在更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，從本發(fā)明的植物制備或由本發(fā)明的方法生成的油在體積或重量上組成任何產(chǎn)物的油成分的約0.5％，1％，5％，10％，25％，50％，75％，或約90％以上。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，油制備物被混合，在體積上占該混合物的約10％，25％，35％，50％，或約75％以上。從本發(fā)明的植物中制備的油可以與一種或多種有機(jī)溶劑或石油餾出物混合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的食物與其他食物混合。在優(yōu)選實(shí)施方案中，從本發(fā)明的植物中制備的或通過本發(fā)明方法生成的食物在體積或重量上占任何產(chǎn)物的食物成分的約0.5％，1％，5％，10％，25％，50％，75％，或約90％以上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，食物制備物可以被混合，并且在體積上占該混合物的約10％，25％，35％，50％，或約75％以上。種子容器植物的種子被放置在容器中。如在此所用，容器是任何能夠裝載這種種子的物體。容器優(yōu)選含有超過約500，1000，5000，或約25000粒種子，其中至少約10％，25％，50％，75％，或約100％的種子是來自本發(fā)明的植物。育種程序本發(fā)明的植物可以是育種程序的一部分或者來自育種程序。育種方法的選擇取決于植物繁殖模式、被改進(jìn)的特性的遺傳性和商業(yè)上所用的栽培種的類型(如F1雜合栽培種、純系栽培種等)。被選擇的非限制性的用繁殖本發(fā)明的植物的方法被列舉在下文中。育種程序可以采用標(biāo)記輔助性選擇任何雜交后代來加強(qiáng)。還應(yīng)當(dāng)理解，任何商業(yè)性的和非商業(yè)性的栽培種可以被用于育種程序。因素如，emergencevigor、營養(yǎng)勢(shì)(vegetativevigor)、應(yīng)激耐受、抗病性、分枝、開花、結(jié)果、種子大小、種子密度、持久性和脫粒性等通常會(huì)決定該選擇。對(duì)于高度遺傳的特性，選擇在單個(gè)區(qū)域中被評(píng)價(jià)的優(yōu)良個(gè)體植物是有效的，而對(duì)于低遺傳力的特性，應(yīng)當(dāng)在從重復(fù)評(píng)價(jià)相關(guān)植物家族獲得的平均值的基礎(chǔ)上進(jìn)行選擇。常用的選擇方法一般包括家譜選擇、改進(jìn)的家譜選擇、群體選擇和輪回選擇。在優(yōu)選實(shí)施方案中，進(jìn)行回交或輪回育種程序。遺傳的復(fù)雜性影響育種方法的選擇。回交育種可以被用于將一種或少數(shù)高度遺傳的特性優(yōu)良基因轉(zhuǎn)移給期望的栽培種。這種方法已經(jīng)被廣泛地用于繁育抗病的栽培種。各種輪回選擇技術(shù)被用于改進(jìn)由大量基因控制的數(shù)量遺傳特性。輪回選擇在自花授粉的農(nóng)作物中的用途取決于授粉的難易程度、每次自花授粉的成功雜交的頻率和每次成功雜交的雜交后代的數(shù)量。繁育品系可以被檢測(cè)，在代表商業(yè)目標(biāo)地區(qū)的環(huán)境下與合適的標(biāo)準(zhǔn)物比較兩代或多代。最好的品系是新的商業(yè)栽培中的候選；那些仍然缺乏特性的品系可以被用作親本來制備作為進(jìn)一步選擇的新群體。一種確定較好的植物的方法是觀察其相對(duì)于其他試驗(yàn)植物和相對(duì)于廣泛種植的標(biāo)準(zhǔn)栽培種的性能。如果一次觀察不是決定性的，重復(fù)觀察可以提供對(duì)其遺傳價(jià)值的較好評(píng)價(jià)。育種人員能夠選擇和雜交兩種或多種親本品系，接著通過重復(fù)自花授粉和選擇，產(chǎn)生許多新的遺傳組合。開發(fā)新的栽培種需要開發(fā)和選擇品種，雜交這些品種，和選擇較好的雜合雜交。雜合的種子可以通過手工雜交被選擇的雄性繁育親本或者通過采用雄性不育體系來制備。根據(jù)某些單基因特性來選擇雜種，如莢顏色、花的顏色、種子產(chǎn)量、軟毛(pubescene)顏色或除草劑抗性，該特性表明種子是真正雜種。關(guān)于親本品系的其他數(shù)據(jù)，以及雜種的表型，影響育種人員的決定是否繼續(xù)特定的雜合雜交。家譜育種和輪回選擇育種方法可以被用于從繁育群體中開發(fā)栽培種。育種程序?qū)碜詢煞N或多種栽培種或各種廣泛來源的期望特性結(jié)合到育種庫(breedingpool)中，通過自花授粉和選擇期望表型從育種庫中開發(fā)栽培種。新的栽培種可以被評(píng)價(jià)來確定哪種具有商業(yè)潛能。家譜育種通常被用來改進(jìn)自花授粉的農(nóng)作物。兩個(gè)具有期望、互補(bǔ)特性的親本進(jìn)行雜交來制備F1。通過自花授粉一株或多株F1來制備F2群體。從最好的家族中選擇最佳個(gè)體。重復(fù)檢測(cè)家族可以在F4代開始進(jìn)行來提高低遺傳力的特性的選擇效率。在近交的高級(jí)階段(即F6和F7)，最好的品系或表型相似品系被檢測(cè)作為新的栽培種的潛在釋放?；亟挥N已經(jīng)被用于將簡(jiǎn)單遺傳、高遺傳特性的基因轉(zhuǎn)移到期望的純合栽培種或作為輪回親本的近交品系中。被轉(zhuǎn)移的特性的來源被稱為供體親本。生成的植物被期望具有輪回親本(如栽培種)的特征和從供體親本轉(zhuǎn)移來的期望特性。在開始雜交后，具有供體親本表型的個(gè)體被選擇和重復(fù)與輪回親本雜交(回交)。生成的親本被期望具有輪回親本(如栽培種)的特征和從供體親本轉(zhuǎn)移來的期望特性。在嚴(yán)格意義上，單一種子傳代程序是指種植一種分離群體，每棵植物收獲一粒種子樣本，并且使用該種子樣本來種植下一代。當(dāng)該群體已經(jīng)從F2發(fā)展到期望水平的近交程度時(shí)，產(chǎn)生品系的植物各自追溯到不同的F2個(gè)體。由于一些種子未能夠發(fā)芽或者一些植物不能生產(chǎn)至少一粒種子，群體中植物的數(shù)量逐代減少。結(jié)果，當(dāng)世代進(jìn)展完成時(shí)，并非所有最初被取樣在群體中的F2植物都被后代表現(xiàn)。在多種子程序中，育種人員通常從群體的每棵植物中收獲一個(gè)或多個(gè)莢，并將它們?cè)谝黄鹈摿硇纬膳?。批量的一部分被用來種植下一代，一部分被保存。該程序已經(jīng)被稱作為改進(jìn)的單一種子傳代或莢-批量技術(shù)。多種子程序已經(jīng)被用于在收獲時(shí)節(jié)約勞力。用機(jī)器脫粒莢顯著快于單一種子程序中通過手工從每個(gè)莢中取出種子。多種子程序還使得可能在每代近交中種植相同數(shù)量種子群體。對(duì)于通常用于不同特性和農(nóng)作物的其他育種方法的描述可以在一些參考書籍之一找到(如Fehr，PrinciplesofCultivarDevelopment，1，2-3(1987))。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物還可以采用孤雌生殖方法繁殖。孤雌生殖是植物中的繁殖的遺傳控制方法，其中胚乳不是通過卵子和精子的結(jié)合形成。有三種基本的孤雌生殖繁殖類型1)其中胚在從核來源的胚囊中由染色體不減數(shù)的卵子發(fā)育得到的孤雌生殖，2)其中胚在從大孢子母細(xì)胞來源的胚囊中由染色體不減數(shù)的卵子發(fā)育得到的二倍數(shù)孢子形成(diplospory)，和3)胚直接從體細(xì)胞發(fā)育得到的不定胚生殖。在大多數(shù)孤雌生殖形式中，假受精或極體核受精來生成胚乳對(duì)于種子發(fā)育能力是必需的。在無孢子生殖中，保育栽培種可以被用作種子中胚乳形成的花粉來源。由于栽培種的不減數(shù)卵子孤雌發(fā)育，保育栽培種不影響無孢子生殖的單性生殖的栽培種的遺傳學(xué)，而是可能生成胚乳。孤雌生殖在經(jīng)濟(jì)上是重要的，特別是在轉(zhuǎn)基因植物中，因?yàn)闊o論多大的雜合程度，其使任何的基因型進(jìn)行純育。因此，通過孤雌生殖繁殖，雜合的轉(zhuǎn)基因植物能夠在整個(gè)重復(fù)的生活周期中保持其遺傳的忠實(shí)性。用于制備孤雌生殖的植物的方法在本領(lǐng)域是已知的。參見，美國專利5,811,636。其他生物體本發(fā)明的核酸可以被導(dǎo)入任何細(xì)胞或生物體中，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物、魚細(xì)胞、魚、鳥細(xì)胞、鳥、藻類細(xì)胞、藻類、真菌細(xì)胞、真菌或細(xì)菌細(xì)胞。優(yōu)選的宿主和轉(zhuǎn)化體包括真菌細(xì)胞如曲霉菌(Aspergillus)、酵母、哺乳動(dòng)物、特別是牛和豬、昆蟲、細(xì)菌和藻類。優(yōu)選的細(xì)菌是大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌。轉(zhuǎn)化這種細(xì)胞或生物體的方法在本領(lǐng)域是已知的(EP0238023；Yelton等，1984；Malardier等，1989；Becker和Guarente；Ito等，1983；Hinnen等，1978；以及Bennett和LaSure，1991)。制備來自這種生物體的蛋白質(zhì)的方法也是已知的(Kudla等，1990；Jarai和Buxton，1994；Verdier，1990；MacKenzie等，1993；Hartl等，1994；Bergeron等，1994；Demolder等，1994；Craig，1993；Gething和Sambrook，1992；Puig和Gilberr，1994；Wang和Tsou，1993；Robinson等，1994；Enderlin和Ogrydziak，1994；Fuller等，1989；Julius等，1984；以及Julius等，1983)。實(shí)施例提供如下實(shí)施例，并且這些實(shí)施例無論如何不被解釋為限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1-生成來自蠶豆的USP啟動(dòng)子的克隆USP啟動(dòng)子通過PCR擴(kuò)增(ExpandHighFidelityPRCSystem，產(chǎn)品目錄號(hào)1732641，RocheMolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)從蠶豆基因組DNA中獲得，使用按照公開的序列(GenBankAccessionX56240)設(shè)計(jì)的引物。用于擴(kuò)增USP啟動(dòng)子的引物為5′-AAACTGCAGCAAATTTACACATTG-3′(SEQIDNO6)；和5′-AAACCATGGTTGACTGGCTATG-3′(SEQIDNO7)。然后，分離的擴(kuò)增產(chǎn)物被亞克隆到載體pMON13773中(附圖1)，生成克隆pMON58101(USP99)(附圖2)、pMON58102(USP91)(附圖3)，和pMON58106(USP88)(附圖4)。實(shí)施例2-生成嵌合的eUSP88啟動(dòng)子采用pMON58106作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)(ExpandHighFidelityPRCSystem，產(chǎn)品目錄號(hào)1732641，RocheMolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)。如下引物被用于擴(kuò)增5′-AAACTGCAGCAAATTTACACATTG-3′(SEQIDNO6)；和5′-AAACTGCAGGACTACATGCATAAC-3′(SEQIDNO8)。被擴(kuò)增的啟動(dòng)子片段用PstI限制性酶消化，并連接到pMON58106DNA上，pMON58106DNA通過PstI消化和CIP堿性磷酸酶處理來線性化。選擇具有期望方向的質(zhì)粒，稱作為pMON58110(eUSP88)(附圖5)。實(shí)施例3-采用大豆子葉瞬時(shí)轉(zhuǎn)化來評(píng)價(jià)USP啟動(dòng)子在開花后25-28d收獲來自大豆植物的種子(AsgrowA3244)，并且在GAMBORG培養(yǎng)基中(G5893，SigmaCompany，St.Louis，MO)，在25℃下在黑暗中滲透處理過夜，GAMBORG培養(yǎng)液中添加了50mM谷氨酰胺、111mM麥芽糖、125mM棉子糖、125mM甘露糖醇和3g/l純化的瓊脂，pH5.6。得到的125片子葉對(duì)半剪切，并采用基因槍技術(shù)用純化的pMON13773(7Sα′)，pMON58101(USP99)，pMON58102(USP91)，pMON58106(USP88)和pMON58110(Minimum35S)的超螺旋DNA轟擊(Maliga等，1995，″MethodsinPlantMolecularBiology，ALaboratoryCourseManual，″ColdSpringHarborLaboratoryPress，47)。包括與各種啟動(dòng)子構(gòu)建體為1∶1摩爾比的分離的e35S起始的熒光素酶構(gòu)建體作為表達(dá)對(duì)照。被轟擊的組織在25℃下培育48h。從六種被轟擊的大豆子葉中提取蛋白質(zhì)，采用1ml含有0.1M磷酸鉀(pH7.8)，10mMDT，1mMEDTA，5％甘油和蛋白酶抑制劑的提取緩沖液(1片/50ml，RocheMolecularBiochemicals，產(chǎn)品目錄號(hào)1697498，Indianapolis，IN)。100μl蛋白質(zhì)提取物的等分試樣被用于熒光素酶分析，通過Promega進(jìn)行″Steady-Glo″程序(產(chǎn)品目錄號(hào)E2510，PromegaCorporation，Madison，WI)。50μl蛋白質(zhì)提取物的等分試樣被用于稍作改進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)GUS分析操作(Maliga等，1995，″MethodsinPlantMolecularBiology，ALaboratoryCourseManual″，ColdSpringHarborLaboratoryPress，page29)。每種樣本分析兩次，平均值用于數(shù)據(jù)分析。GUS活性用熒光素酶活性規(guī)格化，相對(duì)啟動(dòng)子強(qiáng)度通過任意地設(shè)定基準(zhǔn)啟動(dòng)子7Sα′(pMON13773)(附圖1)為100％來表示。獨(dú)立地重復(fù)試驗(yàn)三次。結(jié)果(附圖14)表明，當(dāng)與7Sα′啟動(dòng)子、通常用于在大豆種子中高水平表達(dá)的基準(zhǔn)啟動(dòng)子比較時(shí)，USP啟動(dòng)子顯著地提高GUS表達(dá)。最小的啟動(dòng)子/GUS構(gòu)建體(pMON58100)是采用35最小啟動(dòng)子起始GUS的低表達(dá)對(duì)照，以約相當(dāng)于7Sα′構(gòu)建體(pMON13773)表達(dá)水平的20％被表達(dá)(附圖1)。實(shí)施例4-制備含有USP啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因大豆植物為了在轉(zhuǎn)基因大豆中檢測(cè)USP啟動(dòng)子的強(qiáng)度，通過如下稍加改進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)分子克隆操作構(gòu)建pMON55526(Arc5/GUS/NOS)，pMON55542(T-Arc5/GUS/NOS)，pMON63605(USP91/GUS/NOS)，pMON58107(USP88/GUS/NOS)，pMON63604(USP99/GUS/NOS)和pMON58113(eUSP88/GUS/NOS)(Sambrook等，MolecularCloningAlaboratorymanual，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress；Maliga等，MethodsinPlantMolecularBiologyAlaboratorycoursemanual，1995，ColdSpringHarborLaboratoryPress)。由FMV啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列、CP4編碼基因和E93′UTR組成的表達(dá)盒被包含在所有轉(zhuǎn)化載體中，作為可選擇標(biāo)記。對(duì)于粒子轟擊轉(zhuǎn)化方法，大豆種子(AsgrowA3244，A4922)發(fā)芽過夜(18-24h)，并切除分生組織外植體。去除初生(primary)葉來暴露分生組織。制備的外植體在OR培養(yǎng)基(參見，美國專利5,914,451來獲得對(duì)OR培養(yǎng)液的描述)4℃下在黑暗中保存2d，在15℃下黑暗中保存1d。在即將轟擊之前，立即將制備的外植體放置在靶向培養(yǎng)液中(參見美國專利5,914,451來獲得對(duì)靶向培養(yǎng)液的描述)，分生組織位于垂直于粒子呈遞的方向。含有DNA的pMON55526，pMON58107，或pMON55542用CaCl2和亞精胺被沉淀在細(xì)微的金顆粒上，隨后重懸在乙醇中。將懸浮液覆蓋到聚酯薄片上，然后將該薄片放置在放電裝置上。通過釋放大約60％電容將顆粒加速到植物組織中。一般地，轟擊目標(biāo)一次。在轟擊后，將外植體放到選擇培養(yǎng)液中(WPM+75μM草甘膦，參見美國專利5,914,451中的描述)5-7周，選擇和生長轉(zhuǎn)基因的幼苗。約在轟擊后5-7周收獲表型陽性的幼苗，放置到選擇性生根培養(yǎng)液中(BRM+25mM草甘膦，參見美國專利5,914,451中的描述)2-3周。生根的幼苗被移植到溫室中，栽培在土壤中。在選擇中仍然健康生長的但是不生根的幼苗被轉(zhuǎn)移到非選擇性生根培養(yǎng)液中(BRM，如上述)再培養(yǎng)2周。在被轉(zhuǎn)移到溫室并栽培在土壤中之前，來自任何在脫離選擇時(shí)生根的幼苗的根被檢測(cè)植物可選擇標(biāo)記的表達(dá)。植物在標(biāo)準(zhǔn)的溫室條件下被維持直到收獲R1種子。對(duì)于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法，商業(yè)上可獲得的大豆種子(AsgrowA3244，A4922)發(fā)芽過夜(大約10-12h)，切除分生組織外植體。初生葉被去除或不被去除，暴露分生組織，外植體被放置在創(chuàng)傷容器(woundingvessel)中。含有pMON58113(附圖8)，pMON63605，或pMON63604的農(nóng)桿菌菌株ABI生長到對(duì)數(shù)期。通過離心來收集細(xì)胞，并重懸在含有誘導(dǎo)物的培養(yǎng)液中。在不晚于種子萌發(fā)開始的14h內(nèi)將大豆外植體和被誘導(dǎo)的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物被混合，并用超聲波創(chuàng)傷。在創(chuàng)傷后，外植物體在農(nóng)桿菌中培育約1h。在該培育步驟之后，通過吸取去除農(nóng)桿菌，將外植體放置共培養(yǎng)2-4d。將外植體轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基中(WPM+0.075mM草甘膦+控制農(nóng)桿菌過度生長的抗生素)5-7周來進(jìn)行選擇，并使轉(zhuǎn)基因幼苗生長。在轟擊后約5-7周收獲表型陽性的幼苗，并放置到選擇性生根培養(yǎng)液中(BRM+25mM草甘膦)2-3周。生根的幼苗被移植到溫室中，栽培在土壤中。在選擇中仍然健康生長的但是不生根的幼苗被轉(zhuǎn)移到非選擇性生根培養(yǎng)液中(無草甘膦的BRM)再培養(yǎng)2周。在被轉(zhuǎn)移到溫室并栽培在土壤中之前，來自任何在脫離選擇時(shí)生根的幼苗的根被檢測(cè)植物可選擇的標(biāo)記草甘膦抗性的表達(dá)。植物在標(biāo)準(zhǔn)的溫室條件下被維持直到收獲R1種子。分析來自被選擇的植物的成熟種子的GUS活性。為了分析GUS活性，分別碾磨8粒來自各個(gè)轉(zhuǎn)基因事件(品系)的種子。約20mg被碾磨的種子組織用200μl提取緩沖液提取，該緩沖液中含有0.1M磷酸鉀(pH7.8)，10mMDTT，1mMEDTA，5％甘油和蛋白酶抑制劑(1片/50ml，產(chǎn)品目錄號(hào)1697498，RocheMolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)。提取物的蛋白質(zhì)含量采用Bio-RadProteinAssay(產(chǎn)品目錄號(hào)61234A，Bio-RadLaboratories，Hercules，California)確定，采用稍加改進(jìn)的GUS標(biāo)準(zhǔn)分析方法測(cè)定GUS活性(Maliga等，1995，″MethodsinPlantMolecularBiology，ALaboratoryCourseManual″，ColdSpringHarborLaboratoryPress，29)。GUS活性被相對(duì)于蛋白質(zhì)濃度規(guī)格化。每種樣本被分析兩次，并且平均值被用數(shù)據(jù)分析。如果8粒種子都沒有可檢測(cè)的GUS活性，則排除該事件(品系)。如果特定事件的至少一粒種子具有可檢測(cè)的GUS，該情形被認(rèn)為是陽性轉(zhuǎn)基因。這種情況下具有最高GUS活性的種子樣本被選擇作為這種情形的代表，因?yàn)槠涓锌赡茉诩兒戏N子中反映GUS活性。對(duì)于各個(gè)構(gòu)建體，通常確定10-20個(gè)陽性事件。陽性情況下的平均被比較以證明啟動(dòng)子的相對(duì)強(qiáng)度，如附圖12所示。數(shù)據(jù)表明，在轉(zhuǎn)基因大豆種子中USP88比T-Arc5啟動(dòng)子強(qiáng)約3倍，并且比Arc5啟動(dòng)子強(qiáng)約6倍(附圖12)。該結(jié)果還表明，在轉(zhuǎn)基因大豆種子中，eUSP88啟動(dòng)子比T-Arc5啟動(dòng)子強(qiáng)約10倍(附圖12)。實(shí)施例5-制備種子中含有高水平游離色氨酸的轉(zhuǎn)基因大豆植物構(gòu)建農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體pMON58130(附圖13)來證明，USP99啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因大豆中起始對(duì)色氨酸不敏感的C28玉米鄰氨基苯甲酸合成酶α亞基的效率(美國專利6,118,047)。通過如下稍加改進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)分子克隆操作構(gòu)建載體pMON58130(附圖13)(Sambrook等，MolecularCloningAlaboratorymanual，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress；Maliga等，MethodsinPlantMolecularBiologyAlaboratorycoursemanual，1995，ColdSpringHarborLaboratoryPress)。由FMV啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列、CP4編碼基因和E93′UTR組成的表達(dá)盒被包括在轉(zhuǎn)化載體中，作為可選擇的標(biāo)記。構(gòu)建其他農(nóng)桿菌載體pMON63654來證明，USP99啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因大豆中引導(dǎo)對(duì)色氨酸反饋不敏感的根癌農(nóng)桿菌鄰氨基苯甲酸合成酶突變體(F298W)的效率(美國專利申請(qǐng)60/288,904)。通過如下稍加改進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)分子克隆操作構(gòu)建載體pMON63654(附圖21)(Sambrook等，MolecularCloningAlaboratorymanual，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress；Maliga等，MethodsinPlantMolecularBiologyAlaboratorycoursemanual，1995，ColdSpringHarborLaboratoryPress)。由FMV啟動(dòng)子、HSP705′UTR、CTP2、CP4編碼序列和E93′UTR組成的表達(dá)盒被包括在轉(zhuǎn)化載體中作為可選擇的標(biāo)記。在pMON63654中(附圖21)，USP99啟動(dòng)子被連接到由葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列CTP1和農(nóng)桿菌鄰氨基苯甲酸合成酶(F298W)突變體組成的基因的上游。NOS3′UTR被用于發(fā)出轉(zhuǎn)錄終止和腺苷酸化的信號(hào)。對(duì)于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法，將商業(yè)上可獲得的大豆種子(AsgrowA3244，A4922)過夜發(fā)芽(大約10-12h)發(fā)芽，并切除分生組織外植體。初生葉被去除或不被去除，暴露分生組織，外植體被放置在創(chuàng)傷容器(woundingvessel)中。含有pMON58130，或pMON63654的農(nóng)桿菌菌株ABI生長到對(duì)數(shù)期。通過離心來收集細(xì)胞，并重懸在含有誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中。在不晚于種子萌發(fā)開始的14h內(nèi)將大豆外植體和被誘導(dǎo)的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物混合，并采用超聲波創(chuàng)傷。在創(chuàng)傷后，外植物體在農(nóng)桿菌中培育約1h。在該培育步驟之后，通過吸取去除農(nóng)桿菌，將外植體放置共培養(yǎng)2-4d。此時(shí)，將外植體轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)液中(WPM+0.075mM草甘膦+控制農(nóng)桿菌過度生長的抗生素)5-7周來進(jìn)行選擇，并使轉(zhuǎn)基因幼苗生長。在轟擊后約5-7周收獲表型陽性的幼苗，并放置到選擇性生根培養(yǎng)液中(BRM+25mM草甘膦)2-3周。生根的幼苗被移植到溫室中，栽培在土壤中。在選擇中仍然健康生長的但是不生根的幼苗被轉(zhuǎn)移到非選擇性生根培養(yǎng)液中(無草甘膦的BRM)再培養(yǎng)2周。在被轉(zhuǎn)移到溫室并栽培在土壤中之前，來自任何在脫離選擇時(shí)生根的幼苗的根被檢測(cè)植物可選擇的標(biāo)記草甘膦抗性的表達(dá)。植物在標(biāo)準(zhǔn)的溫室條件下被維持直到收獲R1種子。為了分析游離的色氨酸，10粒來自各個(gè)轉(zhuǎn)基因事件(品系)的成熟RI種子分別被碾碎。約50mg來自各個(gè)種子的被碾碎物質(zhì)被放置到各個(gè)離心管中并稱重。將1ml5％三氯乙酸加入到各個(gè)樣本中。搖晃樣本，在室溫下混合15min。然后以14,000rpm離心15min。取出一些上清液，裝入HPLC管中并密封。采用ZorbaxEclipse-AAA柱和Agilent1100HPLC分析游離的氨基酸(AgilentTechnicalPublication，″AminoAcidAnalysisUsingZorbaxEclipse-AAAColumnsandtheAgilent1100HPLC.″2000年3月17日)。因?yàn)楦鞣N情況的R1種子最可能由一群相互分離的種子構(gòu)成，在各種事件的10粒種子中，具有最高色氨酸讀數(shù)的種子被選擇作為該組中最有可能是純合的代表。數(shù)據(jù)總結(jié)在下面的表3和4中。還分析了10粒隨機(jī)選擇的非轉(zhuǎn)基因的AsgrowA3244種子，具有最高色氨酸含量的被包括在表中作為陰性對(duì)照。從pMON58130-1到pMON58130-23表示采用載體pMON58130產(chǎn)生的不同情形。與非轉(zhuǎn)基因A3244比較，在大部分轉(zhuǎn)基因事件中具有高水平的Trp沉積。在采用pMON58130和pMON63654的多個(gè)轉(zhuǎn)基因事件中檢測(cè)到Trp沉積升高。表3pMON58130事件中的色氨酸濃度表4pMON63654事件的色氨酸濃度實(shí)施例6-生成來自蠶豆的USP啟動(dòng)子的克隆通過PCR擴(kuò)增(ExpandHighFidelityPCRSystem，產(chǎn)品目錄號(hào)1732641，RocheMolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)和UniversalGenomeWaLker試劑盒(產(chǎn)品目錄號(hào)K1807-1BDBiosciences，PaloAlto，加利福尼亞)從蠶豆基因組DNA中獲得延伸序列USP啟動(dòng)子，采用按照公開的序列(GenBankAccessionX56240)設(shè)計(jì)的3′引物。5′引物按照GenomeWalker方法設(shè)計(jì)。用于第一輪擴(kuò)增USP啟動(dòng)子的引物為GATAAAACAGTGAGATGTGCAAACTCC(uspGW-P-down)(SEQIDNO12)和GTAATACGACTCACTATAGGGC(AP1，連接引物1，由試劑盒提供)(SEQIDNO13)。采用嵌套引物CCATGGAGATCTGACTGGCTATGAAGAAATTATAATCG(uspGW-N-downBgl2Ncol)(SEQIDNO14)和ACTATAGGGCACGCGTGGT(AP2，嵌套連接引物2)(SEQIDNO15)從這些初步的PCR產(chǎn)物中擴(kuò)增啟動(dòng)子。1微升PCR片段洗脫物被用作模板用于第三輪PCR，采用uspGW-N-downBgl2Ncol和CTGCAGGTCGACGGCCCGGGCTGGT(AP6-Pstl/Srfl)(SEQIDNO16)來將便利的5′限制性位點(diǎn)加入到推定的啟動(dòng)子片段中。然后將分離的擴(kuò)增產(chǎn)物亞克隆到載體pMON8677中，生成克隆pMON63821(USP99.5)(附圖18)，pMON63819(USP95)(附圖19)，和pMON63820(USP68)(附圖20)。實(shí)施例7-采用大豆子葉瞬時(shí)轉(zhuǎn)化來評(píng)價(jià)USP啟動(dòng)子在開花后25-28d收獲大豆植物的種子(AsgrowA3244)，并且在GAMBORG培養(yǎng)液(G5893，SigmaCompany，St.Louis，MO)中在25℃下黑暗中滲透處理過夜，該培養(yǎng)液中加入50mM谷氨酰胺，111mM麥芽糖，125mM棉子糖，125mM甘露醇和3g/l純化的瓊脂，pH5.6。得到的125片子葉被對(duì)半剪切，并且采用粒子槍技術(shù)(Maliga等，1995，″MethodsinPlantMolecularBiology，ALaboratoryCourseManual，″ColdSpringHarborLaboratoryPress，47)用純化的pMON63819(USP95)，pMON63820(USP68)，pMON63621(USP99.5)，和pMON58101(USP99)的超螺旋DNA轟擊。包括以與各種啟動(dòng)子構(gòu)建體11摩爾比的分離的e35S引導(dǎo)的熒光素每構(gòu)建體作為表達(dá)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。被轟擊的組織在25℃下培養(yǎng)48h。采用1ml提取緩沖液從6片被轟擊的大豆子葉中提取蛋白質(zhì)，該緩沖液含有0.1M磷酸鉀(pH7.8)，10mMDTT，1mMEDTA，5％甘油和蛋白酶抑制劑(1片/50ml，RocheMolecularBiochemicals，產(chǎn)品目錄號(hào)1697498，Indianapolis，IN)。100μl蛋白質(zhì)提取物的等分試樣被用于采用Promega(產(chǎn)品目錄號(hào)E2510，PromegaCorporationMadison，WI)通過“Steady-Glo”操作分析熒光素酶。50μl蛋白質(zhì)提取物的等分試樣被用于稍加改進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)GUS分析操作(Maliga等，1995，″MethodsinPlantMolecularBiology，ALaboratoryCourseManual″，ColdSpringHarborLaboratoryPress，29)。各種樣本被分析兩次，平均值被用于數(shù)據(jù)分析。GUS活性使用熒光素酶活性規(guī)格化，相對(duì)啟動(dòng)子強(qiáng)度通過比較pMON58101(USP99)的表達(dá)與pMON63819(USP95)，pMON63820(USP68)，pMON63621(USP99.5)表達(dá)來表示(表5)。pMON63621(USP99.5)具有顯著高于USP99的表達(dá)，pMON63820(USP68)具有顯著低于USP99的表達(dá)，而pMON63819(USP95)具有與USP99相似的表達(dá)。在該瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中，所有這三種構(gòu)建體都被證實(shí)含有活性啟動(dòng)子。表5轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)中的啟動(dòng)子活性參考文獻(xiàn)Ainleyetal.，PlantMol.Biol.，14949，1990.Ausubeletal.，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWileyandSons，Inc.，1995.BartleyandScolnik，PlantPhysiol.，1041469-1470，1994.Backetal.，PlantMol.Biol.，179，1991.Baueretal.，Gene，3773，1985.BeckerandGuarente，InAbelsonandSimon(eds.)，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology，MethodsEnzymol.，194182-187，AcademicPress，Inc.，NewYork.BennettandLaSure(eds.)，MoreGeneManipulationsinFungi，AcademicPress，California，1991.Bergeronetal.，TIBS，19124-128，1994.Bustosetal.，EMBOJ.，101469-1479，1991.Castresanaetal.，EMBOJ.，71929-1936，1988.Capecchi，Cell，22(2)479-488，1980.Cerda-Olmedoetal.，J.Mol.Biol.，33705-719，1968.Chauetal.，Science，244174-181.1989.Christensenetal.，PlantMol.Biol.，18675-689，1992.Clapp，Clin.Perinatol.，20(1)155-168，1993.Costaetal.，MethodsMol.Biol.，5731-44，1996.Craik，BioTechniques，312-19，1985.Craig，Science，2601902-1903，1993.Curieletal.，Hum.Gen.Ther.，3(2)147-154，1992.Cyanobase，http//www.kazusa.or.jp/cyanobase.Dellaportaetal.，StadlerSymposium，11263-282，1988.Demolderetal.，J.Biotechnology，32179-189，1994.DengandNickloff，Anal.Biochem.，20081，1992.D′Halluinetal.，Bio/Technology，10309-314，1992.Doyleetal.，J.Biol.Chem.，2619228-9238，1986.EglitisandAnderson，Biotechniques，6(7)608-614，1988.EnderlinandOgrydziak，Yeast，1067-79，1994.Feinbaumetal.，Mol.Gen.Genet.，226449-456，1991.Fraleyetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，SO4803，1983.FritsEcksteinetal.，NucleicAcidsResearch，106487-6497，1982.Frommetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，82(17)5824-5828，1985.Frommetal.，Bio/Technology，8833，1990.Fulleretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，861434-1438，1989.Fynanetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，90(24)11478-11482，1993.GethingandSambrook，Nature，35533-45，1992.Glicketal.，MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology，CRCPress，BocaRaton，F(xiàn)L.，1993.GrahamandVanderEb，Virology，54(2)536-539，1973.Greeneretal.，Mol.Biotechnol.，7189-195，1997.Hartletal.，TIBS，1920-25，1994.H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942,660；5,945,585；5,952,544；5,955,650；5,965,727；5,995,329；5,990,384；5,990,389；5,936,069；5,939,599；6,005,076；6,051,754；6,075,183；6,043,411；6,100,091；6,107,051；6,110,891；6,117,677；6,194,167；6,146,669；6,147,279；6,156,227；6,172,106；and6,232,122.歐洲專利0154204；0238023；和0255378.專利申請(qǐng)WO90/01869，WO91/13993，WO92/14822，WO93/08682，WO94/20628，WO95/19442，WO97/26366，WO97/28247，WO97/22703，WO98/55601，WO98/26064，WO96/17064，WO97/35023，WO00/19839，WO99/06581，WO99/02656，WO99/40209，WO99/11800，WO99/49058，WO00/32757，WO00/10380.序列表<110>王琦(Wang，Qi)Fagaly，TanyaBassuner，RonaldLiang，JihongOulmassov，TimDabrowski，John<120>用于在植物中表達(dá)基因的種子特異性USP啟動(dòng)子<130>REN-00-122<160>16<170>PatentInversion3.1<210>1<211>634<212>DNA<213>蠶豆(Viciafaba)<400>1ctgcagcaaatttacacattgtcactaaacgtctaaatcattgtaatttgtttttgtttt60aatatgtgtgttatgaacttgattttcaataatttttaaatttggtaccagtattataac120atcttttgtgctaacggttgccaacacttagcaatttgtaagttgattaattgattctaa180acttttattgtcttcttaattcatgctgataaatatatgctgataaaaattaaagtgaat240atggtaccacaagtttttggagactgttgccatatacaccaaacattcaataattcttga300ggataataatggtaccacacaagctttgaggtgcatgaacgtcacgtggacaaaaggttt360agtaatttttcaagacaacaatgttaccacacacaagttttgaggtgcatgcatggatgc420cctgtggaaagtttaaaaatattttggaaatgatttgcatggaagccatgtgtaaaacca480tgacatccacttggaggaagcaataatgaagaaaactacaaatttacatgcaactagtta540tgcatgtagtctatataatgaggattttgcaatactttcattcataaacactcactaagt600tttacacgattatcatttcttcatagccagtcaa634<210>2<211>1185<212>DNA<213>蠶豆(Viciafaba)<400>2ctgcagcaaatttacacattgtcactaaacgtctaaatcattgtaatttgtttttgtttt60aatatgtgtgttatgaacttgattttcaataatttttaaatttggtaccagtattataac120atcttttgtgctaacggttgccaacacttagcaatttgtaagttgattaattgattctaa180acttttattgtcttcttaattcatgctgataaatatatgctgataaaaattaaagtgaat240atggtaccacaagtttttggagactgttgccatatacaccaaacattcaataattcttga300ggataataatggtaccacacaagctttgaggtgcatgaacgtcacgtggacaaaaggttt360agtaatttttcaagacaacaatgttaccacacacaagttttgaggtgcatgcatggatgc420cctgtggaaagtttaaaaatattttggaaatgatttgcatggaagccatgtgtaaaacca480tgacatccacttggaggaagcaataatgaagaaaactacaaatttacatgcaactagtta540tgcatgtagtcctgcagcaaatttacacattgtcactaaacgtctaaatcattgtaattt600gtttttgttttaatatgtgtgttatgaacttgattttcaataatttttaaatttggtacc660agtattataacatcttttgtgctaacggttgccaacacttagcaatttgtaagttgatta720attgattctaaacttttattgtcttcttaattcatgctgataaatatatgctgataaaaa780ttaaagtgaatatggtaccacaagtttttggagactgttgccatatacaccaaacattca840ataattcttgaggataataatggtaccacacaagctttgaggtgcatgaacgtcacgtgg900acaaaaggtttagtaatttttcaagacaacaatgttaccacacacaagttttgaggtgca960tgcatggatgccctgtggaaagtttaaaaatattttggaaatgatttgcatggaagccat1020gtgtaaaaccatgacatccacttggaggaagcaataatgaagaaaactacaaatttacat1080gcaactagttatgcatgtagtctatataatgaggattttgcaatactttcattcataaac1140actcactaagttttacacgattatcatttcttcatagccagtcaa1185<210>3<211>688<212>DNA<213>蠶豆(Viciafaba)<400>3ctgcagcaaatttacacattgccactaaacgtctaaacccttgtaatttgtttttatttc60gctatgtgtgttatgtatttaatttgcgataaatttttatatttggtactaaatttataa120caccttttatgctaacgtttgccaacacttagcaatttgcaagttgattaatcgattcta180aattatttttgtcttctaaatacatatactaatcaactggaaatgtaaatatttgctaat240atttctactataggagaattaaagtgagtgaatatggtaccacaaggtttggagatttaa300ttgttgcaatgcttgcatggatggcatatacaccaaacattcaataattcttgaggataa360taatggtaccacacaagctttgaggtgcatgaacgtcacgtggacaaaaggtttagtaat420ttttcaagacaacaatgttaccacacacaagttttgaggtgcatgcatggatgccctgtg480gaaagtttaaaaatattttggaaatgatttgcatggaagccatgtgtaaaaccatgacat540ccacttggaggaagcaataatgaagaaaactacaaatttacatgcaactagttatgcatg600tagtctatataatgaggattttgcaatactttcattcataaacactcactaagttttaca660cgattatcatttcttcatagccagtcaa688<210>4<211>744<212>DNA<213>蠶豆(Viciafaba)<400>4ctgcagcaaatttacacattgccactaaacgtctaaacccttgtaatttgtttttatttc60actatgtgtgttacgtatttaatttgcgataaatttttatatttggtactaaatttataa120caccttttatgctaacgtttgccaacacttagcaatttgcaagttgaaatttataacacc180ttttatgctaacgtttgccaacacttagcaatttgcaagttgattaatcgattctaaatt240atttttgtcttctaaatacatatactaatcaactggaaatgtaaatatttgctaatattt300ctactataggagaattaaagtgagtgaatatggtaccacaaggtttggagatttaattgt360tgcaatgcttgcatggatggcatatacaccaaacattcaataattcttgaggataataat420ggtaccacacaagctttgaggtgcatgaacgtcacgtggacaaaaggtttagtaattttt480caagacaacaatgttaccacacacaagttttgaggtgcatgcatggatgccctgtggaaa540gtttaaaaatattttggaaatgatttgcatggaagccatgtgtaaaaccatgacatccac600ttggaggaagcaataatgaagaaaactacaaatttacatgcaactagttatgcatgtagt660ctatataatgaggattttgcaatactttcattcataaacactcactaagttttacacgat720tatcatttcttcatagccagtcaa744<210>5<211>688<212>DNA<213>蠶豆(Viciafaba)<400>5ctgcagcaaatttacacattgccactaaacgtctaaacccttgtaatttgtttttgtttt60actatgtgtgttatgtatttgatttgcgataaatttttatatttggtactaaatttataa120caccttttatgctaacgtttgccaacacttagcaatttgcaagttgattaattgattcta180aattatttttgtcttctaaatacatatactaatcaactggaaatgtaaatatttgctaat240atttctactataggagaattaaagtgagtgaatatggtaccacaaggtttggagatttaa300ttgttgcaatgctgcatggatggcatatacaccaaacattcaataattcttgaggataat360aatggtaccacacaagatttgaggtgcatgaacgtcacgtggacaaaaggtttagtaatt420tttcaagacaacaatgttaccacacacaagttttgaggtgcatgcatggatgcccctgtg480gaaagtttaaaaatattttggaaatgatttgcatggaagccatgtgtaaaaccatgacat540ccacttggaggatgcaataatgaagaaaactacaaatttacatgcaactagttatgcatg600tagtctatataatgaggattttgcaatactttcattcatacacactcactaagttttaca660cgattataatttcttcatagccagtcaa688<210>6<211>24<212>DNA<213>合成的<400>6aaactgcagcaaatttacacattg24<210>7<211>22<212>DNA<213>合成的<400>7aaaccatggttgactggctatg22<210>8<211>24<212>DNA<213>合成的<400>8aaactgcaggactacatgcataac24<210>9<211>1749<212>DNA<213>蠶豆(Viciafaba)<400>9acttcgaccaactagagttcgatccaaaatcccacatacgcaataccaaacattaactga60agtttttcaaggaggctcaaaactatcgagaatgtctcatcatcattgacatcatcgtct120cgaagctccgtgaaagaacaaacacattatgccaaacattatctttatgaatatattacc180acagaccatcactccgaccttgcaatcaagaatggtgtcattgtcgttaccctaatggta240gggtggatcaaacaagaggtctatgttagttttatcggacccctaaaaagtacaatgaga300taaccctatgtttttagtgttgttttatgtatttagagggtttgctcatgcatgcgtagt360ggttagaagtaaggttgtctagatcaaaattttacataagatccggagagaataacaaga420ttgtaaaatataaaatcgtagttaagattagaagattttactcaattatttttgtaagat480tgacagcgaataacatcgtaaaacataagataataaaaaaaaagtaagatcctactaaaa540tgaaaaaaaaatagtatatatttaaagtatttttacatgatataatgatgtatgtaagta600ggcaagtgtatttgtgagaaaaaaatattctttttcatattctttaaacatttacgattg660aggttttattaaatatttgttaatgtttagacattagagacatatatagtcaattactaa720gattatcataagtctacttaaaacaaatcttatatgttaaaagtttattctctaaatcct780aaatctaaaatttcatttcaaaaggtgaaaattcatctccgctgaaccatattgtgcttc840cacatcttgtcatcattctcacattttaatggtggtggtcgtaaaacggtgaatcatagt900caaagctggcaaagatcgcacaaaatcaataattttaaaagaatttttattcaatttagc960tacaattcgcgattctacttgaaatctgacaaccatacatatttatataccgataaaata1020taggctatattatacatttgcctttaaaaaaaactgaaaaactcctgcagcaaatttaca1080cattgccactaaacgtctaaacccttgtaatttgtttttgttttactatgtgtgttatgt1140atttgatttgcgataaatttttatatttggtactaaatttataacaccttttatgctaac1200gtttgccaacacttagcaatttgcaagttgattaattgattctaaattatttttgtcttc1260taaatacatatactaatcaactggaaatgtaaatatttgctaatatttctactataggag1320aattaaagtgagtgaatatggtaccacaaggtttggagatttaattgttgcaatgctgca1380tggatggcatatacaccaaacattcaataattcttgaggataataatggtaccacacaag1440atttgaggtgcatgaacgtcacgtggacaaaaggtttagtaatttttcaagacagcaatg1500ttaccacacacaagttttgaggtgcatgcatggatgccctgtggaaagtttaaaaatatt1560ttggaaatgatttgcatggaagccatgtgtaaaaccatgacatccacttggaggatgcaa1620taatgaagaaaactacaaatttacatgcaactagttatgcatgtagtctatataatgagg1680attttgcaatactttcattcatacacactcactaagttttacacgattataatttcttca1740tagccagtc1749<210>10<211>1465<212>DNA<213>蠶豆(Viciafaba)<400>10cctatgttagttttatcggacacctaaaaagtacaatgagataaccttatgtttttagtg60ttgttttatgtgtttagagtgtttgctcatgcatagtggttagaagtaaggttgtcaaga120tcgaaactttacataagatctggagagaataataagattgtaaaatataaaattttagtt180aagataagaagattttactcaattatttttgtaagattgacagggaataacataatcgta240aatcataagatagtaacaaaaaaagtaagatcctactaaaataaaaaaattaatagtata300tatttaaagtatttttacatgatataatgatgtatgtaagtatgcaagtgtatttgtgag360aaaaaaaatactctttttcatattctttaaacatttatgattgagattttattaaatatt420tgttaatgtttagacattagagacatatatggtcaattattaggattatcataagtttag480ttaaaacaaatcttatatgttaaaagtttattctctaaaccttaaatctaaaactttatt540tcacaaagcgaaaattcatccccgctgaatcgtaaatattgtgcttccacatcttgtcat600cattctcacattttaatagtggtggtcgtaaaacggtgaatcatggccaaagctgacaaa660gatcgcacaaaatcaataatttatagattttttattcaatttagctacaatacacgagtc720tacttgaaatcgagattttgacaaccatatatattcatatacagataaaatgtaggctat780gttatacatttgcctttaaaaaaactgaaaaactcctgcagcaaatttacacattgccac840taaacgtctaaacccttgtaatttgtttttgttttactatgtgtgttatgaacttgattt900tcaataatttttaaatttggtaccagtattataacatcttttgtgctaacggttgccaac960acagcaatttgtaagttgattaattgattctatacttttattgtctccttaattcatgct1020gataaatatatgctgataaaaattaaagtgaatatggtaccacaaggtttggagatttaa1080ttgttgcaatgctgcatggatggcatatacaccaaacattcaataattcttgaggataat1140aatggtaccacacaagctttgaggtgcatgaacatcgcgtggacaaaaggtttagtaatt1200tttcaagacaacaatgttaccacacacaagttttgaggtgcatgcatggatgccctgtgg1260aaagtttaaaaatattttggaaatgatttgcatggaagccatgtgtaaaaccatgacatc1320cacttggaggaagcaataatgaagaaaactacaaatttacatgcaactagttatgcatgt1380agtctatataatgaggattttgcaatactttcattcataaacactcactaagttttacac1440gattataatttcttcatagccagtc1465<210>11<211>1302<212>DNA<213>蠶豆(Viciafaba)<400>11cctatgttagttttatcggacccctaaaaagtacaatgagataaccttatgtttttagtg60ttgttatatgtgtttagagggtttgctcatgcatagtggatagaagtaaggttgccaaga120tcaaaattttacataagatcaggagagaataacaagattgtaaaatataaaattctagtt180aagataagaagattttactcaattatttttgtaagattgacagggaataacataatagta240aattataatatagtaacaaaaaaagtaagatcctactaaaataaaaaaaataatagtata300tatttaaagtattttaacatgatataatgatgtatgtaagtatgcaagtgtatttgtgag360aaaaaaaaaaaactctttttcatattctttaaacatttatgattgaggttttattaaata420tttgttaatgtttagacattagagacatatatggtcaattattaggattatcataagttt480agttaaaataaatcttatatgttaaaagtttattctctaaaccttatatctaaaatttca540tttcaaaaggccaaaatttatctccgctgaaccgtaattattgtgcttccgcatcttgtc600atcattctcatattttaatagtggtggtcgtaaaacggtgaatcatggtcaaagctgaca660aagatcgcacaaaatccataattttatagattttttattcaatttagctacaatacgcga720ttctacttgaaatcgagattttgacaactatacatattcatatacagataaaatataggc780tatgttatacatttgcctttaaaaaaaaaaactgaaaaactcctgcagcaaatttacaca840ttgccactaaacgtctaaacccttgtaatttgtttttgttttaatatgtgtgttatgaac900ttgatttgcaataatttttaaatttggtactagtattataacaccttttgtgctaacggt960tgccaacacttagtaatttgtaagttgattaattgattctaaactattattgtcttctta1020aatcatatcctaaataatcgaaaatgtaaatatatgctgataaaaattaaagtgaatatg1080gtaccacaagtttttggaaagtttaaaaatattttggaaatgatttgcatggaagccatg1140tgtaaaaccatgacatccacttggaggaagcaataatgaagaaaactacaaatttacatg1200caactagttatgcatgtagtctatataatgaggattttgcaatactttcattcatacaca1260ctcactaagttttacacgattataatttcttcatagccagtc1302<210>12<211>27<212>DNA<213>合成的<400>12gataaaacagtgagatgtgcaaactcc27<210>13<211>22<212>DNA<213>合成的<400>13gtaatacgactcactatagggc22<210>14<211>38<212>DNA<213>合成的<400>14ccatggagatctgactggctatgaagaaattataatcg38<210>15<211>19<212>DNA<213>合成的<400>15actatagggcacgcgtggt19<210>16<211>25<212>DNA<213>合成的<400>16ctgcaggtcgacggcccgggctggt2權(quán)利要求1.一種核酸分子，包含被可操作地連接到第二核酸的啟動(dòng)子，其中該啟動(dòng)子選自SEQIDNO1，2，3，4，9，10，或11，以及其互補(bǔ)體。2.含有權(quán)利要求1的核酸分子的轉(zhuǎn)化植物。3.權(quán)利要求2的轉(zhuǎn)化植物，其中所述第二核酸是結(jié)構(gòu)性核酸。4.權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)化植物，其中所述結(jié)構(gòu)性核酸編碼選自種子儲(chǔ)存蛋白、脂肪酸途徑酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶、類固醇途徑酶或淀粉分支酶的蛋白質(zhì)。5.權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)化植物，其中所述結(jié)構(gòu)性核酸編碼選自鄰氨基苯甲酸合成酶、色氨酸脫羧酶、蘇氨酸脫氨酶或天冬氨酸激酶的蛋白質(zhì)。6.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)化植物，其中所述結(jié)構(gòu)性核酸編碼淀粉分支酶。7.權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)化植物，其中所述結(jié)構(gòu)性核酸被引導(dǎo)來表達(dá)反義RNA分子。8.權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)化植物，其中所述被轉(zhuǎn)化的植物選自canola、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、芝麻、棉籽、亞麻子、玉米、大豆、Arabidopsisphaseolus、花生、紫花苜蓿、小麥、稻、燕麥、高梁、油菜籽、黑麥、tritordeum、粟類、酥油草、多年生黑麥草、甘蔗、酸果、番木瓜、香蕉、紅花、油椰子、亞麻、香瓜、蘋果、黃瓜、石斛蘭、唐菖蒲(gladiolus)、菊花、百合、棉花、桉樹、向日葵、蕓苔、歐洲油菜、草坪草、甜菜、咖啡或薯蕷屬。9.權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)化植物，其中所述轉(zhuǎn)化的植物是大豆。10.權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)化植物，其中所述結(jié)構(gòu)性核酸以器官特異性方式被表達(dá)。11.權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)化植物，其中所述結(jié)構(gòu)性核酸在種子中表達(dá)。12.一種制備轉(zhuǎn)化植物的方法，包括(a)提供權(quán)利要求1的核酸分子；和(b)用所述核酸分子轉(zhuǎn)化植物。13.一種獲得促進(jìn)結(jié)構(gòu)性核酸產(chǎn)物生成的種子的方法，包括(a)種植含有權(quán)利要求1的核酸分子的轉(zhuǎn)化植物，其中所述轉(zhuǎn)化植物生成所述種子，并且所述第二核酸在所述種子中被轉(zhuǎn)錄；和(b)從所述被轉(zhuǎn)化植物中分離所述種子。14.從權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)化植物制備的食物(meal)。15.從權(quán)利要求11的被轉(zhuǎn)化植物制備的原種。16.從權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)化植物分離的油。17.含有權(quán)利要求1的核酸分子的細(xì)胞。18.按照權(quán)利要求17的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自細(xì)菌細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞。19.按照權(quán)利要求18的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是根癌農(nóng)桿菌。20.由含有權(quán)利要求1的核酸分子的轉(zhuǎn)化植物生成的種子。21.包含來自含有權(quán)利要求1的核酸分子的轉(zhuǎn)化植物之植物原料的食物。22.含有權(quán)利要求1的核酸分子的轉(zhuǎn)化大豆植株。23.權(quán)利要求22的被轉(zhuǎn)化植株，其中所述第二核酸編碼選自種子儲(chǔ)存蛋白、脂肪酸途徑酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶、類固醇途徑酶或淀粉分支酶的蛋白質(zhì)。24.權(quán)利要求22的轉(zhuǎn)化大豆植株，其中所述第二核酸編碼選自鄰氨基苯甲酸合成酶、色氨酸脫羧酶、蘇氨酸脫氨酶或天冬氨酸激酶的蛋白質(zhì)。25.權(quán)利要求22的轉(zhuǎn)化大豆植株，其中所述第二核酸編碼淀粉分支酶。26.權(quán)利要求22的被轉(zhuǎn)化大豆植株，其中所述第二核酸編碼被引導(dǎo)來表達(dá)反義RNA分子。全文摘要本發(fā)明涉及植物遺傳工程領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明涉及種子特異性基因表達(dá)。本發(fā)明提供能夠在種子中轉(zhuǎn)錄異源核酸序列的啟動(dòng)子，和改進(jìn)、制備和使用該啟動(dòng)子的方法。文檔編號(hào)C12N15/82GK1685040SQ03815772公開日2005年10月19日申請(qǐng)日期2003年5月5日優(yōu)先權(quán)日2002年5月3日發(fā)明者王琦,坦亞·法加利,羅納德·巴薩納,梁繼紅,蒂姆·N·奧爾馬索夫,約翰·達(dá)布勞斯基申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)公司