專利名稱：生產(chǎn)核黃素的微生物和利用其生產(chǎn)核黃素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)核黃素的微生物和利用其生產(chǎn)核黃素的方法。更具體地，本發(fā)明涉及與親株相比具有增強(qiáng)的核黃素生產(chǎn)力的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的突變株，和利用其生產(chǎn)核黃素的方法。
背景技術(shù)：
核黃素，也已知為維生素B2，是一種水溶性維生素，其通過各種微生物和植物的生物合成來制備。然而，在脊椎動物包括人中卻不能生物合成核黃素。核黃素是黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和黃素單核苷酸(FMN)、在所有細(xì)胞體的氧化-還原反應(yīng)中涉及的輔酶的前體，因此是動物包括人必需的養(yǎng)分。核黃素缺乏可導(dǎo)致嘴和咽粘膜發(fā)炎，皮膚炎癥和其它皮膚損傷，結(jié)膜炎，弱視，生長抑制和重量減輕。因此，核黃素用作預(yù)防或治療與前述維生素缺乏有關(guān)的疾病的維生素產(chǎn)品，或作為飼養(yǎng)家畜的飼料添加劑。特別是，濃縮的核黃素本身已被用作飼料。目前核黃素的世界產(chǎn)量是每年3,000噸，其中75％用于飼料添加劑，其余的用于食品和藥品。
目前，通過化學(xué)合成或通過發(fā)酵微生物來生產(chǎn)核黃素。在化學(xué)合成中，利用一種前體如D-核糖，用多步法來生產(chǎn)高純度的核黃素。然而，由于起始物質(zhì)的成本高，所以化學(xué)合成的生產(chǎn)成本也是高的。因此，已開發(fā)出了利用微生物的核黃素發(fā)酵方法。適于發(fā)酵方法的微生物可以是任何存在于自然界的產(chǎn)生核黃素的微生物或通過遺傳工程、化學(xué)或物理方法轉(zhuǎn)化的過量生產(chǎn)核黃素的微生物。將這些微生物在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)，以生產(chǎn)核黃素。從培養(yǎng)物中重新獲得生產(chǎn)的核黃素。
廣為人知的適于生產(chǎn)核黃素的微生物是屬于酵母種群的釀酒酵母和假絲酵母，屬于細(xì)菌種群的梭菌，桿菌和棒桿菌，和屬于真菌種群的假囊酵母和Ashbya sp.。
美國專利No.5,231,007公開了一種利用假絲酵母生產(chǎn)核黃素的方法。它報道了過量表達(dá)在核黃素生物合成過程中涉及的酶的基因的遺傳工程修飾的枯草芽孢桿菌和產(chǎn)氨棒桿菌分別產(chǎn)生4.5g/l和17.4g/l的核黃素[Perkins等.，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.，228-18，1999]。歐洲專利No.EP 0 821 063公開了一種利用重組枯草芽孢桿菌生產(chǎn)核黃素的方法。美國專利No.5,837,528公開了一種過量生產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌的重組菌株，其通過利用重組技術(shù)，將rib操縱子引入到親株中而獲得。另外，還有Windholz等[The Merk Index，Merk & Co.，1183頁，1983]報道的阿氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)和棉病阿舒囊霉(Ashbya gossypii)子囊真菌作為生產(chǎn)核黃素的微生物。特別是，報道了在含糖蜜或植物油作為主要碳源的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，這些子囊真菌突變株的培養(yǎng)物每一升發(fā)酵溶液產(chǎn)生15g的核黃素[Bigelis，生物技術(shù)，7b卷，243頁，1989]。WO95/26406中也公開了利用棉病阿舒囊霉來生產(chǎn)核黃素。
然而，仍然需要開發(fā)具有增強(qiáng)的核黃素生產(chǎn)力的微生物來大量生產(chǎn)核黃素。
其間，在利用微生物的發(fā)酵方法中，開發(fā)了具有滲透壓抗性的微生物菌株，以獲得高濃度的培養(yǎng)物產(chǎn)品和高產(chǎn)率。具有滲透壓抗性的微生物菌株能以高產(chǎn)率生產(chǎn)培養(yǎng)物產(chǎn)品是由于它的生長和代謝不被由過量的碳源和培養(yǎng)物產(chǎn)品的積累導(dǎo)致的外部滲透壓的增加所抑制。在前述的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人開發(fā)了高濃度和高產(chǎn)率生產(chǎn)5’-肌苷酸的微生物菌株，該菌株是通過開發(fā)一種對脯氨酸類似物具有抗性，以增強(qiáng)它的脯氨酸生物合成的能力，從而增強(qiáng)微生物的滲透壓抗性特征的微生物菌株而獲得，其公開于韓國專利No.330712。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了抗脯氨酸類似物的生產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌。
本發(fā)明還提供了一種利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)核黃素的方法。
依照本發(fā)明的一個方面，提供了抗脯氨酸類似物、生產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌。優(yōu)選使用枯草芽孢桿菌CJKB0001(保藏號KCCM-10445)。
在尋找具有增強(qiáng)的核黃素生產(chǎn)力的微生物的過程中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在枯草芽孢桿菌上誘導(dǎo)突變并對其引入脯氨酸類似物抗性，導(dǎo)致滲透壓抗性和核黃素生產(chǎn)力的增強(qiáng)。在這些菌株中，本發(fā)明人選擇了過量生產(chǎn)核黃素并且高產(chǎn)率的菌株，并利用所選擇的菌株大規(guī)模生產(chǎn)核黃素。
依照本發(fā)明的另一個方面，提供了一種生產(chǎn)核黃素的方法，其包含培養(yǎng)這種枯草芽孢桿菌和從培養(yǎng)物中回收核黃素。
以下，將詳細(xì)描述本發(fā)明。
本發(fā)明的枯草芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌AS5的突變株。由于它抗脯氨酸類似物，并且它提高了脯氨酸生物合成，導(dǎo)致了增強(qiáng)的滲透壓抗性。因此，它以高產(chǎn)率生產(chǎn)高濃度的核黃素。
當(dāng)菌體外部的滲透壓增加時，大多數(shù)微生物通過積累鉀離子和稱為滲壓劑的有機(jī)溶質(zhì)來增加菌體內(nèi)的滲透壓，以防止?jié)B透性脫水。滲壓劑包括，但不局限于L-脯氨酸，谷氨酸，糖，和N-甲基化的氨基酸衍生物。在它們之中，已知L-脯氨酸是滲透壓調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因素。據(jù)報道，當(dāng)谷氨酸棒桿菌(Brebvibacterium lactofermentum)外部的滲透壓增加時，L-脯氨酸生物合成的關(guān)鍵酶吡咯啉-5-羧酸酯(carboxylate)還原酶的活性增加，從而導(dǎo)致菌體內(nèi)L-脯氨酸的積累[Agr，Bio，chem.，53(9)2475-2479，1989]。另外，已報道了由菌體外部滲透壓引起的大腸桿菌(Escherichiacoli)，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)，粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)等的菌體內(nèi)L-脯氨酸的積累[J.Bacteriol.，163296，1985]。
因此，本發(fā)明人在枯草芽孢桿菌AS5上誘導(dǎo)突變，以提供滲透壓抗性，然后篩選具有脯氨酸類似物抗性的突變株，其可在含高濃度脯氨酸類似物的培養(yǎng)基中生長。在它們中間，選擇出了具有最高核黃素生產(chǎn)力的一個突變株。
脯氨酸類似物包括，但不局限于，3，4-脫氫脯氨酸，L-鈴蘭氨酸，硫代脯氨酸，L-噻唑烷-4-羧酸，(S)-2，2-二甲基-4-oxazolidecarboxylic acid，(S)-5，5-二甲基-4-thiazolidecarboxylic aicd，(4S，2RS)-2-乙基-噻唑烷-4-羧酸，(2S，4S)-4-羥基-2-吡咯啉-羧酸，2-哌啶羧酸，和2，5-吡咯烷二酮。
此處使用的親株是枯草芽孢桿菌AS5(BIONOM-S，莫斯科，俄羅斯)。
常規(guī)的物理或化學(xué)方法可在親株上誘導(dǎo)突變。例如，可將親株曝露于X-射線或紫外光，或化學(xué)試劑如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)，硫酸二乙酯和乙胺中。
本發(fā)明人在包含各種濃度的、作為脯氨酸類似物的硫代脯氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)被誘導(dǎo)突變的菌株。篩選能在存在高濃度硫代脯氨酸的條件下生長的突變株。在它們中間，篩選到具有最高核黃素生產(chǎn)力的一個突變株。將篩選到的突變株命名為枯草芽孢桿菌CJKB0001，并于2002年11月18日保藏于韓國微生物培養(yǎng)中心(保藏號KCCM-10445)。
本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CJKB0001(KCCM-10445)可在包含甚至高達(dá)70mg/l硫代脯氨酸的培養(yǎng)基中生長。另一方面，作為親株的枯草芽孢桿菌AS5在存在多于40mg/l的硫代脯氨酸的條件下就不能生長。
因此，與親株相比，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CJKB0001(KCCM-10445)具有脯氨酸類似物抗性，并且即使當(dāng)高濃度的溶質(zhì)在菌體外積累時，枯草芽孢桿菌CJKB0001也可通過在菌體內(nèi)積累高濃度的脯氨酸來積累高濃度的核黃素，從而有效防止由滲透壓引起的對它的生長和代謝的抑制。
另外，本發(fā)明人注意到，在瓶培養(yǎng)中，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CJKB0001(KCCM-10445)積累8.0g/l核黃素，這比枯草芽孢桿菌AS5積累的核黃素高11％，并且在5升的發(fā)酵罐培養(yǎng)中，它們也積累26.8g/l核黃素，這比親株積累的核黃素高19.6％。
因此，當(dāng)與枯草芽孢桿菌AS5相比較時，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CJKB0001(KCCM-10445)對脯氨酸類似物具有增強(qiáng)的抗性，并且由于具有滲透壓抗性而具有顯著增強(qiáng)的核黃素生產(chǎn)力。
為了生產(chǎn)核黃素，在合適的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CJKB0001(KCCM-10445)。
詳細(xì)地，將枯草芽孢桿菌CJKB0001(KCCM-10445)接種到含合適碳源、氮源和無機(jī)化合物的常規(guī)培養(yǎng)基中，并在有氧條件下，在預(yù)定的溫度和pH下培養(yǎng)。碳源的實例包括葡萄糖，糖蜜，乳糖，蔗糖，麥芽糖，糊精，淀粉，甘露糖醇，山梨醇和甘油。優(yōu)選葡萄糖和糖蜜。氮源的實例包括無機(jī)來源如氨，氯化銨，和硫酸銨，和有機(jī)來源如胨，NZ-胺，牛肉膏，酵母提取物，玉米漿，酪蛋白水解物，魚或魚粉，和脫脂豆餅或豆粉。優(yōu)選酵母提取物和玉米漿。無機(jī)化合物的實例包括磷酸一氫鉀，磷酸二氫鉀，硫酸鎂，硫酸亞鐵，硫酸錳和碳酸鈣。當(dāng)需要時，可使用維生素和營養(yǎng)缺陷型基質(zhì)(auxotrophic bases)。對于培養(yǎng)，可使用通過通氣進(jìn)行的振蕩培養(yǎng)或攪拌培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為30-45℃，優(yōu)選37-40℃。在培養(yǎng)過程中，優(yōu)選將pH調(diào)至相當(dāng)中性的水平。培養(yǎng)期為5-6天。
依照本發(fā)明的一個實施方案，將枯草芽孢桿菌CJKB0001(KCCM-10445)接種到接種培養(yǎng)基中，并在1vvm的通氣流速、37℃和8,000rpm的條件下培養(yǎng)20小時。將接種培養(yǎng)物接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在1vvm的通氣流速、40℃，800rpm和pH7.0的條件下，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)60-70小時。在振蕩培養(yǎng)過程中，對發(fā)酵培養(yǎng)物補(bǔ)充以葡萄糖補(bǔ)充培養(yǎng)基，以維持培養(yǎng)物中殘余葡萄糖水平為0.5-1％，直至發(fā)酵培養(yǎng)物中葡萄糖總含量達(dá)到20％為止。當(dāng)與親株相比較時，產(chǎn)生了增加約19.6％水平的核黃素。
以下，通過實施例將更具體地描述本發(fā)明。然而，提供下述實施例僅是為了解釋本發(fā)明，因此本發(fā)明不被它們所限制。
具體實施例方式
實施例1篩選本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CJKB0001為了獲得本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CJKB0001，將作為親株的枯草芽孢桿菌AS5進(jìn)行突變。然后，在含硫代脯氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌AS5的突變株，以獲得集落。在這些集落中，篩選具有最高核黃素生產(chǎn)力的突變株，命名為枯草芽孢桿菌CJKB0001。
作為親株的枯草芽孢桿菌AS5獲自BIONOM-S，Ltd.(Obolensk，莫斯科，俄羅斯)。將枯草芽孢桿菌AS5懸浮于pH 7.0的磷酸鹽緩沖液或pH5.5的檸檬酸鹽緩沖液中，使得細(xì)胞密度為107-108細(xì)胞/ml。向混懸液中加入突變誘導(dǎo)劑N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍，直至它的濃度為10-50μg/ml。在室溫或30℃下孵育得到的混合物30-60分鐘，以誘導(dǎo)突變。然后，用0.85％鹽溶液洗滌混合物三次，并以適當(dāng)?shù)姆绞较♂?。將稀釋的溶液接種到具有各種濃度硫代脯氨酸的含1.8％瓊脂的基本培養(yǎng)基中，并在37℃培養(yǎng)5天以獲得集落。在這種情況下，硫代脯氨酸的濃度為0mg/l-100mg/l。將形成的集落接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，并在37℃培養(yǎng)24小時。然后，將得到的營養(yǎng)培養(yǎng)物接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在37℃培養(yǎng)4-5天。篩選生產(chǎn)核黃素最高的菌株。每種培養(yǎng)基組分示于表1。
表1篩選本發(fā)明枯草芽孢桿菌CJKB0001的培養(yǎng)基組分

通過HPLC測量核黃素的生產(chǎn)力。利用與kromasil C18(5μm)柱(內(nèi)徑4.6mm，長250mm)偶聯(lián)的waters 510來進(jìn)行HPLC。5mM六磺酸鈉和20mM H3PO4的混合溶劑和乙腈(89∶11，體積/體積)用作流動相。流動相的流速為1ml/min。樣品的注射量為15μl，并使用蒸餾水稀釋樣品。另外，使用UV監(jiān)測儀(TSP UV2000，UV260nm)作為監(jiān)測儀。
依照試驗結(jié)果，在含70mg/l硫代脯氨酸的培養(yǎng)基上生長的突變株顯示杰出的核黃素生產(chǎn)力。在它們中間，篩選到一個具有最高核黃素生產(chǎn)力的突變株，并表示為枯草芽孢桿菌CJKB0001?？莶菅挎邨U菌CJKB0001于2002年11月18日被保藏于韓國微生物培養(yǎng)中心，保藏號KCCM-10445。
實施例2評估枯草芽孢桿菌CJKB0001和枯草芽孢桿菌AS5對硫代脯氨酸的抗性在本實施例中，為了評估對硫代脯氨酸的抗性，將實施例1的枯草芽孢桿菌CJKB0001(KCCM-10445)和作為親株枯草芽孢桿菌AS5在含各種濃度硫代脯氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。詳細(xì)地，將各個菌株接種到如表1所示的含硫代脯氨酸的培養(yǎng)基中，并在37℃培養(yǎng)5天。在這種情況下，硫代脯氨酸的濃度為0-100mg/l。
依照如表2所示的試驗結(jié)果，在含多于40mg/l硫代脯氨酸的培養(yǎng)基中枯草芽孢桿菌AS5不能生長。另一方面，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CJKB0001(KCCM-10445)甚至可在含70mg/l硫代脯氨酸的培養(yǎng)基中生長。
表2評估枯草芽孢桿菌CJKB0001和枯草芽孢桿菌AS5對硫代脯氨酸的抗性菌株硫代脯氨酸的濃度(mg/l)0 20 40 50 70 100枯草芽孢桿菌AS5 +++++ + - - -枯草芽孢桿菌++++++ +++++ + -CJKB0001(KCCM-10445)+生長，-不生長實施例3在瓶中本發(fā)明枯草芽孢桿菌CJKB0001的發(fā)酵潛能評估在瓶中枯草芽孢桿菌CJKB0001(KCCM-10445)和枯草芽孢桿菌AS5的發(fā)酵潛能。將每個菌株接種到接種培養(yǎng)基中并培養(yǎng)。然后，將每個接種培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到在瓶中的發(fā)酵培養(yǎng)基中。接種培養(yǎng)基如下制備在具有18mm直徑的試驗管中分配5ml的接種培養(yǎng)基，然后在121℃下壓力滅菌試驗管15分鐘。將每個枯草芽孢桿菌CJKB0001和枯草芽孢桿菌AS5接種到接種培養(yǎng)基中，并在200rpm和37℃下振蕩培養(yǎng)20小時。當(dāng)完成接種培養(yǎng)時，將1ml每個接種培養(yǎng)物接種到瓶中的發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在200rpm和37℃下振蕩培養(yǎng)90小時。通過以與制備接種培養(yǎng)基相同的方式在壓力滅菌培養(yǎng)基FA和培養(yǎng)基FS，并將15ml培養(yǎng)基FA和5ml培養(yǎng)基FS分配到250ml振蕩培養(yǎng)瓶中來制備發(fā)酵培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)瓶在壓力下預(yù)先滅菌。當(dāng)發(fā)酵完成時，以與實施例1相同的方式測量積累到發(fā)酵培養(yǎng)物中的核黃素的濃度。本實施例中使用的接種培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的每個組分示于表3。
表3適于在瓶中發(fā)酵的培養(yǎng)基的組分

依照試驗結(jié)果，作為親株的枯草芽孢桿菌AS5生產(chǎn)7.2g/l核黃素。另一方面，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CJKB0001(KCCM-10445)生產(chǎn)8.0g/l核黃素，其比枯草芽孢桿菌AS5高11％。
實施例4在5升發(fā)酵罐中，本發(fā)明枯草芽孢桿菌CJKB0001的發(fā)酵潛能以比較的方式評估枯草芽孢桿菌CJKB0001(KCCM-10445)和枯草芽孢桿菌AS5在5升發(fā)酵罐中的發(fā)酵潛能。將每個菌株接種到接種培養(yǎng)基中并培養(yǎng)。然后，將每個接種培養(yǎng)物接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，并補(bǔ)料分批培養(yǎng)。為了這樣，首先，將1升每種接種培養(yǎng)基分發(fā)到2.5升的實驗室發(fā)酵罐中，并在121℃下壓力滅菌10分鐘，以制備接種培養(yǎng)基。在接種培養(yǎng)基冷卻后，將10ml的每種枯草芽孢桿菌CJKB0001和枯草芽孢桿菌AS5在鹽溶液中的混懸液接種到接種培養(yǎng)物中。然后，將每種含菌株的接種培養(yǎng)物在1vvm速率的無菌通風(fēng)、37℃和8000rpm的條件下孵育20小時。在接種培養(yǎng)過程中，不調(diào)整pH。在接種培養(yǎng)完成后，將每種接種培養(yǎng)物接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，并進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)。通過將1.4升發(fā)酵培養(yǎng)基分發(fā)到5升實驗室發(fā)酵罐中，然后在121℃下壓力滅菌20分鐘來制備發(fā)酵培養(yǎng)基。在發(fā)酵培養(yǎng)基冷卻后，將200ml每種接種培養(yǎng)物接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在1vvm速率的通風(fēng)、800rpm和40℃的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在發(fā)酵過程中，向每種發(fā)酵培養(yǎng)物補(bǔ)充以葡萄糖補(bǔ)充培養(yǎng)基，以維持培養(yǎng)物中殘余葡萄糖的水平為0.5-1％，直至發(fā)酵培養(yǎng)物中葡萄糖的總含量達(dá)到20％為止。在發(fā)酵過程中，使用含水氨將pH維持在7.0。發(fā)酵進(jìn)行60-70小時。當(dāng)發(fā)酵完成時，以與實施例1相同的方式測量積累在發(fā)酵培養(yǎng)物中的核黃素的濃度。在本實施例中使用的接種培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的每個組分示于表4。
表4適于在5升發(fā)酵罐中培養(yǎng)的培養(yǎng)基的組分

依照試驗結(jié)果，作為親株的枯草芽孢桿菌AS5生產(chǎn)22.4g/l核黃素。在另一方面，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CJKB0001(KCCM-10445)生產(chǎn)26.8g/l核黃素，其比枯草芽孢桿菌AS5生產(chǎn)的核黃素高約19.6％。
從上述描述中顯而易見，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌對脯氨酸類似物具有高的抗性，并且在菌體內(nèi)具有增加的脯氨酸合成，以獲得增高的滲透壓，導(dǎo)致以高產(chǎn)率生產(chǎn)高濃度的核黃素。因此，可大量生產(chǎn)核黃素。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌，其對脯氨酸類似物具有抗性。
2.依照權(quán)利要求1的枯草芽孢桿菌，其是枯草芽孢桿菌CJKB0001(KCCM-10445)。
3.一種生產(chǎn)核黃素的方法，包括培養(yǎng)依照權(quán)利要求1或2的枯草芽孢桿菌，并從培養(yǎng)物中回收核黃素。
全文摘要
抗脯氨酸類似物的生產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌，和一種利用提供的枯草芽孢桿菌生產(chǎn)核黃素的方法。
文檔編號C12N1/20GK1504564SQ0314307
公開日2004年6月16日 申請日期2003年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月5日
發(fā)明者李光鎬, 樸英薰, 韓鍾權(quán), 樸長熙, 李庚翰 申請人:Gj株式會社