專利名稱：應用于水稻白葉枯病菌檢測的探針和引物序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于植物病原細菌檢測的核酸序列
背景技術：
水稻白葉枯病是水稻上一種主要的細菌性病害，最早于1884年在日本岡縣發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已在亞洲、非洲、美洲和澳大利亞等地發(fā)生。該病在亞洲為害最為嚴重，尤其在周年種植水稻的南亞和東南亞地區(qū)。我國大部分地區(qū)均有發(fā)生，一般減產(chǎn)10％-30％，嚴重可達50％以上。是許多國家的檢疫對象。水稻細菌性條斑病亦是水稻上一種重要的細菌性病害，在亞洲廣泛分布。在我國部分地區(qū)此病發(fā)生嚴重，一般發(fā)病輕的減產(chǎn)5％-10％，嚴重發(fā)病可減產(chǎn)20％以上。是我國內(nèi)檢對象。由于細菌性病害一旦發(fā)生，目前在農(nóng)業(yè)上還沒有有效的防治方法，并且種子帶菌是兩病重要的初侵染來源與傳播途徑。因此及早檢測發(fā)現(xiàn)種子上的病原菌及無癥狀病害，對于預防及采取相應措施加以防治，指導生產(chǎn)，減少經(jīng)濟損失，有著重要的意義。
水稻白葉枯病的病原為Xanthomonas oryzae pv.oryzae，水稻細菌性條斑病的病原為Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，為黃單胞菌屬細菌同一種下的不同變種。目前水稻白葉枯病菌檢測的最大困難是難以將其與稻細菌性條斑病區(qū)分。區(qū)分這兩種病原的檢測鑒定主要依據(jù)是其癥狀特點、寄主范圍、致病性、血清學反應、形態(tài)、培養(yǎng)、生理生化特性等。這些方法費時費力，需要對病原進行分離純化，往往因為樣品帶菌少和分離純化過程復雜等而失敗，從而造成漏檢及病菌的擴散。因此生產(chǎn)上迫切需要建立快速、簡單、靈敏、準確的檢測鑒定這兩種病菌的方法。
近年來，PCR技術用于水稻白葉枯病菌的檢測已有許多報道，但由于水稻白葉枯病菌與水稻細菌性條斑病菌這兩種病原親緣性極高。這些方法仍無法直接區(qū)分鑒別這兩種菌，并且所采用的普通PCR過程復雜，需要PCR后處理，易造成污染和假陽性，涉及溴化乙錠等對人體有害物質(zhì)。
在植物病原細菌的分子診斷中，常被選用的靶基因有16SrRNA基因(16SrDNA)23SrRNA基因(23SrDNA)，16S-23SrRNA間區(qū)，IS1113扦入序列等。而水稻白葉枯菌和水稻細菌性條斑病菌兩菌的這些基因完全相同，用這些基因根本無法對這兩個親緣關系密切的變種進行檢測鑒定。因此我們根據(jù)含鐵細胞接受子基因序列中兩菌的差異性設計了兩種特異性的引物和探針。以此引物和探針為基礎，利用實時PCR技術對該兩種病原和水稻樣品進行了檢測鑒定。本方法可以快速直接的對白葉枯病菌進行鑒定，而且無需從水稻種子中分離病菌和核酸提取，直接以種子浸出液為模板進行檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種快速靈敏準確的檢測鑒定并區(qū)分水稻白葉枯菌和水稻細菌性條斑病菌的特異性方法。
(1)技術方案為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明分為以下幾個步驟以水稻白葉枯病菌DNA或直接以病原菌作為模板，以引物PSRGF和PSRGR進行PCR擴增，利用引物PSRGF(5′-GAATATCAGCATCGGCAACAG-3′)和PSRGR(5′-TACCGGAGCTGCGCGTT-3′)，擴增含鐵細胞接受子基因的保守序列，利用特異性探針Baiprobe(5′-FAM-CATCGCCTGCTCGGCTA CCAGC-TAMRA-3′)對白葉枯菌進行鑒定。雜交溫度為60-70℃水稻種子在0.01％Tween 20溶液中4℃過夜，浸泡液直接作模板或16000rpm(16886g)4℃離心20分鐘，去上清，沉淀用滅菌雙蒸水10μl溶解，取1μl懸浮液作模板進行實時熒光PCR.反應體系10×PCR緩沖液2.5μl，25mmol/LMgCl2 5μl，10mMdATP、dUTP、dGTP、dCTP各0.5μl，20μmol/L引物各0.5μl，20μlmol/L探針1μl，1U/μl UNG酶0.15μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl，模板DNA 1μl，加滅菌雙蒸水使總體積為25μl。優(yōu)化后的退火溫度為68℃(2)技術效果能夠利用該探針和引物對水稻種子、葉片、植株等樣品進行水稻白葉枯和水稻細菌性條斑病菌檢測的特異性檢測。
(3)實施例模板的制備
按照CTAB抽提法提取植物總DNA，種子在0.01％Tween 20溶液中4℃過夜，浸泡液直接作模板或16000rpm(16886g)4℃離心20分鐘，去上清，沉淀用滅菌雙蒸水10μl溶解，取1μl懸浮液作模板。
實時熒光PCR檢測反應體系10×PCR緩沖液2.5μl，25mmol/LMgCl2 5μl，10mMdATP、dUTP、dGTP、dCTP各0.5μl，20μmol/L引物各0.5μl，20μlmol/L探針1μl，1U/μl UNG酶0.15μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl，模板DNA 1μl，加滅菌雙蒸水使總體積為25μl。以水稻條斑病菌及其他屬典型菌的DNA作對照。
樣品檢測將樣品放入ABIPRISM7700 96孔反應板上打開SequenceDetection 1.71，設置PCR反應條件，第一個循環(huán)為50℃，2min，95℃，10min；后40個循環(huán)為94℃，15S；68℃，1min。點擊運行，進行PCR反應，1小時56分鐘反應結束，保存文件，打開分析軟件，儀器自動分析試驗結果。給出ΔRn(第n循環(huán)時的熒光信號增加值)與循環(huán)數(shù)圖象。
結果分析從熒光信號收集圖上可明顯看出，Baiprobe探針僅能檢測到感染白葉枯菌的種子及白葉枯菌質(zhì)粒產(chǎn)生增加信號，健葉與水對照均無熒光信號，其他菌亦未檢測到熒光信號。說明該探針和引物能準確的區(qū)分開白葉枯菌和其他病原菌。
權利要求
1.病原菌鑒定檢測用探針和引物，其特征在于利用特定序列的探針和引物對水稻白葉枯病菌進行檢測。
2.根據(jù)權利要求1的探針和引物，通過基因芯片對水稻白葉枯病菌進行檢測。
3.根據(jù)權利要求1的檢測用探針和引物，通過實時PCR方法對水稻白葉枯病菌進行檢測。
4.根據(jù)權利要求1的檢測用探針和引物，探針為寡核苷酸或肽核酸。
5.根據(jù)權利要求1的檢測用探針和引物，檢測的基因為含鐵細胞接受子基因。
6.根據(jù)權利要求1的檢測用探針和引物，實時PCR檢測中，退火溫度為60-70℃。
7.根據(jù)權利要求1的檢測用探針和引物，探針為熒光標記探針。
8.根據(jù)權利要求1的檢測用探針和引物，引物序列為5′-GAATATCAGCATCGGCAACAG-3′和5′-TACCGGAGCTGCGCGTT-3′，探針序列為5′-FAM-CATCGCCTGCTCGGCTA CCAGC-TAMRA-3′
9.根據(jù)權利要求1的檢測用探針和引物，擴增序列為GAATATCAGCATCGGCAACAGCGCTCGGTGCCGGGCTATCAACTGCTGGGTGGCACGCAGGTGCCGCGTGATATCGATGTGCATCGCCTGCTCGGCTACCAGCCGTGGGCACGTCCGGTGGAAATGGATTCGCTCAACGCGCAGCTCCGGTA
全文摘要
水稻白葉枯病是水稻上一種主要的細菌性病害，由于其與水稻細菌性條斑病菌親緣性極高，目前難以直接區(qū)分。根據(jù)含鐵細胞接受子基因序列差異性設計了特異性引物和探針。利用該探針對帶菌水稻種子和葉片進行了檢測。該探針可以快速直接的對白葉枯病菌進行鑒定，而且無需從水稻種子中分離病菌和核酸提取，直接以種子浸出液為模板進行檢測。利用該探針檢測特異性強，可以直接鑒定到亞種。
文檔編號C12Q1/04GK1524964SQ03105358
公開日2004年9月1日 申請日期2003年2月26日 優(yōu)先權日2003年2月26日
發(fā)明者朱水芳, 廖曉蘭, 趙文軍 申請人:國家質(zhì)量檢驗檢疫總局動植物檢疫實驗所, 國家質(zhì)量檢驗檢疫總局動植物檢疫實驗