專利名稱：多肽純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)于一種多肽純化的方法及用此法得到的產(chǎn)物。本發(fā)明尤其，但并非僅僅關(guān)于需經(jīng)過(guò)折疊才可獲得生物活性的多肽的純化方法及其產(chǎn)物，如酪氨酸激酶受體TrkA，TrkB和TrkC及其生物活性變體和片段(全部稱作“酪氨酸激酶受體相關(guān)多肽”)。
背景技術(shù)：
酪氨酸激酶受體TrkA，TrkB和TrkC結(jié)合神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白。TrkA具有與神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3(NT3)高親和力結(jié)合的生物活性。TrkB和TrkC結(jié)合其它的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白。TrkB高親和力結(jié)合大腦衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-4(NT4)。TrkC與NT3高親和力結(jié)合。對(duì)TrkB和TrkC的鑒定，克隆及測(cè)序在專利US6027927中有描述。每一種受體分子均含多個(gè)結(jié)構(gòu)域。酪氨酸激酶受體分子的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(Ig)對(duì)應(yīng)用于治療有特殊價(jià)值，尤其如申請(qǐng)人的尚未授權(quán)的專利申請(qǐng)WO99/53055描述的，TrkAIg2及其變體可用于治療，如剪接變體TrkAIg2.6。
由于治療上的應(yīng)用需大規(guī)模生產(chǎn)酪氨酸激酶受體衍生多肽。在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)重組多肽有較多優(yōu)點(diǎn)，特別是其產(chǎn)量可高達(dá)人細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的10倍。
表達(dá)得到的多肽處理困難，如TrkA的第二免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域TrkAIg2，通常以單體，二聚體和聚集體(即二聚體的聚合物，也可能是單體和二聚體的聚合物)的混合物的形式存在。而TrkBIg2和TrkCIg2特別是TrkAIg2的活性形式是單體。因此，產(chǎn)物不能發(fā)揮療效。如Robertson A.G.S.et al(Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 282(1)131-141 Mar 23 2001)所述TrkAIg2二聚體不能結(jié)合NGF因此無(wú)生物活性。少量的二聚體或聚集體極可能引起更多聚集體的產(chǎn)生導(dǎo)致有生物活性的單體數(shù)目的減少。這點(diǎn)比較特殊，因?yàn)樵S多蛋白會(huì)以單體，二聚體或四聚體達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡的形式存在(例如人生長(zhǎng)激素)。為保證制品的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，需除去二聚體。和許多蛋白一樣，酪氨酸激酶受體相關(guān)多肽需有正確的構(gòu)象才能有生物活性。多肽在細(xì)菌包涵體中發(fā)生錯(cuò)誤的重折疊，未形成正確構(gòu)象，因而無(wú)生物活性。多肽在重組表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)后必須重新折疊成正確的構(gòu)象。表達(dá)后的進(jìn)一步折疊稱為“重折疊”。
我們僅知道另外有兩個(gè)研究小組在細(xì)菌細(xì)胞中制備重組體TrkAIg2。Ultsch et al(J Mol Biol(1999)290，149-159)制備TrkAIg2，TrkBIg2和TrkCIg2。他們以可溶性蛋白而非包涵體的形式制備TrkAIg2，通過(guò)離子交換，疏水作用，再離子交換，凝膠過(guò)濾純化產(chǎn)物。由于這里的凝膠過(guò)濾這一步驟并不能使多肽發(fā)生重折疊，我們推測(cè)多肽的可溶性蛋白形式已具有正確構(gòu)象。TrkBIg2和TrkCIg2盡管用相同的方法表達(dá)，但不可溶，需將它們?nèi)苡谀蛩夭⑼ㄟ^(guò)透析法重折疊，再用離子交換法進(jìn)一步純化。得到的TrkAIg2，TrkBIg2和TrkCIg2晶體為鏈交換的二聚體，即，一個(gè)單體的A鏈和另一單體的B鏈配對(duì)形成的二聚體(見(jiàn)圖1)。圖1顯示了一個(gè)鏈交換的含有2個(gè)TrkAIg2單體的二聚體，其中單體X的A鏈未折疊，與單體Y的B鏈結(jié)合。同時(shí)，單體Y的A鏈未折疊，與單體X的B鏈結(jié)合。它們都沒(méi)有活性。文獻(xiàn)的討論部分提到這些二聚體不能與天然配體結(jié)合，在293細(xì)胞中作為免疫粘附素表達(dá)的結(jié)構(gòu)域則相反(Urfer et al(1995)ENBOJournal 14，12，p2795-2805)。TrkAIg2-免疫粘附素分子結(jié)構(gòu)在動(dòng)物細(xì)胞中結(jié)合NGF的活性應(yīng)歸功于含有TrkAIg2正確構(gòu)象的免疫粘附素大支架結(jié)構(gòu)(IgG的Fc段)，它引起廣泛的糖基化并顯著影響此結(jié)構(gòu)與其它分子的結(jié)合。
Windisch et al(Windisch，J M.et al(1995)J.Biol Chem.270 47p28133-28138)以麥芽糖結(jié)合蛋白融合結(jié)構(gòu)生產(chǎn)了包括TrkAIg2的TrkA衍生物，但這個(gè)結(jié)構(gòu)是沒(méi)有活性的，不能用于治療。麥芽糖結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)與“困難”蛋白一起使用。曾以為其結(jié)構(gòu)是正確折疊的，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)事實(shí)并非如此。
Wiesmann et al(Nature，9thSeptember 1999 401，184-188)通過(guò)同時(shí)加入NGF和TrkAIg1.2即含有兩個(gè)TrkA Ig樣結(jié)構(gòu)域的多肽得到NGF和TrkAIg2的共結(jié)晶物。經(jīng)過(guò)很長(zhǎng)一段時(shí)間，TrkAIg1被慢慢“吃掉”，只留下TrkAIg2與NGF結(jié)合。這種方法不適合商業(yè)化生產(chǎn)酪氨酸激酶受體相關(guān)多肽。
Holden et al(Holden，P.H.et al Nature Biotechnology，15，July 1997page 668-672)描述了一種方法，可在E.coli中以包涵體形式生產(chǎn)酪氨酸激酶受體相關(guān)多肽活性片段及衍生物。此法將多肽從包涵體中提取后通過(guò)一個(gè)透析步驟重新折疊，但產(chǎn)率僅約16毫克/升。專利WO99/53055描述了一個(gè)類似的純化方法，可純化從E.coli包涵體獲得的包括TrkAIg2的TrkA活性片段及其衍生物，也需要透析，產(chǎn)率為約50毫克/升。但產(chǎn)物的穩(wěn)定性較低，需立即快速冷凍才可進(jìn)一步使用。
如上所述，在Ultsch et al，WO99/53055和Holden et al中描述的方法均有透析的步驟。透析的缺點(diǎn)在于需大量透析緩沖液控制多肽的濃度(一般約為0.1毫克/毫升)以防止多肽的聚合。因此包括透析步驟的酪氨酸激酶受體相關(guān)多肽的生產(chǎn)方法都不適合商業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)多肽特別是酪氨酸激酶受體相關(guān)多肽的方法，比以前的工藝有更高的產(chǎn)率。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種方法，得到比以前的工藝有更高穩(wěn)定性的產(chǎn)物。
發(fā)明概要如本發(fā)明的一個(gè)方面所述，提供了一種生產(chǎn)酪氨酸激酶受體相關(guān)多肽的方法，該方法包括在重組表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)酪氨酸激酶受體相關(guān)多肽，并通過(guò)分離步驟將表達(dá)得多肽的單體形式從多聚體的形式中分離出來(lái)，而且在分離步驟中，表達(dá)得多肽重新折疊成具有生物活性的形式。
這個(gè)方法較之以前的工藝有以下優(yōu)點(diǎn)。首先，此法的產(chǎn)率有了顯著提高。其次，此法使多肽的商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)成為可能。第三，此法不需要單獨(dú)的透析步驟進(jìn)行重折疊。由于透析要求多肽在低濃度下長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行重折疊，會(huì)消耗大量昂貴的緩沖液。透析之后需要一個(gè)回收多肽的步驟，通過(guò)離子交換或親和分離實(shí)現(xiàn)。離子交換需提高NaCl濃度洗脫產(chǎn)物，往往導(dǎo)致多肽的聚合。而親和分離，比如用組氨酸標(biāo)記后經(jīng)鎳螯合柱分離，同樣需高濃度NaCl，用咪唑洗脫，經(jīng)凝膠過(guò)濾除去雜質(zhì)。第四，此法比以前含透析步驟的工藝快速，因?yàn)橥肝鲂柽^(guò)夜處理。第五，此法得到的產(chǎn)物更加穩(wěn)定。產(chǎn)物可在約4℃穩(wěn)定存在至少三個(gè)月，無(wú)需立即快速冷凍。由于產(chǎn)物二聚化程度低，進(jìn)一步聚合的可能性減小。第六，產(chǎn)物可在較高濃度下得到(高達(dá)650μM)，并且不產(chǎn)生鏈交換的二聚體。第七，由于多肽無(wú)需如透析所要求的和尿素長(zhǎng)時(shí)間接觸，酰胺化的可能性很小。酰胺化會(huì)影響生物活性，同時(shí)，在檢驗(yàn)活性時(shí)用氨聯(lián)法連接多肽和芯片基質(zhì)的難度也會(huì)增大。這些優(yōu)點(diǎn)使得用本發(fā)明提供的方法生產(chǎn)的多肽在某些應(yīng)用中，如生物傳感器，更加實(shí)用。
酪氨酸激酶受體可以是天然TrkA，TrkB或TrkC或其活性同源物，變體，片段或含有這些同源物，變體，片段的結(jié)構(gòu)。多肽最好是TrkAIg2或TrkBIg2，特別適合用本發(fā)明提供的方法生產(chǎn)的多肽是TrkA，TrkB，TrkC受體的Ig2亞結(jié)構(gòu)域，最好是TrkAIg2或TrkAIg2.6。
適合的結(jié)構(gòu)可以包括相應(yīng)天然受體的附加C末端序列。
多肽可帶有一段組氨酸標(biāo)記序列被表達(dá)。酪氨酸激酶受體序列最好是人源的。酪氨酸激酶受體相關(guān)多肽可以不可溶的形式被表達(dá)。酪氨酸激酶受體相關(guān)多肽最好在細(xì)菌包涵體中表達(dá)。多肽多聚體形式包括二聚體。多肽最好能夠高親和力地與天然酪氨酸受體配體結(jié)合。
分離步驟最好含凝膠過(guò)濾。鹽濃度在0mM-500mM范圍內(nèi)比較合適，25mM-200mM更佳，最佳約為100mM，如80mM-120mM。所用凝膠最好能分離分子量約為12-40KDa的分子，如Sephacryl 200，SuperDex 75或SuperDex 200。
分離步驟最好在堿性pH下進(jìn)行，且低于發(fā)生變性的pH。一般選擇pH8-9，最佳pH8.5。TrkA例外，因?yàn)門rkAIg2理論等電點(diǎn)為4.6-6.0。TrkAIg2結(jié)構(gòu)含很多β-折疊，此類蛋白大多會(huì)在其pI附近發(fā)生聚集和沉淀。然而，TrkAIg2在正常鹽濃度的溶液中會(huì)在生理pH附近聚集和沉淀，這個(gè)值與其pI明顯不符。
凝膠過(guò)濾時(shí)，洗脫速度最好為2.5毫升/分鐘，約93分鐘時(shí)收集單體。這個(gè)時(shí)間會(huì)隨儀器和操作條件的變化而變化。多肽最好用細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面，提供了一種用細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)從包涵體中純化重組TrkAIg2或TrkAIg2.6的方法。在這個(gè)方法中，通過(guò)凝膠過(guò)濾的步驟將TrkAIg2單體從TrkAIg2的單體和多聚體的混合物中分離出來(lái)，并發(fā)生重折疊形成活性形式。典型的TrkAIg2多聚體包括TrkAIg2二聚體。
本發(fā)明也提供了一種用本發(fā)明提供的方法得到或能夠得到的穩(wěn)定的TrkAIg2制品，此制品中TrkAIg2二聚體或二聚體聚集物的含量小于20％，較佳的小于1％，最佳的小于0.1％。
本發(fā)明也提供了一種用本發(fā)明提供的方法得到或能夠得到的穩(wěn)定的TrkAIg2制品，此制品中TrkAIg2單體含量高于80％，較佳的高于99％，最佳的100％。更可取地，單體實(shí)際上均以活性形式存在。
本發(fā)明也提供了一種用本發(fā)明提供的方法得到或能夠得到的TrkAIg2.6制品，此制品中TrkAIg2.6二聚體或二聚體聚集物的含量小于20％，較佳的小于1％，最佳的小于0.1％。
本發(fā)明也提供了一種用本發(fā)明提供的方法得到或能夠得到的穩(wěn)定的TrkAIg2.6制品，此制品中TrkAIg2.6單體含量高于80％，較佳的高于99％，最佳的100％。更可取地，單體實(shí)際上均以活性形式存在。
本發(fā)明也提供了一種用本發(fā)明提供的方法得到或能夠得到的穩(wěn)定的TrkBIg2制品，此制品中TrkBIg2二聚體或二聚體聚集物的含量小于20％，較佳的小于1％，最佳的小于0.1％。
本發(fā)明也提供了一種用本發(fā)明提供的方法得到或能夠得到的穩(wěn)定的TrkBIg2制品，此制品中TrkBIg2單體含量高于80％，較佳的高于99％，最佳的100％。更可取地，單體實(shí)際上均以活性形式存在。
本發(fā)明也提供了一種用本發(fā)明提供的方法得到或能夠得到的穩(wěn)定的TrkCIg2制品，此制品中TrkCIg2二聚體或二聚體聚集物的含量小于20％，較佳的小于1％，最佳的小于0.1％。
本發(fā)明也提供了一種用本發(fā)明提供的方法得到或能夠得到的穩(wěn)定的TrkCIg2制品，此制品中TrkCIg2單體含量高于80％，較佳的高于99％，最佳的100％。更可取地，單體實(shí)際上均以活性形式存在。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種從免疫球蛋白樣多肽的單體和多聚體的混合物中獲得單體的方法。此方法包括在重組表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)多肽，經(jīng)一個(gè)分離步驟將多肽的單體從單體和多聚體的混合物中分離出來(lái)并使單體重折疊形成活性形式。因此，本發(fā)明提供了一種純化免疫球蛋白樣多肽的方法，它具有上述某些或所有優(yōu)點(diǎn)。分離步驟最好包括凝膠過(guò)濾。


本發(fā)明涉及的方法和產(chǎn)物以實(shí)例描述，并參考附圖2-22圖2顯示氨基酸序列(A)TrkAIg2和TrkAIg2.6；(B)TrkBIg2截短形式和全長(zhǎng)形式(黑體字；pET15b序列(MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM)非黑體字)；(C)TrkCIg2截短形式和全長(zhǎng)形式(黑體字；pET15b序列(MGSSHHHHHH SSGLVPRGSHM)非黑體字)；圖3是FPLC儀記錄在以前所用的透析法和本發(fā)明提供的方法這兩者間進(jìn)行比較的比較試驗(yàn)的覆蓋物圖錄(overlay trace)；圖4顯示不同pH對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的一系列圖錄；圖5顯示用不同體積的透析緩沖液進(jìn)行比較試驗(yàn)的一系列圖錄；圖6顯示用本發(fā)明生產(chǎn)的TrkAIg26His和TrkAIg2.66His的質(zhì)譜分析結(jié)果；圖7顯示TrkBIg26His與A:BDNF和B:NT4的結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖8顯示TrkAIg26His與NGF的結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖9顯示TrkAIg2.66His與NGF的結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖10顯示用本發(fā)明生產(chǎn)的TrkBIg26His的質(zhì)譜分析結(jié)果；圖11顯示用PC12細(xì)胞神經(jīng)突生長(zhǎng)生物測(cè)定法檢測(cè)TrkAIg26His的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖12顯示用本發(fā)明生產(chǎn)的TrkCIg26His的質(zhì)譜分析結(jié)果；圖13顯示TrkCIg26His與NT-3的結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖14顯示TrkAIg26His mRNA的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)；圖15顯示TrkAIg2noHis mRNA的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)；圖16顯示TrkAIg2noHis的一種突變體，有利于TrkAIg2noHis的表達(dá)；圖17顯示圖16所示序列的mRNA的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)；
圖18顯示圖16所示突變序列pET24a-TrkAIg2noHis在E.coli中表達(dá)后的細(xì)胞提取物的SDS-PAGE凝膠檢測(cè)結(jié)果；圖19顯示用本發(fā)明生產(chǎn)的TrkAIg2noHis的質(zhì)譜分析結(jié)果；圖20顯示用PC12細(xì)胞神經(jīng)突生長(zhǎng)生物測(cè)定法檢測(cè)TrkAIg2noHis的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖21顯示TrkBIg2noHis的一種突變體，有利于TrkBIg2noHis的表達(dá)；圖22顯示TrkCIg2noHis的一種突變體，有利于TrkCIg2noHis的表達(dá)。
定義“多肽”這個(gè)名詞包括蛋白質(zhì)，即，天然的具有生物活性的全長(zhǎng)形式的多肽。
“TrkAIg2”一種含有圖2A黑體字所示的氨基酸序列的多肽(無(wú)論是否帶有劃線部分的可得到TrkAIg2.6變體的6個(gè)氨基酸殘基)和同源物(如序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變后得到的保守產(chǎn)物)或含有可提高表達(dá)和/或純化效率的序列的變體，如末端組氨酸序列和凝血酶裂解序列(圖2非黑體字所示)。
“TrkBIg2”和“TrkCIg2”有相似的含義，分別參考圖2B和圖2C所示序列。
“TrkAIg26His”代表含末端組氨酸標(biāo)記的變體，“TrkAIg2noHis”代表不含末端組氨酸標(biāo)記的變體。類似的名詞也適用于相應(yīng)的TrkB和TrkC的變體及其蛋白。
具體說(shuō)明末端組氨酸標(biāo)記的TrkIgs的生產(chǎn)重組TrkAIg26His和TrkAIg2.66His多肽的生產(chǎn)重組TrkAIg26His在E.coli BL21(DE3)中生產(chǎn)，具體方法在專利WO99/53055題為“TrkAIg1，2，TrkAIg1和TrkAIg2的表達(dá)”的部分中有描述，再將末端6個(gè)組氨酸序列連接到多肽的N-端，如圖2A所示。重組TrkAIg2.66His用相同方法制備。
TrkAIg26His多肽的純化和重折疊收集的細(xì)胞在10％的甘油溶液中重懸，用-70℃的液氮冷凍。得到的固體三次通過(guò)Xpress(AB Biox)。提取物以10000rpm的速度于4℃離心30分鐘，沉淀含重組多肽的不溶性包涵體。
包涵體依次用500ml 1％(V/V)Triton X-100，10mM TrisHClpH8.0，接著用1mM EDTA溶液，500ml 1M NaCl，10mM TrisHClpH8.0，1mM EDTA溶液，最后用500ml 10mM TrisHCl pH8.0，1mMEDTA溶液洗滌三次。
然后將包涵體溶解在20mM磷酸鈉，30mM咪唑，8M尿素(pH7.4)的溶液中，離心澄清。8M尿素可用6M胍鹽代替。
離心后的上清液混合物上5ml HisTrap柱(Pharmacia)，用50ml的20mM磷酸鈉，30mM咪唑，8M尿素(pH7.4)的溶液洗滌，純化的TrkAIg26His用25ml的20mM磷酸鈉，300mM咪唑，8M尿素(pH7.4)的溶液洗脫。
為使純化的重組TrkAIg26His多肽重折疊，上一步得到的洗脫物上SuperDex 200凝膠過(guò)濾柱，用20mM磷酸鈉，100mM NaCl，pH8.5的溶液平衡。柱高65厘米，寬2.6厘米，容積345毫升，由制造商預(yù)裝。最大壓力下的流速為2.5毫升/分鐘。
任何聚集體(即，二聚體的聚集物)在空體積(void volume)中被洗脫。二聚體在約80分鐘時(shí)被洗脫，單體在約93分鐘時(shí)被洗脫。每種蛋白的洗脫時(shí)間與柱的直徑和蛋白大小有關(guān)。見(jiàn)下面的公式R＝Vo/VeR是蛋白的滯留系數(shù)，Ve為蛋白洗脫體積，Vo為空體積這里，Ve＝232.5ml，Vo＝122ml122/232.5＝0.53TrkAIg26His單體對(duì)SuperDex 200凝膠的滯留系數(shù)為0.53。
多肽用透析法折疊作為比較。先溶于20mM TrisHCl，50mM NaCl，pH8.5的溶液，用HisTrap柱捕獲，再用25ml的20mM磷酸鈉，300mM咪唑，8M尿素(pH7.4)的溶液洗脫。
Biocad Sprint FPLC(Biocad)記錄不同制備條件下TrkAIg26His單體，二聚體，聚集體的洗脫情況。圖3顯示了用兩種不同的方法透析法(Dialysis)和本發(fā)明所述的方法(“SuperDex”)得到的TrkAIg26His重折疊產(chǎn)物進(jìn)行比較試驗(yàn)洗脫過(guò)程的覆蓋物圖錄。可見(jiàn)，本發(fā)明所述方法可以得到更多的單體。
剪接變體TrkAIg2.66His用相同的方法制備并純化。
PH對(duì)TrkAIg26His洗脫的影響如前所述，TrkAIg26His在E.coli中表達(dá)，純化的包涵體溶解在20mM磷酸鈉，30mM咪唑，8M尿素(pH7.4)的溶液中，離心澄清，上HisTrap柱親和純化，用25ml的20mM磷酸鈉，300mM咪唑，8M尿素(pH7.4)的溶液洗脫。TrkAIg26His洗脫物上SuperDex200凝膠過(guò)濾柱(Pharmacia)，用20mM磷酸鈉，100mM NaCl，pH8.5的溶液平衡。流速為2.5毫升/分。洗脫時(shí)間由蛋白大小決定。單體，二聚體，聚集體的峰值分別在約93分鐘，80分鐘，50分鐘時(shí)出現(xiàn)。圖4顯示pH分別為7.4，8.0，8.5和9.0時(shí)的洗脫結(jié)果?？梢钥吹剑琾H8.5時(shí)產(chǎn)率最高，且單體含量最高，聚集體含量最低。
比較試驗(yàn)分離用透析法重折疊得到的TrkAIg26His產(chǎn)物的單體，二聚體和聚集體。需大量的透析緩沖液。SuperDex 200洗脫分析。
TrkAIg26His在E.coli中表達(dá)，純化的包涵體溶解在20mM磷酸鈉，30mM咪唑，8M尿素(pH7.4)的溶液中，離心澄清，上HisTrap柱親和純化，用25ml的20mM磷酸鈉，300mM咪唑，8M尿素(pH7.4)的溶液洗脫。得到的TrkAIg26His用透析法重折疊，溶于20mM TrisHCl，50mM NaCl，pH8.5的溶液(分別用1升，2升，4升)，處理過(guò)夜。用HisTrap柱捕獲，再用25ml的20mM磷酸鈉，50mMEDTA，8M尿素(pH7.4)的溶液洗脫。洗脫物上SuperDex 200凝膠過(guò)濾柱，用20mM磷酸鈉，100mM NaCl，pH8.5的溶液平衡。流速為2.5毫升/分鐘。需2-4升緩沖液洗滌。當(dāng)透析緩沖液用量為4升時(shí)，單體的產(chǎn)量最高。這個(gè)結(jié)果顯示若用透析法重折疊多肽所需透析緩沖液的量。
結(jié)果見(jiàn)圖5。
用本發(fā)明提供的方法生產(chǎn)的TrkAIg26His和TrkAIg2.66His的特性表達(dá)的TrkAIg26His(A)和TrkAIg2.66His(B)多肽用MALDITOF質(zhì)譜儀檢測(cè)分子量，結(jié)果見(jiàn)圖6。多肽的分子量用PE BiosystemVoyager-DE STR Matrix-Assisted Laser Desorption Time-of-Flight(MALDITOF)質(zhì)譜儀測(cè)定，氮激光波長(zhǎng)為337nm。將芥子酸溶于乙腈和0.1％三氟乙酸的50∶50的混合液，濃度為1mg/100μl，制備新鮮的基質(zhì)溶液。將0.5μl的樣品和基質(zhì)點(diǎn)樣到樣品盤中。樣品與作為一個(gè)接近的外標(biāo)準(zhǔn)(close external standard)使用的Calmix 3(PEBiosystems)對(duì)比來(lái)進(jìn)行校準(zhǔn)。在25000V加速電壓，750nsec的提取時(shí)間和2700激光強(qiáng)度的線性條件下，波譜范圍可達(dá)到5000-80000Da。
測(cè)得的TrkAIg26His的分子量為15717.96Da。與其預(yù)測(cè)的理論分子量(15716.3Da，N-端甲硫氨酸失去后，而這個(gè)甲硫氨酸在由表達(dá)型載體pET15b得到的帶有末端組氨酸標(biāo)記的蛋白中也已被除去)相當(dāng)吻合。
測(cè)得的TrkAIg2.66His的分子量為16575.3Da。與其預(yù)測(cè)的理論分子量(16574.4Da)相當(dāng)吻合。
穩(wěn)定性用上述方法制得的TrkAIg26His和TrkAIg2.66His在4℃時(shí)可穩(wěn)定存在三個(gè)月且未失去活性。
加入某些添加劑，如甘油可提高穩(wěn)定性。
用本發(fā)明提供的方法生產(chǎn)的TrkAIg26His的生物活性i.豚鼠后肢疼痛反應(yīng)用本發(fā)明提供的方法生產(chǎn)的TrkAIg26His的生物活性用豚鼠檢驗(yàn)(Djouhri，L.et al(2001)J.Neuroscience 21 p8722-8733)。CFA(弗氏完全佐劑)注射豚鼠的后肢和膝蓋，引起的炎癥將提高NGF的水平，使動(dòng)物對(duì)痛覺(jué)更加敏感。用玻璃微電極對(duì)L6(腰部)細(xì)胞和S1(骶骨部)DRG神經(jīng)元進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)紀(jì)錄，鉑電極刺激DRG產(chǎn)生作用電位。紀(jì)錄分別在注射CFA后1，2，4天進(jìn)行。C和Aδ纖維是感受傷害的—它們可將痛覺(jué)信號(hào)傳到大腦。α和β纖維則不是。人的傷害性神經(jīng)原在無(wú)外界刺激時(shí)自發(fā)放電是對(duì)炎癥和神經(jīng)性疼痛的反應(yīng)。
在第2，3，4天給豚鼠的后肢和膝蓋注射TrkAIg26His 0.45μg，TrkAIg26His可與內(nèi)源性NGF螯合，消除了CFA誘導(dǎo)的自發(fā)性放電頻率的增加。這意味著完全止痛。
因此，TrkAIg26His能夠抑制豚鼠對(duì)CFA誘導(dǎo)的痛覺(jué)纖維放電的疼痛反應(yīng)。
ii.PC12細(xì)胞生物測(cè)定用本發(fā)明提供的方法生產(chǎn)的TrkAIg26His的生物活性用PC12細(xì)胞神經(jīng)突生長(zhǎng)生物測(cè)定方法檢測(cè)。PC12細(xì)胞是一種大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株，其表面有NGF受體，在NGF刺激下，PC12細(xì)胞體長(zhǎng)出神經(jīng)突。PC12細(xì)胞用完全DMEM培養(yǎng)液(含100單位/毫升青霉素，100μg/ml鏈霉素，10％馬血清，10％胎牛血清(FCS)和2mM谷氨酸)稀釋，以每孔2×104個(gè)細(xì)胞加到膠原蛋白包被的24孔板上，加入NGF，濃度為1ng/ml，并分別加入不同濃度的TrkAIg26His。結(jié)果如圖11所示，為48小時(shí)后神經(jīng)突生長(zhǎng)的照片。細(xì)胞需先固定。圖11A為僅加入1ng/ml NGF時(shí)的神經(jīng)突起，圖11B顯示當(dāng)加入TrkAIg26His1.25μm時(shí)，無(wú)神經(jīng)突生長(zhǎng)。
因此，TrkAIg26His能夠抑制PC12細(xì)胞在NGF刺激下的神經(jīng)突的生長(zhǎng)。
TrkBIg26His結(jié)構(gòu)域亞克隆TrkBIg26His蛋白含成熟蛋白的286-430的氨基酸殘基，及氨基末端的21個(gè)殘基，這21個(gè)殘基含有組氨酸表達(dá)標(biāo)記和凝血酶裂解序列。編碼TrkBIg26His結(jié)構(gòu)域的cDNA序列來(lái)源于λZAP-pBluescriptllSK(-)/TrkB，有我們克隆得到的人TrkB的一個(gè)非催化形式(Allen et al(1994)Neuroscience 60 p825-834)，將此cDNA序列PCR擴(kuò)增。引物(MWG Biotech)引入酶切位點(diǎn)正向引物為Ndel位點(diǎn)(CGCATATGGCACCAACTATCACATTTCTCGAATCTC)，反向引物為BamHI位點(diǎn)(GCGGATCCCTATTAATGRRCCCGACCGGTTTTATC)。
PCR產(chǎn)物亞克隆到pET15b(Novagen)中，構(gòu)建表達(dá)型載體pET15b-TrkBIg26His。
如圖2B所示的TrkBIg26His截短形式以相同的方法生產(chǎn)，但所用的氨基酸序列為286-383殘基。此截短形式與其配體NT4共結(jié)晶，并以X射線晶體結(jié)構(gòu)獲得解釋。
重組TrkBIg26His多肽的生產(chǎn)電感受態(tài)E.coli BL21(DE3)細(xì)胞用pET15b-TrkBIg26His轉(zhuǎn)化，按pET(Vovagen)操作手冊(cè)進(jìn)行表達(dá)。轉(zhuǎn)化后，E.coli細(xì)胞裂解液用SDS-PAGE分析18.5Kda的目的蛋白的表達(dá)。TrkBIg26His蛋白在可溶于尿素的組分中高水平表達(dá)，在其他組分不表達(dá)。挑取一個(gè)菌落接種到2ml的2YT培養(yǎng)液(含200μg/ml青霉素)中，在37℃培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期，再接種到50ml的2YT培養(yǎng)液(含200μg/ml青霉素)中，在37℃培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期，第三次接種到5L的2YT培養(yǎng)液(含200μg/ml青霉素)中，繼續(xù)培養(yǎng)到600nm下光密度為1.0。加入1mM IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。菌體在37℃培養(yǎng)過(guò)夜。收集菌體，在10％甘油溶液中重懸，-80℃冷凍。冷凍的菌體三次通過(guò)Xpress后裂解。連續(xù)用分別含0.1M NaCl，1％Triton X-100，1M NaCl的20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.5)洗滌三次，以除去所有可溶性雜質(zhì)，只留下含有不溶性蛋白的包涵體。
TrkBIg26His多肽的重折疊含不溶性TrkBIg26His蛋白的包涵體在菌體經(jīng)Xpress裂解后釋放出來(lái)，洗滌除去可溶性雜質(zhì)。純化后的包涵體溶于8M尿素緩沖液(20mM磷酸鈉，pH8.5，1mMβ-巰基乙醇)，加入“完全”蛋白酶抑制劑混合物片劑(Roche)，于室溫緩慢震蕩培養(yǎng)2小時(shí)。8M尿素可用6M胍鹽代替。TrkBIg26His蛋白在還原狀態(tài)下(20mM磷酸鈉，pH8.5，8M尿素，10mM咪唑)用HisTrap鎳柱(Pharmacia)純化，用300mM咪唑洗脫。洗脫物上SuperDex 200凝膠過(guò)濾柱(Pharmacia)，在非還原狀態(tài)下(20mM磷酸鈉，pH8.5，100mMNaCl)發(fā)生重折疊。收集分子量約為18.5KDa的洗脫峰，得到的組分含TrkBIg26His單體。
用本發(fā)明提供的方法生產(chǎn)的TrkBIg26His的特性TrkBIg26His的分子量用PE Biosystem Voyager-DE STRMALDITOF質(zhì)譜儀測(cè)定，氮激光波長(zhǎng)為337nm。將芥子酸溶于乙腈和0.1％三氟乙酸的50∶50的混合液，濃度為1mg/100μl，制備新鮮的基質(zhì)溶液。將0.5μl的樣品和基質(zhì)點(diǎn)樣到樣品盤中。樣品與作為一個(gè)接近的外標(biāo)準(zhǔn)使用的Calmix 3(PE Biosystems)對(duì)比來(lái)進(jìn)行校準(zhǔn)。在25000V加速電壓，750ns的提取時(shí)間和2700激光強(qiáng)度的線性條件下，波譜范圍可達(dá)到5000-80000Da。
測(cè)得的TrkBIg26His的分子量為18451.7Da。與其預(yù)測(cè)的理論分子量(18449.1Da)相當(dāng)吻合。
重組TrkCIg26His結(jié)構(gòu)域亞克隆TrkCIg26His蛋白含成熟蛋白的300-399的氨基酸殘基，及氨基末端的21個(gè)殘基，這21個(gè)殘基含有組氨酸表達(dá)標(biāo)記和凝血酶裂解序列。編碼TrkCIg26His結(jié)構(gòu)域的cDNA序列用引入Ndel酶切位點(diǎn)的正向引物(CGCATATGACTGTCTACTATCCCCCAC)和引入BamHI酶切位點(diǎn)的反向引物(GCGGATCCTTATCAGGGCTCCTTGAGGAAGTGGC)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物亞克隆到pET15b(Novagen)中，構(gòu)建表達(dá)型載體pET15b-TrkCIg26His。
重組TrkCIg26His多肽的生產(chǎn)電感受態(tài)E.coli BL21(DE3)細(xì)胞用pET15b-TrkCIg26His轉(zhuǎn)化，按pET(Vovagen)操作手冊(cè)進(jìn)行表達(dá)。轉(zhuǎn)化后，E.coli細(xì)胞裂解液用SDS-PAGE分析13.8KDa的目的蛋白的表達(dá)。TrkCIg26His蛋白在可溶于尿素的組分中高水平表達(dá)，在其他組分不表達(dá)。挑取一個(gè)菌落接種到2ml的2YT培養(yǎng)液(含200μg/ml青霉素)中，在37℃培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期，再接種到50ml的2YT培養(yǎng)液(含200μg/ml青霉素)中，在37℃培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期，第三次接種到5L的2YT培養(yǎng)液(含200μg/ml青霉素)中，繼續(xù)培養(yǎng)到600nm下光密度為1.0。加入1mM IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。菌體在37℃培養(yǎng)過(guò)夜。收集菌體，在10％甘油溶液中重懸，-80℃冷凍。冷凍的菌體三次通過(guò)Xpress后裂解。連續(xù)用分別含0.1M NaCl，1％Triton X-100，1M NaCl的20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)洗滌三次，以除去所有可溶性雜質(zhì)，只留下含有不溶性蛋白的包涵體。全部洗滌在4℃下進(jìn)行。
TrkCIg26His多肽的重折疊含不溶性TrkCIg26His蛋白的包涵體在菌體經(jīng)Xpress裂解后釋放出來(lái)，洗滌除去可溶性雜質(zhì)。純化后的包涵體溶于8M尿素緩沖液(20mM磷酸鈉，pH8.0，1mM β-巰基乙醇)，于室溫緩慢震蕩培養(yǎng)2小時(shí)。8M尿素可用6M胍鹽代替。TrkCIg26His蛋白在還原狀態(tài)下(20mM磷酸鈉，pH8.0，8M尿素，10mM咪唑)用HisTrap鎳柱(Pharmacia)純化，用300mM咪唑洗脫。洗脫物上SuperDex 200凝膠過(guò)濾柱(Pharmacia)，在非還原狀態(tài)下(20mM磷酸鈉，pH8.0，100mM NaCl，1Mm β-巰基乙醇)發(fā)生重折疊。收集分子量約為13.8KDa的洗脫峰，含TrkCIg26His的單體。TrkCIg26His的滯留系數(shù)為0.51。
用本發(fā)明提供的方法生產(chǎn)的TrkCIg26His的特性TrkCIg26His的分子量用PE Biosystem Voyager-DE STRMALDITOF質(zhì)譜儀測(cè)定，氮激光波長(zhǎng)為337nm。將芥子酸溶于乙腈和0.1％三氟乙酸的50∶50的混合液，濃度為1mg/100μl，制備新鮮的基質(zhì)溶液。將0.5μl的樣品和基質(zhì)點(diǎn)樣到樣品盤中。樣品與作為一個(gè)接近的外標(biāo)準(zhǔn)使用的Calmix 3(PE Biosystems)對(duì)比來(lái)進(jìn)行校準(zhǔn)。在25000V加速電壓，750ns的提取時(shí)間和2700激光強(qiáng)度的線性條件下，波譜范圍可達(dá)到5000-80000Da。結(jié)果如圖12所示。
測(cè)得的TrkCIg26His的分子量為13681.9Da。與其預(yù)測(cè)的理論分子量(13685.3Da，N-端甲硫氨酸失去后，而這個(gè)甲硫氨酸在由表達(dá)型載體pET15b得到的帶有末端組氨酸標(biāo)記的蛋白中也已被除去)相當(dāng)吻合。
活性試驗(yàn)TrkAIg26His，TrkAIg2.66His，TrkBIg26His和TrkCIg26His的結(jié)合活性獲得的重組TrkIg2單體可與各自全長(zhǎng)受體的天然配體結(jié)合，且親和力與野生型受體相當(dāng)，這意味著重組產(chǎn)物是有生物活性的。相反，鏈交換的TrkBIg26His二聚體無(wú)生物活性。
TrkIg2結(jié)構(gòu)域與各自配體的結(jié)合力用BiaCore system(BiaCore)的基因表面共振法檢測(cè)。TrkIg2通過(guò)胺偶合與CM5芯片(chip)的基質(zhì)相連。
TrkIg2的結(jié)合活性，表面質(zhì)?；?plasmon)共振i.TrkBIg26HisBDNF以0.1-25nM的濃度通過(guò)芯片，結(jié)合速率和解離速率根據(jù)1∶1朗氏結(jié)合模型估算，KD值為790pM。NT-4以1-100nM的濃度通過(guò)芯片，結(jié)合速率和解離速率根據(jù)1∶1朗氏結(jié)合模型估算，KD值為260pM。結(jié)果見(jiàn)圖7。圖7A顯示BDNF在0.1，0.2，0.5，1.2，5，10和25nM(均重復(fù)實(shí)驗(yàn))濃度下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在給定KD值下，結(jié)合速率和解離速率符合1∶1朗氏結(jié)合模型(Chi2＝4.39)。
圖7B顯示NT-4在1，5，25，50，75和100nM(均重復(fù)實(shí)驗(yàn))濃度下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在給定KD值下，結(jié)合速率和解離速率符合1∶1朗氏結(jié)合模型(Chi2＝2.85)。
ii.TrkAIg26HisNGF以0.1-100nM的濃度通過(guò)芯片，結(jié)合速率和解離速率根據(jù)1∶1朗氏結(jié)合模型估算，KD值為92.6pM。結(jié)果見(jiàn)圖8。
iii.TrkAIg2.66HisNGF以0.1-100nM的濃度通過(guò)芯片，結(jié)合速率和解離速率根據(jù)1∶1朗氏結(jié)合模型估算，KD值為72.9pM。結(jié)果見(jiàn)圖9，顯示出很高的親和力，與生物膜上的野生型受體相當(dāng)。
Djouhri，L.et al(supra)表明TrkAIg26His在體內(nèi)有抑制傷害性神經(jīng)異常放電的作用。
iv.TrkCIg26HisNT-3以0.1-100nM的濃度通過(guò)芯片。芯片用10μl 10mM的甘氨酸在pH1.5下處理可再生。結(jié)合速率和解離速率根據(jù)1∶1朗氏結(jié)合模型估算，KD值為200μM。結(jié)果見(jiàn)圖13。
無(wú)組氨酸末端標(biāo)記的TrkAIgs的生產(chǎn)TrkAIg2noHis的克隆TrkAIg2克隆到pET24a中表達(dá)無(wú)組氨酸末端標(biāo)記的TrkAIg2(TrkAIg2noHis)。若無(wú)修飾，蛋白不能被表達(dá)。
眾所周知，mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)干擾AUG翻譯起始密碼子和/或核糖體結(jié)合位點(diǎn)。用軟件MOFOLD(http//bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/mfold，html)去審查二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)對(duì)表達(dá)并不理想。圖14顯示pET15b中的TrkAIg26His mRNA的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)。編碼組氨酸的mRNA，核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)及脯氨酸殘基(PRO)的密碼子用輪廓線標(biāo)出。圖15顯示pET24a中的TrkAIg2noHis mRNA的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)?？梢钥吹?，其起始位點(diǎn)較6His模型更難接近。相似的空間位阻在TrkBIg2noHis和TrkCIg2noHis中也存在。
用軟件預(yù)測(cè)mRNA結(jié)構(gòu)，為消除RBS的空間位阻，在TrkAIg2noHis中導(dǎo)入沉默突變。圖16給出了野生型及一個(gè)突變的DNA序列，突變堿基以黑體字標(biāo)出。用MFOLD預(yù)測(cè)的mRNA結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖17。圖21和圖22分別給出了TrkBIg2noHis和TrkCIg2noHis的突變序列。
來(lái)源于pET15b-TrkAIg26His質(zhì)粒的TrkAIg2序列經(jīng)PCR擴(kuò)增，正向引物含突變后的堿基GGAATTCCATATGCCTGCTTCAGTACAATTACACACGGCGGTC，反向引物CCGCTCGAGTTATCATTCGTCCTTCTTCTCCACCGGGTCTCCA。引物在TrkAIg2noHis的5’及3’段分別引入Ndel和XhoI的酶切位點(diǎn)。反應(yīng)時(shí)引物加樣量為100-1000pmol。
PCR程序如下94℃預(yù)變性15分鐘后加入PFU聚合酶，94℃變性1分鐘，67℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，循環(huán)30次。最后72℃延伸10分鐘，于4℃放置。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析。TrkAIg2noHis克隆到經(jīng)Ndel和XhoI消化的pET24a構(gòu)建表達(dá)型載體pET24a-TrkAIg2noHis。
圖18顯示E.coli表達(dá)的TrkAIg2noHis的SDS-PAGE分析結(jié)果，(M)標(biāo)記物，(W)全部細(xì)胞提取物，(S)可溶性提取物，(I)不溶性提取物?？梢?jiàn)，TrkAIg2noHis主要在不溶性組分中表達(dá)。
重組TrkAIg2noHis多肽的生產(chǎn)電感受態(tài)E.coli BL21(DE3)細(xì)胞用pET24a-TrkAIg2noHis轉(zhuǎn)化，按pET(Vovagen)操作手冊(cè)進(jìn)行表達(dá)。轉(zhuǎn)化后，E.coli細(xì)胞裂解液用SDS-PAGE分析13.5KDa的目的蛋白的表達(dá)。TrkAIg2noHis蛋白在可溶于尿素的組分中高水平表達(dá)，在其它組分不表達(dá)。挑取一個(gè)菌落接種到2ml的2YT培養(yǎng)液(含50μg/ml鏈霉素)中，在37℃培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期，再接種到50ml的2YT培養(yǎng)液(含50μg/ml鏈霉素)中，在37℃培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期，第三次接種到5L的2YT培養(yǎng)液(含50μg/ml鏈霉素)中，繼續(xù)培養(yǎng)到600nm下光密度為1.0。加入1mM IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。菌體在37℃培養(yǎng)3小時(shí)。收集菌體，在10％甘油溶液中重懸，-80℃冷凍。
制備包涵體冷凍的菌體通過(guò)Xpress處理后與20mMTris緩沖液pH8.5，1mMPMSF，10mM EDTA混勻，輕輕地吸移出來(lái)，加入20mM Tris緩沖液pH8.5。然后以9000rpm的轉(zhuǎn)速離心60分鐘，去上清。該步驟重復(fù)用20mMTris緩沖液pH8.5，1mM PMSF，10mM EDTA，1M NaCl洗滌沉淀，輕輕地吸移出來(lái)加入1％Triton X-100。沉淀最后用20mMTris緩沖液pH8.5，1mM PMSF，10mM EDTA洗滌，于9000rpm離心30分鐘，去上清，得到包涵體，在-70℃冷凍。所有的洗滌操作都在4℃進(jìn)行。
包涵體可用8M尿素溶解，加入20mM Tris緩沖液pH8.5，25mMDTT，在14℃處理3小時(shí)。
TrkAIg2noHis的重折疊含不溶性TrkAIg2noHis蛋白的包涵體在菌體經(jīng)Xpress裂解后釋放出來(lái)，用Triton X-100洗去可溶性雜質(zhì)。純化后的包涵體溶于8M尿素緩沖液(20mM Tris pH8.5，25mM DTT)，于室溫緩慢震蕩培養(yǎng)3小時(shí)。
純化在離子交換柱上進(jìn)行，如Q Sepharose Fast Flow(Pharmacia)，平衡和跑柱均用加了10mM DTT的8M尿素(pH8.5)緩沖液。若用NaCl濃度梯度洗脫，蛋白約在180mM NaCl時(shí)被洗脫，若用一步洗脫，則用200mm的NaCl溶液洗脫。洗脫的蛋白在含100mM NaCl的Tris pH8.5溶液中，以1毫克/毫升的濃度在凝膠過(guò)濾柱上發(fā)生重折疊。
有多種凝膠過(guò)濾介質(zhì)適用于蛋白重折疊SuperDex200，SuperDex75，Sephacryl HR100和Sephacryl HR200。在這個(gè)體系中，TrkAIg2noHis的滯留系數(shù)為0.55。出乎意料的是，在相同條件下，TrkAIg2noHis比TrkAIg26His跑得稍快。得到的單體的數(shù)量會(huì)隨著溶解的增加而增加。洗脫的蛋白單體組分需用Poros Q柱濃縮。
用本發(fā)明提供的方法生產(chǎn)的TrkAIg2noHis的特性TrkAIg2noHis的分子量用PE Biosystem Voyager-DE STRMALDITOF質(zhì)譜儀測(cè)定，氮激光波長(zhǎng)為337nm。將芥子酸溶于乙腈和0.1％三氟乙酸的50∶50的混合液，濃度為1mg/100μl，制備新鮮的基質(zhì)溶液。將0.5μl的樣品和基質(zhì)點(diǎn)樣到樣品盤中。樣品與作為一個(gè)接近的外標(biāo)準(zhǔn)使用的Calmix 3(PE Biosystems)對(duì)比來(lái)進(jìn)行校準(zhǔn)。在25000V加速電壓，750ns的提取時(shí)間和2700激光強(qiáng)度的線性條件下，波譜范圍可達(dá)到5000-80000Da。結(jié)果如圖19所示。
測(cè)得的TrkAIg2noHis的分子量為13561.2Da。與其預(yù)測(cè)的理論分子量(13553Da)相當(dāng)吻合。
用本發(fā)明提供的方法生產(chǎn)的TrkAIg2noHis的生物活性PC12細(xì)胞生物測(cè)定用本發(fā)明提供的方法生產(chǎn)的TrkAIg2noHis的生物活性用PC12細(xì)胞神經(jīng)突生長(zhǎng)生物測(cè)定方法檢測(cè)。PC12細(xì)胞用完全DMEM培養(yǎng)液(含100單位/毫升青霉素，100μg/ml鏈霉素，10％馬血清，10％胎牛血清(FCS)和2mM谷氨酸)稀釋，以每孔2×104個(gè)細(xì)胞加到膠原蛋白包被的24孔板上，加入NGF，濃度為1ng/ml，并分別加入不同濃度的TrkAIg2noHis。
經(jīng)SuperDex 200柱重折疊得到TrkAIg2noHis的生物活性試驗(yàn)結(jié)果如圖20所示。照片顯示48小時(shí)后神經(jīng)突的生長(zhǎng)情況。細(xì)胞需先固定。圖20A為加入1ng/ml NGF時(shí)的神經(jīng)突生長(zhǎng)；圖20B顯示未加NGF時(shí)無(wú)神經(jīng)突生長(zhǎng)；圖20C顯示當(dāng)加入的2.5μm TrkAIg2noHis時(shí)，神經(jīng)突生長(zhǎng)減少；圖20D顯示加入4.5μm TrkAIg2noHis后無(wú)神經(jīng)突生長(zhǎng)。
TrkAIg2noHis用SuperDex 75，Sephacryl HR100和SephacrylHR200柱重折疊，可得到相似的結(jié)果。
因此，TrkAIg2noHis能夠抑制PC12細(xì)胞在NGF刺激下的神經(jīng)突的生長(zhǎng)。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)酪氨酸激酶受體相關(guān)多肽的方法，該方法包括在重組表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)酪氨酸激酶受體相關(guān)多肽和通過(guò)分離步驟將酪氨酸激酶受體相關(guān)多肽表達(dá)產(chǎn)物的單體從多聚體形式中分離出來(lái)，在這個(gè)分離步驟中，酪氨酸激酶受體相關(guān)多肽表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)重折疊形成具有生物活性的形式。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的酪氨酸激酶受體是天然的TrkA，TrkB或TrkC，或這些受體的生物活性同源物，變體，片段或是含有其同源物，變體或片段的結(jié)構(gòu)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的酪氨酸激酶受體的片段或含有這種片段的結(jié)構(gòu)被表達(dá)，該片段分別選自TrkA，TrkB或TrkC受體的Ig2結(jié)構(gòu)域。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的多肽選自TrkAIg2，TrkAIg2.6，TrkBIg2和TrkCIg2。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的多肽是TrkAIg2或TrkAIg2.6。
6.如權(quán)利要求1，2，3，4或5所述的方法，其中所述的多肽被表達(dá)時(shí)帶有組氨酸標(biāo)記序列。
7.如權(quán)利要求1到5的任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的多肽被表達(dá)時(shí)不帶有組氨酸標(biāo)記序列。
8.如權(quán)利要求1到7的任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的酪氨酸激酶序列是人源的。
9.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的酪氨酸激酶受體相關(guān)多肽以不可溶的形式被表達(dá)。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的酪氨酸激酶受體相關(guān)多肽在細(xì)菌包涵體中被表達(dá)。
11.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的多聚體包括二聚體。
12.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的多肽能夠以高親和力與其相應(yīng)的天然酪氨酸激酶受體的配體結(jié)合。
13.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的分離步驟包括凝膠過(guò)濾。
14.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的分離步驟采用的鹽濃度在0mM和500mM之間，包括0mM和500mM。
15.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的分離步驟采用的鹽濃度高于25mM低于200mM。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的分離步驟采用的鹽濃度約為100mM。
17.如權(quán)利要求13到16的任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的凝膠過(guò)濾步驟使用的凝膠能夠分離分子量約為12-40KDa的分子。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的凝膠是Sephadex 200或SuperDex 200。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的凝膠是SuperDex200。
20.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的分離步驟采用的pH在8-9之間。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的分離步驟采用的pH約為8.5。
22.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的多肽在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)。
23.一種純化從細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)的包涵體中得到的重組TrkAIg2或TrkAIg2.6的方法，其中所述的TrkAIg2或TrkAIg2.6的單體通過(guò)一個(gè)凝膠過(guò)濾步驟從TrkAIg2或TrkAIg2.6的單體和多聚體的混合物中分離出來(lái)，并重折疊成活性形式。
24.一種純化從細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)的包涵體中得到的重組TrkBIg2的方法，其中所述的TrkBIg2單體通過(guò)一個(gè)凝膠過(guò)濾步驟從TrkBIg2的單體和多聚體的混合物中分離出來(lái)，并重折疊成活性形式。
25.一種純化從細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)的包涵體中得到的重組TrkCIg2的方法，其中所述的TrkCIg2單體通過(guò)一個(gè)凝膠過(guò)濾步驟從TrkCIg2的單體和多聚體的混合物中分離出來(lái)，并重折疊成活性形式。
26.一種通過(guò)如權(quán)利要求3到23的任一權(quán)利要求所述的方法獲得的TrkAIg2制品，含有TrkAIg2的二聚體或二聚體聚集物的量小于20％。
27.如權(quán)利要求26所述的TrkAIg2制品，含有TrkAIg2的二聚體或二聚體聚集物的量小于10％。
28.如權(quán)利要求27所述的TrkAIg2制品，含有TrkAIg2的二聚體或二聚體聚集物的量小于1％。
29.如權(quán)利要求28所述的TrkAIg2制品，含有TrkAIg2的二聚體或二聚體聚集物的量小于0.1％。
30.一種通過(guò)如權(quán)利要求3到23的任一權(quán)利要求所述的方法獲得的TrkAIg2制品，含有TrkAIg2單體的量大于80％。
31.一種通過(guò)如權(quán)利要求3到23的任一權(quán)利要求所述的方法獲得的TrkAIg2制品，含有TrkAIg2的單體的量大于90％。
32.一種通過(guò)如權(quán)利要求3到23的任一權(quán)利要求所述的方法獲得的TrkAIg2制品，含有TrkAIg2的單體的量大于99％。
33.一種通過(guò)如權(quán)利要求3到23的任一權(quán)利要求所述的方法獲得的TrkAIg2制品，含有TrkAIg2的單體的量為100％。
34.一種通過(guò)如權(quán)利要求3到23的任一權(quán)利要求所述的方法獲得的TrkAIg2.6制品，含有TrkAIg2.6的二聚體或二聚體聚集物的量小于20％。
35.如權(quán)利要求34所述的TrkAIg2.6制品，含有TrkAIg2.6的二聚體或二聚體聚集物的量小于10％。
36.如權(quán)利要求35所述的TrkAIg2.6制品，含有TrkAIg2.6的二聚體或二聚體聚集物的量小于1％。
37.如權(quán)利要求36所述的TrkAIg2.6制品，含有TrkAIg2.6的二聚體或二聚體聚集物的量小于0.1％。
38.一種通過(guò)如權(quán)利要求4到23的任一權(quán)利要求所述的方法獲得的TrkAIg2.6制品，含有TrkAIg2.6單體的量大于80％。
39.一種通過(guò)如權(quán)利要求4到23的任一權(quán)利要求所述的方法獲得的TrkAIg2.6制品，含有TrkAIg2.6單體的量大于90％。
40.一種通過(guò)如權(quán)利要求4到23的任一權(quán)利要求所述的方法獲得的TrkAIg2.6制品，含有TrkAIg2.6單體的量大于99％。
41.一種通過(guò)如權(quán)利要求4到23的任一權(quán)利要求所述的方法獲得的TrkAIg2.6制品，含有TrkAIg2.6單體的量為100％。
42.一種通過(guò)如權(quán)利要求3，4，6到22，24的任一權(quán)利要求所述的方法獲得的TrkBIg2制品，含有TrkBIg2的二聚體或二聚體聚集物的量小于20％。
43.如權(quán)利要求42所述的TrkBIg2制品，含有TrkBIg2的二聚體或二聚體聚集物的量小于10％。
44.如權(quán)利要求43所述的TrkBIg2制品，含有TrkBIg2的二聚體或二聚體聚集物的量小于1％。
45.如權(quán)利要求44所述的TrkBIg2制品，含有TrkBIg2的二聚體或二聚體聚集物的量小于0.1％。
46.一種通過(guò)如權(quán)利要求3，4，6到22，24的任一權(quán)利要求所述的方法獲得的TrkBIg2制品，含有TrkBIg2單體的量大于80％。
47.一種通過(guò)如權(quán)利要求3，4，6到22，24的任一權(quán)利要求所述的方法獲得的TrkBIg2制品，含有TrkBIg2單體的量大于90％。
48.一種通過(guò)如權(quán)利要求3，4，6到22，24的任一權(quán)利要求所述的方法獲得的TrkBIg2制品，含有TrkBIg2單體的量大于99％。
49.一種通過(guò)如權(quán)利要求3，4，6到22，24的任一權(quán)利要求所述的方法獲得的TrkBIg2制品，含有TrkBIg2單體的量為100％。
50.一種通過(guò)如權(quán)利要求3，4，6到22，25的任一權(quán)利要求所述的方法獲得的TrkCIg2制品，含有TrkCIg2的二聚體或二聚體聚集物的量小于20％。
51.如權(quán)利要求50所述的TrkCIg2制品，含有TrkCIg2的二聚體或二聚體聚集物的量小于10％。
52.如權(quán)利要求51所述的TrkCIg2制品，含有TrkCIg2的二聚體或二聚體聚集物的量小于1％。
53.如權(quán)利要求52所述的TrkCIg2制品，含有TrkCIg2的二聚體或二聚體聚集物的量小于0.1％。
54.一種通過(guò)如權(quán)利要求3，4，6到22，25的任一權(quán)利要求所述的方法獲得的TrkCIg2制品，含有TrkCIg2單體的量大于80％。
55.一種通過(guò)如權(quán)利要求3，4，6到22，25的任一權(quán)利要求所述的方法獲得的TrkCIg2制品，含有TrkCIg2單體的量大于90％。
56.一種通過(guò)如權(quán)利要求3，4，6到22，25的任一權(quán)利要求所述的方法獲得的TrkCIg2制品，含有TrkCIg2單體的量大于99％。
57.一種通過(guò)如權(quán)利要求3，4，6到22，25的任一權(quán)利要求所述的方法獲得的TrkCIg2制品，含有TrkCIg2單體的量為100％。
全文摘要
本發(fā)明關(guān)于一種純化方法，尤其適用于純化酪氨酸激酶受體相關(guān)多肽，和用這一方法得到的產(chǎn)物。此方法包括一種生產(chǎn)酪氨酸激酶受體相關(guān)多肽的方法，這個(gè)生產(chǎn)方法包括在一個(gè)重組表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)酪氨酸激酶受體相關(guān)多肽和一個(gè)分離步驟，在這個(gè)分離步驟中，表達(dá)的酪氨酸激酶受體相關(guān)多肽的單體從表達(dá)的多肽的多聚體形式中分離出來(lái)，并重折疊形成具有生物活性的形式。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1564827SQ02819655
公開(kāi)日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2002年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月17日
發(fā)明者戴維·達(dá)伍巴恩, 希莉簡(jiǎn)·艾倫, 艾倫喬治西姆普松·羅伯特松 申請(qǐng)人:布里斯托爾大學(xué)