專利名稱：利用遺傳工程的中尺度病毒對雜合材料進行納米級的排序的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及能夠與無機材料結(jié)合的有機物，尤其涉及能夠與半導體材料結(jié)合并形成整齊排序結(jié)構(gòu)的噬菌體。
背景技術(shù)：
本主題申請的研究部分由National Science Foundation基金支持，政府享有某些權(quán)力。
在生物學系統(tǒng)中，有機分子對諸如碳酸鈣和硅石等無機材料的晶核形成以及礦石相位具有顯著的控制作用，同時對生物功能所需的復雜結(jié)構(gòu)中模塊的組裝也具有顯著的作用。
生物方法制備出的材料通常很柔軟，由分子模塊(即，脂類、肽類、以及核酸)的非常簡單的集合構(gòu)成，而這些分子模塊卻具有非常復雜的排列結(jié)構(gòu)。半導體工業(yè)需要依靠一系列光刻技術(shù)處理步驟從而在集成電路上構(gòu)建最小的部件，而與此很不相同的是，活性生物體大部分情況下利用同時在許多分子成分上起作用的非共價力來實現(xiàn)其結(jié)構(gòu)。而且，這些結(jié)構(gòu)通常能夠在兩個或多個可用構(gòu)型之間進行精細的重排，而不改變?nèi)魏畏肿咏M成。
利用“生物”材料處理下一代微電子設備為解決傳統(tǒng)的處理方法中所存在的問題提供了一種可能的解決方案。該處理方法中的關(guān)鍵性因素是確定生物--無機材料合適的兼容性以及結(jié)合性，以及恰當?shù)哪K的合成。
本發(fā)明概述本發(fā)明人設計了結(jié)構(gòu)成分，并制備了生物材料，該生物材料能夠介導并控制無機材料的裝配從而形成受控的復雜結(jié)構(gòu)。利用生物材料來制備和設計具有所需要的電學或光學特性的材料，這種應用可用于減小部件的尺寸并用來增加對材料的諸如光-電特性的控制。半導體材料通常是由硫化鋅、砷化鎵、磷酸銦、硫化鎘、砷化鋁、銻化鋁(aluminum stibinide)以及硅來制備的。這些半導體材料通常被歸為族II-族V以及族II-族VI的半導體材料。
有機-無機雜合材料為新材料以及裝置提供了一種新的途徑。本發(fā)明人使用有機-無機雜合來選擇能夠與半導體材料結(jié)合的肽類。尺寸控制的納米結(jié)構(gòu)為半導體材料提供了可調(diào)節(jié)的光學和電學特性。在本發(fā)明中，有機加成材料被用來對半導體材料的無機形態(tài)、相位、以及晶核形成方向等進行修飾。生物材料的單分散特性使得該系統(tǒng)對高度有序的近晶排列結(jié)構(gòu)具有兼容性。
在納米級上構(gòu)建整齊排序且良好控制的二維和三維結(jié)構(gòu)是構(gòu)建下一代的光、電、磁學材料及裝置的主要目標。許多研究人員都主要利用傳統(tǒng)的材料制備途徑來構(gòu)建這種結(jié)構(gòu)。如本文所公開，本發(fā)明人證實了柔軟的材料可作為自組織者，在納米水平上對無機材料進行組織。Alivisators和Mirkin利用DNA識別連接子來形成特異的納米粒子組合結(jié)構(gòu)。Stupp和Coworkers在溶致液晶介質(zhì)中使ZnS和CdS成核來制備納米導線和納米結(jié)構(gòu)。然而，上述兩種方法在長度尺度上都很受限，并僅能提供限定種類的用來起作用的無機材料。因此，需要提供在納米級水平制備良好排序結(jié)構(gòu)的其它方法。
本發(fā)明是基于下述認識具有各相異性形狀的單分散性生物材料可以作為構(gòu)建良好排序結(jié)構(gòu)的手段。本發(fā)明包括使用生物選擇性和自裝配來構(gòu)建具有良好排序的納米顆粒層的方法。納米顆粒層可由諸如CdS，F(xiàn)eS，和ZnS等族II-VI的半導體材料構(gòu)成。
本發(fā)明的一種形式是使用諸如噬菌體等自裝配生物分子的方法，所述的生物分子通過遺傳工程與半導體材料相結(jié)合從而組織成良好的排序結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)可以是諸如納米顆粒的納米級排列。以噬菌體為例，可對自裝配的生物材料進行選擇，使之對特定半導體表面具有特異性的結(jié)合性質(zhì)。因此，修飾的噬菌體以及本文所述的方法可用于構(gòu)建選定材料的良好排序的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的另一種形式是構(gòu)建具有特定排序特性的納米顆粒的方法。該方法可采用諸如下述步驟來實現(xiàn)構(gòu)建具有特定結(jié)合特性的諸如M13噬菌體，利用聚合酶鏈式反應將噬菌體擴增至高濃度，然后對菌體進行重懸。
也可用同樣的方法構(gòu)建具有三種液晶相(liquid crystalline phases)的噬菌體，一種是在向列相(nemetic phase)的定向排列，一種在膽固醇液晶相的扭曲向列相結(jié)構(gòu)(twisted nemetic structure)，以及在近晶相定向和定位排列。本發(fā)明的一種技術(shù)方案涉及制備聚合物的方法，如薄膜，該方法包括下述步驟將自裝配的生物分子擴增至高濃度，其中所述的生物分子包含與特定半導體表面結(jié)合的部分，然后將一種或多種半導體材料前體與自裝配的生物分子相接觸，從而形成晶體，或者介導晶體的形成。
本發(fā)明的又一種技術(shù)方案是構(gòu)建具有不同的膽固醇節(jié)距(cholestericpitches)的納米顆粒的方法，該方法使用諸如M13噬菌體與半導體表面結(jié)合，并將菌體重懸至多種不同的濃度。本發(fā)明的再一種形式是利用排序的納米顆粒制備鑄型薄膜的方法，該方法使用諸如遺傳工程的M13噬菌體并將噬菌體重懸。
附圖簡要說明為了更完整地理解本發(fā)明的特征以及優(yōu)點，現(xiàn)并結(jié)合附圖對本發(fā)明進行詳細描述，其中不同附圖中的相應的數(shù)字代表相應的部分，其中

圖1描述了本發(fā)明的選擇性隨機氨基酸序列(selected random amino acidsequences)；圖2描述了本發(fā)明的XPS結(jié)構(gòu)光譜；圖3描述了本發(fā)明的噬菌體識別異質(zhì)結(jié)構(gòu)；圖4-8描述了本發(fā)明的特定氨基酸序列；圖9(a)和9(b)描述了本發(fā)明的M13菌體的近晶排列示意圖；圖10(a)-10(f)是A7-ZnS懸液的圖像(a)和(b)POM圖像，(c)AFM圖像，(d)SEM圖像，(e)TEM圖像，以及(f)TEM圖像(具有電子衍射嵌入)；以及圖11(a)-11(f)是M13噬菌體納米顆粒生物薄膜的圖像(a)薄膜照片，(b)薄膜結(jié)構(gòu)的示意圖，(c)AFM圖像，(d)SEM圖像，(e)和(f)沿著x-z和z-y平面的TEM圖像。
本發(fā)明詳細描述盡管本發(fā)明下面將對所使用的實施例進行詳細討論，應當了解本發(fā)明提供了許多使用的發(fā)明觀念，這些觀念可在多種特定環(huán)境下實施。本文所討論的特定實施例僅僅闡述了制造和使用本發(fā)明的特定方式，而并非為了對本發(fā)明做出限制。
本發(fā)明人曾經(jīng)證明肽類能夠與半導體材料結(jié)合。這些肽類被進一步開發(fā)為納米顆粒成核的手段，并介導這些顆粒的自裝配。這類肽的主要特征是它們對具有表面特異性(face specificity)的重要材料的識別及結(jié)合能力、對尺寸受限的晶體半導體材料的成核能力、以及對有核的納米顆粒的結(jié)晶相的控制能力。這類肽還能通過控制肽類的縱橫比(aspect ratio)來控制光學特性。
簡要地，生物系統(tǒng)在非常微小的尺度上裝配及其復雜結(jié)構(gòu)的裝置極大地激發(fā)了發(fā)明人想要找出具有類似作用的非生物系統(tǒng)。能夠發(fā)明出用在令發(fā)明人感興趣的電子或光學特性材料的方法將尤其具有意義，但是天然進化并未選擇出在生物分子和這類材料之間相互作用。
本發(fā)明所基于的認識是，生物系統(tǒng)能夠有效、精確地將納米級的構(gòu)成模塊裝配為具有高度完整性、受控的尺寸以及復合的均一性的具有復雜功能的結(jié)構(gòu)。
一種提供隨機有機聚合物池(random organic polymer pool)的方法是使用噬菌體展示文庫，它是基于與M13大腸桿菌噬菌體的pIII包衣蛋白融合的7至12個氨基酸的隨機肽形成的組合庫，提供了能夠與晶狀半導體結(jié)構(gòu)相互作用的不同的肽類。在噬菌體顆粒一端具有pIII包衣蛋白的5個拷貝，它們在顆粒上為10-16nm。該噬菌體展示方法在多肽--底物相互作用和編碼該相互作用的DNA之間提供了物理連接。本發(fā)明的實施例中，有5個不同的單晶半導體GaAs(100)，GaAs(111)A，GaAs(111)B，InP(100)和Si(100)。這些底物能夠?qū)﹄念?-底物相互反應進行系統(tǒng)評價，并確認本發(fā)明方法在不同晶型結(jié)構(gòu)上的一般用途。
將與特定晶體成功結(jié)合的蛋白序列從晶體表面洗脫下來，擴增諸如百萬倍，在更嚴格的條件下與底物反應。將這一過程重復5次，在庫中選擇具有最特異結(jié)合的噬菌體。在經(jīng)過例如第三、第四和第五次噬菌體選擇后，分離出晶體特異性的菌體，并對其DNA進行測序。鑒別對晶體組合物具有選擇性的肽類結(jié)合(例如，與GaAs結(jié)合而不與Si結(jié)合)以及對晶面具有選擇性的肽類結(jié)合(例如，與(100)GaAs結(jié)合，而不與(111)B GaAs結(jié)合)。
分析選自GaAs(100)的20個克隆，以確定針對GaAs晶面的表位結(jié)合域。圖1所示為修飾的pIII或pVIII蛋白的部分肽序列，顯示了與GaAs接觸的肽中的類似氨基酸序列。隨著與GaAs晶面接觸的數(shù)量的增加，無電荷極性的和路易斯堿的官能團也增加。三個、四個和五個循環(huán)的噬菌體克隆序列分別平均包含30％、40％、和44％的極性官能團，而路易斯堿官能團的部分同時從41％增加至48％～55％。路易斯堿中觀察到的增加僅占本發(fā)明文庫的隨機12-mer肽的官能團的34％，這說明肽上的路易斯堿和GaAs晶面的路易斯酸位點之間的相互反應可以介導由這些克隆提供的選擇性結(jié)合。
選自文庫中修飾的12-mers的預期結(jié)構(gòu)可以為伸展的構(gòu)象，這應該對小肽類更合適，該構(gòu)象使得肽比GaAs晶胞(5.65A°)更長。因此，在肽類對GaAs晶體的識別中，僅需要很小的結(jié)合域。這些短肽結(jié)構(gòu)域，如圖1所示，除了包含諸如天冬酰氨和谷氨酸鹽等胺類路易斯堿(amine Lewis bases)外，還包含富含絲氨酸和蘇氨酸的區(qū)域。為了確定精確的結(jié)合序列，已經(jīng)用更短的文庫對晶面進行篩選，該文庫包括7-mer和二硫化限定的7-mer。使用這些更短的文庫能減小結(jié)合域的大小和柔性，能夠允許更少的肽-晶面相互作用，使得在所選的代之間的相互作用力產(chǎn)生預期的增加。
采用20-nm膠體金粒子標記的噬菌體用于定量檢測特異性結(jié)合，其中的膠體金粒子用抗生物素蛋白鏈菌素(streptavidin)標記，并通過M13包衣蛋白的生物素化的(biotinylated)抗體與菌體結(jié)合。進行X-射線光電子分光光譜(XPS)化學成分分析，通過金4f-電子信號強度監(jiān)測噬菌體與底物之間的相互作用(圖2a-c)。在G1-3噬菌體不存在的情況下，抗體和金-抗生物素蛋白鏈菌素(gold-streptavidin)不與GaAs(100)底物結(jié)合。因此，該金-抗生物素蛋白鏈菌素的結(jié)合對噬菌體具有特異性，并且還是噬菌體與底物結(jié)合的指示劑。利用XPS還發(fā)現(xiàn)從GaAs(100)分離的G1-3克隆與GaAs(100)而非Si(100)特異性結(jié)合(參考圖2a)。在互補模式下，針對(100)Si晶面篩選的S1克隆幾乎不與(100)GaAs晶面結(jié)合。
一些GaAs克隆也與另一種閃鋅礦結(jié)構(gòu)--InP(100)的晶面結(jié)合。選擇性結(jié)合的基礎是化學的、結(jié)構(gòu)的還是電子的結(jié)合仍處于研究之中。此外，底物表面的天然氧化物的存在能夠改變肽結(jié)合的選擇性。
已經(jīng)證實了在GaAs的(111)A(鎵末端，gallium terminated)或者(111)B(砷末端，arsenic terminated)的晶面上，G1-3克隆與GaAs(100)優(yōu)先結(jié)合(圖2b，c)。在(100)晶面的G13克隆的表面濃度要比在富含鎵的(111)A或者富含砷的(111)B晶面的濃度高，其中(100)晶面用于選擇。已知這些不同的晶面表現(xiàn)出不同的化學反應性，因此噬菌體與多種晶面的結(jié)合具有選擇性也就不足為奇了。盡管兩個111晶面的大末端(bulk termination)具有相同的幾何結(jié)構(gòu)，當對表面改造進行比較時，在表面雙分子層具有Ga或As原子外層之間的差別是很明顯的。還認為多種GaAs晶面的氧化組合物也是不同的，這反過來會影響肽結(jié)合的特性。
針對底物結(jié)合能的Ga 2p電子強度如2c所示，其中該底物與G1-3噬菌體克隆相接觸。如圖2b結(jié)果所預測，在GaAs(100)，(111)A和(111)B的晶面觀察到的Ga 2p強度與金濃度呈反比。在具有更高的金--抗生物素蛋白鏈菌素濃度的晶面上Ga 2p強度的降低是由于菌體在晶面覆蓋的增加造成的。XPS是一種表面技術(shù)，其取樣深度約為30埃；因此，由于有機層厚度的增加，使得來自無機底物的信號降低。利用該觀測可以確定，金--抗生物素蛋白鏈菌素的強度實際上是由于GaAs晶面上存在包含晶體特異性結(jié)合序列的噬菌體。進行了與XPS數(shù)據(jù)相關(guān)的結(jié)合研究，其中將等量的特異性噬菌體克隆與具有相同晶面面積的不同半導體底物相接觸。野生型的克隆(沒有隨機的肽插入)不與GaAs結(jié)合(未檢測到菌斑)。對于G1-3克隆來說，從GaAs(100)表面洗脫的噬菌體群要比從GaAs(111)A表面洗脫下的數(shù)高12倍。
利用原子力顯微鏡(AFM)對結(jié)合到GaAs(100)和InP(100)上的G1-3，G12-3和G7-4進行成像。盡管In-P結(jié)合比GaAs結(jié)合具有更大的離子特性，但InP晶體具有與GaAs晶體同構(gòu)的閃鋅礦結(jié)構(gòu)。通過AFM觀測到的10-nm寬、900-nm長的噬菌體與通過透射電鏡(TEM)觀測到的M13噬菌體的尺寸相匹配，并觀察到與M13抗體結(jié)合的金球與噬菌體結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。InP晶面具有高濃度的噬菌體。這些數(shù)據(jù)表明許多因素影響底物的識別，包括原子尺寸、電荷、極性以及晶體結(jié)構(gòu)等。
在TEM圖像中觀察到G1-3克隆(負染)與GaAs晶片結(jié)合(未顯示)。數(shù)據(jù)證實了該結(jié)合通過G1-3的修飾的pIII蛋白來介導，而不是通過與主要的包衣蛋白的非特異性相互作用介導。因此，本發(fā)明的肽可在裝配納米結(jié)構(gòu)和異質(zhì)結(jié)構(gòu)中用來介導特定的肽-半導體的相互作用(圖4e)。
用X-射線熒光顯微鏡來證明噬菌體與閃鋅礦晶面的優(yōu)選接觸，其中閃鋅礦晶面與不同的化學和結(jié)構(gòu)組合物的表面密切接觸。巢狀的方塊形(anested square pattern)被蝕刻成一GaAs晶片；該模塊包含GaAs的1-μm線條，在每一線條之間有4μm的SiO2間隙(圖3a，3b)。G12-3克隆與GaAs/SiO2形的底物相接觸，洗滌以減少非特異性結(jié)合，用免疫熒光探針四甲基羅丹明(TMR)標記。發(fā)現(xiàn)標記的菌體為三條紅線以及中央的圓點，相應于圖3b中僅與GaAs結(jié)合的G12-3。該模塊中SiO2區(qū)域未與噬菌體結(jié)合，為暗色區(qū)域。在未與菌體接觸、但與一抗和TMR接觸的對照組中沒有觀察到該結(jié)果(圖3a)。利用未與菌體結(jié)合的G12-3肽得到相同的結(jié)果。
觀察到GaAs克隆G12-3在AlGaAs上對GaAs具有底物特異性(圖3c)。AlAs和GaAs在室溫下具有基本相同的晶格屬性(lattice constraints)，分別為5.66A°和5.65A°，因此AlxGal-xAs的三重合金能夠在GaAs底物上取向附生生長。GaAs和AlGaAs具有閃鋅礦晶體結(jié)構(gòu)，但是G12-3克隆僅對GaAs表現(xiàn)出結(jié)合特異性。采用包含GaAs和Al0.98Ga0.02As的交互層的多層底物。將底物材料進行裂解并隨后與G12-3克隆相互反應。
G12-3克隆采用20-nm的金--抗生物素蛋白鏈菌素納米顆粒進行標記。掃描電鏡(SEM)的結(jié)果顯示異質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)GaAs和Al0.98Ga0.02As的交互層(圖3c)。采用鎵和鋁的X-射線元素分析來繪制金--抗生物素蛋白鏈菌素顆粒的圖譜，其中該顆粒僅針對異質(zhì)結(jié)構(gòu)的GaAs層，結(jié)果證實了對化學組合物的高水平結(jié)合特異性。在圖3d中，顯示了一種用于半導體異質(zhì)結(jié)構(gòu)的噬菌體鑒別的模型，如熒光和SEM圖像中所見到的(圖3a-c)。
本發(fā)明闡述了采用噬菌體展示文庫來對有機肽序列和無機半導體底物之間的結(jié)合進行鑒別、開發(fā)和放大。對無機晶體的這種肽識別和特異性已經(jīng)延伸至其它底物，包括使用肽文庫的GaN，ZnS，CdS，F(xiàn)e3O4，F(xiàn)e2O3，CdSe，ZnSe以及CaCO3。目前已經(jīng)設計出具有兩個成分識別的二價合成肽類(圖4e)；這類肽具有將納米粒子定位在半導體結(jié)構(gòu)特定位置上的能力。這些有機和無機對能夠為下一代復雜的、綜合性的電子結(jié)構(gòu)加工提供有用的結(jié)構(gòu)模塊。
實施例1肽的構(gòu)建、分離、選擇和定性肽的選擇。將噬菌體展示或肽文庫與半導體或其它晶體在包含0.1％TWEEN-20的Tris-緩沖鹽水(TBS)中相接觸，以降低晶面上菌體-菌體之間的相互作用。在室溫下?lián)u動1小時后，用pH7.5的Tris-緩沖鹽水接觸10次來洗滌晶面，該緩沖鹽水中TWEEN-20的濃度從0.1％增加至0.5％(v/v)。噬菌體通過加入甘氨酸-HCl(pH2.2)10分鐘而從晶面上洗脫下來，轉(zhuǎn)移至一新管中，然后用Tris-HCl(pH9.1)中和。對洗脫下來的噬菌體進行濃度測定，比較結(jié)合能力。
將與底物接觸三個循環(huán)后洗脫的噬菌體與其宿主Escherichia coliER2537混合，并置于LB XGal/IPTG平皿上。由于文庫噬菌體來源于攜帶lacZα基因的M13mp19載體，因此當噬菌體置于包含Xgal(5-溴-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)和IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的介質(zhì)中時噬菌體菌斑顯示為藍色。采用藍色/白色篩選法來選擇具有隨機肽插入的噬菌體菌斑。從平皿上收集菌斑并進行DNA測序。
底物制備。通過X-射線衍射對底物進行定位，采用適當?shù)幕瘜W特異性蝕刻技術(shù)除去天然氧化物。在GaAs和InP晶面上檢驗下述蝕刻在蝕刻時間的1分鐘和10分鐘時NH4OH∶H2O 1∶10，HCl∶H2O 1∶10，H3PO4∶H2O2∶H2O 3∶1∶50。采用HCl∶H2O 1∶10蝕刻1分鐘，然后用去離子水漂洗1分鐘可使GaAs和InP蝕刻晶面具有最佳的元素比例和最少的氧化物形成(使用XPS)。然而，由于在文庫的初始篩選中對GaAs使用了氫氧化銨蝕刻，因此在所有其它GaAs底物實施例中都使用了該蝕刻。Si(100)晶片采用下述方法蝕刻在HF∶H2O 1∶40中蝕刻一分鐘，然后用去離子水漂洗。所有的晶面直接從漂洗液中取出后立刻轉(zhuǎn)入噬菌體文庫中。對照組底物的晶面不與噬菌體接觸，通過AFM和XPS對晶面蝕刻過程的效果以及形態(tài)學進行定性及繪制圖譜。
GaAs和Al0.98Ga0.02As的多重底物通過分子束取向附生(molecular beamepitaxy)在(100)GaAs表面上生長。取向附生生長層為5×1017cm-3水平的摻雜Si-的生長層(Si-doped)(n-型)。
抗體和金標記。在XPS，SEM和AFM的實施例中，底物在Tris緩沖鹽水中與噬菌體接觸1小時，然后轉(zhuǎn)入fd噬菌體pIII蛋白的抗-fd噬菌體-生物素偶聯(lián)物抗體(1∶500于磷酸鹽緩沖液中，Sigma)中30分鐘，然后用磷酸鹽緩沖液漂洗。通過生物素-抗生物素蛋白鏈菌素相互作用，將抗生物素蛋白鏈菌素/20-nm膠體金標記(1∶200于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，Sigma)與生物素偶聯(lián)的噬菌體聯(lián)結(jié)；將晶面與標記接觸30分鐘，然后用PBS漂洗幾次。
X-射線光電子光譜學(XPS)。制備下述對照用于XPS實例，從而確定在XPS所見的金信號是源于與噬菌體結(jié)合的金而不是與GaAs晶面的非特異性抗體的相互反應。將制備的(100)GaAs晶面與下述材料接觸(1)抗體和抗生物素蛋白鏈菌素-金標記，但沒有菌體，(2)G1-3菌體和抗生物素蛋白鏈菌素-金標記，但沒有抗體，以及(3)抗生物素蛋白鏈菌素--金標記，但沒有G1-3菌體或抗體。
所用的XPS儀器為Physical Electronics Phi ESCA 5700，該儀器帶有可產(chǎn)生單頻1,487-eV X射線的鋁陽極。噬菌體用金標記(如上文所述)后，立即將所有樣品轉(zhuǎn)入小室中來降低GaAs晶面的氧化，然后在高度真空下抽吸過夜，從而降低XPS小室中樣品的除氣作用。
原子力顯微鏡(AFM)。所用的AFM為安裝在Zeiss Axiovert 100s-2tv上的Digital Instruments Bioscope，用一個G掃描儀采用針尖掃描模式來運行。在空氣中采用tapping模式輸出圖像。AFM探針是蝕刻的硅，其帶有125-mm支架，在其共振頻率200±400kHZ附近驅(qū)動的彈性常數(shù)為20±100Nm-1。掃描速率為1±5mms-1。利用一級水平面使圖像水平，從而去除樣品的傾斜。
透射電鏡(TEM)。利用Philips EM208在60kV獲得TEM圖像。G1-3噬菌體(在TBS中1∶100稀釋)與GaAs片段(500mm)溫育30分鐘，離心使未結(jié)合的噬菌體與顆粒分離，用TBS漂洗，然后用TBS重懸。樣品用2％乙酸雙氧鈾染色。
掃描電鏡(SEM)。G1-3噬菌體(在TBS中1∶100稀釋)與新鮮裂解的異質(zhì)結(jié)構(gòu)晶面溫育30分鐘，然后用TBS漂洗。G12-3噬菌體用20-nm膠體金標記。在5kV下利用Hitachi 4700型場發(fā)射式掃描電鏡的Norian檢測系統(tǒng)收集SEM和元素繪制圖像。
實施例II生物膜本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有機-無機雜合材料能為新材料和裝置提供新的途徑。尺寸受控的納米結(jié)構(gòu)能為半導體材料提供光學和電學可調(diào)控的性質(zhì)，并且有機加成物能對無機物的形態(tài)、相位以及晶核形成定向等進行修飾。生物材料的單分散性質(zhì)使得該系統(tǒng)對高度有序的近晶排列結(jié)構(gòu)具有兼容性。采用本發(fā)明的方法，利用遺傳工程技術(shù)、自裝配、以及生物分子如對特定半導體晶面具有識別域(moiety)的M13噬菌體，創(chuàng)建了高度有序納米級的以及多長度尺度排列的II-VI族半導體材料。
采用本發(fā)明的組合物和方法，使用本文所述的識別和自排序系統(tǒng)可完成納米級的和多長度尺度排列的半導體材料。半導體材料的識別和自排序可用來提高電子設備的微加工，這種方法在性能上超過了目前使用的光蝕刻法。這類材料的應用包括光電子設備，例如光發(fā)射顯示裝置、光學檢測器以及激光；快速相互連接器(fast interconnects)；以及納米級的計算機組件和生物傳感器。本發(fā)明所創(chuàng)建的生物膜的其它應用包括整齊排序的液晶顯示材料以及有機-無機顯示技術(shù)。
薄膜、光纖以及其它結(jié)構(gòu)甚至還可包括用于檢測包括生物毒素在內(nèi)的小分子的高密度傳感器。其它應用包括光學涂層以及光學開關(guān)。還可利用本文所公開的一種或多種材料，用在醫(yī)用移植物的支架或甚至骨移植物上，這可以通過本領域技術(shù)人員公知的技術(shù)利用單層或多層或甚至以所述的任意的條紋或組合來進行構(gòu)建。本發(fā)明的其它應用包括電和磁界面，或甚至用在高密度存儲，如用于量子計算機的3D電子納米結(jié)構(gòu)的組成中。作為選擇地，可采用本發(fā)明的薄膜或者基質(zhì)來構(gòu)建在藥物應用中的高密度和穩(wěn)定存儲的病毒，例如具有生物兼容性的疫苗、以及佐劑和疫苗包含物等?；诹孔狱c模式的信息存儲可用于鑒別，例如在裝甲或編碼的織物中對防御助手或敵人進行鑒別。本發(fā)明的納米光纖甚至還可用作對貨幣進行編碼和鑒別。
開發(fā)下一代的光學、電子和磁力材料和設備的主要目標是在納米級范圍開發(fā)具有良好排序、可良好控制的二維和三維結(jié)構(gòu)。目前制備特異性納米顆粒的方法在長度和材料類型上都受到限制。本發(fā)明利用具有自組裝性質(zhì)的有機或生物分子或顆粒，諸如M13噬菌體來擴大納米顆粒的排列、尺度和等級，并且擴大可使用半導體材料的范圍。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有各相異性形狀的單分散型生物材料可作為構(gòu)建整齊排序結(jié)構(gòu)的替代途徑。納米級的和多長度尺度排列的II-VI族半導體材料是使用遺傳工程的M13噬菌體來獲得到，該菌體具有一針對特定半導體晶面的識別域(一肽類或氨基酸低聚體)。
Seth及其同事已經(jīng)對具有位置和方向順序的Fd病毒近晶排序結(jié)構(gòu)進行了鑒別。Fd病毒的近晶結(jié)構(gòu)可用在多尺度和納米尺度排序的結(jié)構(gòu)上，從而構(gòu)建2維和3維排序的納米顆粒。使用噬菌體M13是由于它能通過遺傳修飾，已經(jīng)成功選擇出了與Fd病毒具有相同形狀，并且對II-VI族半導體晶面具有特異性結(jié)合親和力的噬菌體M13。因此，M13是近晶結(jié)構(gòu)的一種理想來源，它能用于納米顆粒的多尺度和納米尺度的排序。
本發(fā)明人使用組合篩選方法來發(fā)現(xiàn)M13噬菌體，該噬菌體含有能與半導體晶面結(jié)合的肽插入片段。這些半導體晶面包括諸如硫化鋅、硫化鈣和硫化鐵等材料。采用分子生物學技術(shù)，將能夠與半導體材料和材料晶面特異性結(jié)合的噬菌體組合庫克隆進行克隆，并擴增至能使液晶生成的足夠高的濃度。
纖維狀的噬菌體Fd為長桿狀(長880nm；直徑6.6nm)，具有單分散性分子量(分子量1.64×107)。這些性質(zhì)使得在高濃度溶液下噬菌體具有溶致液晶行為。通過生物選擇性和自裝配性，利用噬菌體形狀的各向異性作為構(gòu)建整齊排序的納米顆粒層的方法。通過常規(guī)的擴增方法來制備單分散性的噬菌體。在本發(fā)明中，對類似纖維狀噬菌體M13進行遺傳修飾，使之與諸如硫化鋅、硫化鈣和硫化鐵等納米顆粒相結(jié)合。
已經(jīng)證實中尺度排列的噬菌體可形成納米顆粒的納米級排列。這些納米顆?？蛇M一步被組織成微米結(jié)構(gòu)域以及厘米級尺度。半導體納米顆粒顯示出量子阱效應，并能夠在液晶內(nèi)合成和排序。
制備含有特定肽插入物的噬菌體M13混懸液，并使用原子力顯微鏡(ATM)、透射電鏡(TEM)和掃描電鏡(SEM)其進行定性分析。樣品中觀察到均一的2D和3D排序的納米顆粒。
原子力顯微鏡(ATM)。所用的ATM是裝在Zeiss Axiovert 100s-2tv上的Digital Instruments Bioscope，利用G型掃描儀采用針尖掃描模式進行操作。利用tapping模式輸出圖像。AFM探針為蝕刻的硅，其帶有125-mm支架，在其共振頻率200±400kHZ附近驅(qū)動的彈性常數(shù)為20±100Nm-1。掃描速率為1±5mms-1。利用一級水平面使圖像水平，從而去除樣品的傾斜。圖9(a)和9(b)為采用AFM觀察到的M13菌體的近晶排序的示意圖(未顯示數(shù)據(jù))。
透射電鏡(TEM)。利用Philips EM208在60kV獲取TEM圖像。G1-3菌體(用TBS 1∶100稀釋)與半導體材料溫育30分鐘，離心使未結(jié)合的噬菌體與顆粒分離，用TBS漂洗，然后用TBS重懸。樣品用2％乙酸雙氧鈾染色。
掃描電鏡(SEM)。菌體(用TBS 1∶100稀釋)與新鮮裂解的異質(zhì)結(jié)構(gòu)晶面溫育30分鐘，然后用TBS漂洗。G12-3菌體用20-nm膠體金標記。在5kV下使用裝在Hitachi 4700型場發(fā)射式掃描式電鏡上的Norian檢測系統(tǒng)收集SEM和元素繪制圖像。
采用常規(guī)的分子生物學技術(shù)對遺傳工程得到的M13噬菌體進行擴增和純化，其中該噬菌體對半導體晶面具有特異的結(jié)合特性。為了進行大規(guī)模擴增(mass amplification)，在400ml的LB介質(zhì)中加入3.2ml的噬菌體混懸液(濃度～107菌體/μl)和4ml的過夜培養(yǎng)物。擴增后，得到～30mg的沉淀物。在室溫下向攙雜了ZnCl2的A7菌體混懸液中加入Na2S來制備混懸液。在約30mg的菌體沉淀中分別加入20ul的1mM ZnCl2和Na2S溶液來制備最高濃度的A7-菌體混懸液。利用269nm下3.84mg/ml的消光系數(shù)來計算濃度。
由于增加了各向同性混懸液的濃度，因此觀察了具有定向序列的向列相(nemetic phase)、具有扭曲的向列相的膽固醇液晶相、以及具有定向和定位排列的近晶相。在沒有納米顆粒的Fd病毒中已觀察到了這些相位。
偏振光顯微鏡利用偏振光顯微鏡對M13菌體懸液進行定性分析。將每一懸液填充到直徑為0.7mm的玻璃毛細管中。高濃度的懸液(127mg/ml)在平行偏振光下表現(xiàn)出多彩顏色[5]，在垂直偏振光下表現(xiàn)出近晶的質(zhì)地，如圖10(a)所示。膽固醇節(jié)距(cholesteric pitches)，如圖10(b)可通過改變表1所示的懸液濃度來進行控制。測定節(jié)距長，并在樣品制備24小時后拍攝顯微照片。
表1.膽固醇節(jié)距和濃度之間的關(guān)系

原子力顯微鏡(AFM)觀測為進行AFM觀測，取5ul的M13噬菌體懸液的M13懸液(濃度30mg/ml)在8mm×8mm的云母基底上干燥24小時，該云母基底在干燥器中用3-氨基丙基三乙基硅烷進行硅烷化4小時。在空氣中采用tapping模式攝取圖像。由于M13噬菌體為長880nm、寬6.6nm的各向異性形狀，因而觀察到自裝配的序列結(jié)構(gòu)。圖10(c)中M13菌體存在于照片的平面上，形成近晶序列。
掃描電鏡(SEM)觀測為進行SEM觀測，制備干燥噬菌體和ZnS納米顆粒近晶懸液(噬菌體懸液濃度為127mg/ml)樣品的臨界點(critical point)。在圖10(d)中，觀察了富含納米顆粒的區(qū)域和富含噬菌體的區(qū)域。納米顆粒和噬菌體之間的分離長度與噬菌體的長度相關(guān)。用TEM利用近晶懸液的稀釋樣品通過電子衍射圖證實了ZnS wurzite晶體結(jié)構(gòu)。
生物膜的制備用400ul Tris緩沖鹽水(TBS，pH7.5)和加入了1mMNa2S的200ul的1mM ZnCl2溶液對噬菌體沉淀進行重懸。在室溫下?lián)u動24小時后，將裝在1ml eppendorff管中的懸液在干燥器中緩慢干燥1星期。在管內(nèi)形成了～15um厚的半透膜。用鑷子小心地將該膜收起，如圖11(a)，。
生物膜的SEM觀測利用SEM觀測A7-ZnS膜的納米級的噬菌體排列。為了進行SEM分析，切割薄膜，然后在氬保護氣氛下用2nm的鉻通過真空沉積來涂層。樣品中觀測到圖11(d)所示的高度堆積結(jié)構(gòu)(highly close-packed structures)。所測得的單個菌體的平均長度895nm與菌體長度880nm合理類似。薄膜表現(xiàn)出與近晶狀A或C樣的類薄層形態(tài)，其在納米顆粒和噬菌體層之間具有周期性。周期的長度與噬菌體的長度相關(guān)。納米顆粒的平均尺寸為～20nm，與單個顆粒的TEM觀測類似。
生物膜的TEM觀測使用TEM研究ZnS納米顆粒的排列。薄膜用環(huán)氧樹脂(LR白)包埋1天，然后加入10ul促凝劑(accelerator)聚合。固化后，樹脂用Leica Ultramicrotome切成薄片。將這些～50nm的切片漂浮于蒸餾水中，然后置于空白金格中。觀察到平行排列的納米顆粒在最低點(low)，與示意圖中x-z平面相對應，如圖11(e)所示。由于每一噬菌體具有5個A7域的拷貝，因此每個A7識別一個納米顆粒(2～3nm尺寸)，排列為大約20nm寬，長度為超過2微米。2微米的顆粒被分成平行排列的20nm的條帶，每個條帶間隔～700nm。據(jù)Marvin小組報道，這種差異是源于在TEM觀測中噬菌體層的傾斜的(tilted)近晶排列。還觀察到了如圖3(f)的y-z軸的納米顆粒層平面。顆粒排列的SAED圖顯示ZnS顆粒具有wurzite六角形結(jié)構(gòu)。
生物膜的AFM觀測使用AFM觀測病毒薄膜的晶面定向。圖11(c)顯示噬菌體形成了平行排列的人字形，在大部分被命名為近晶O的晶面上，在臨近的director normal(噬菌體軸)之間，這些平行排列的人字形幾乎為直角。該薄膜顯示出正常導向(normal director)的長范圍排序，該正常導向具有幾十微米。在兩個結(jié)構(gòu)域?qū)颖舜讼嘤龅囊恍﹨^(qū)域，兩個或三個多重長度尺度的噬菌體平行排列并保持近晶C序列結(jié)構(gòu)。
采用識別和自裝配系統(tǒng)的納米和多長度尺度排列的半導體材料能促進未來的電子設備的微加工。這些設備會具有超越目前的光蝕刻效能的潛力。這些材料的其它潛在的應用包括光電子設備，諸如光發(fā)射顯示裝置，光學檢測器以及激光，快速相互連接器(fast interconnects)，納米級的計算機組件和生物傳感器。
盡管使用多個實施例來詳細討論本發(fā)明，但可以知道，本發(fā)明提供的多種有實際意義的發(fā)明構(gòu)思是不能囿于特定概念所限定的較寬的范圍內(nèi)的。本文所討論的特定實施例僅僅是對制備和使用本發(fā)明進行特別闡述，而非對本發(fā)明的范圍作出限制。
序列表SEQUENCE LISTING<110>得克薩斯州立大學董事會<120>利用遺傳工程的中尺度病毒對雜合材料進行納米級的排序<130>119927-1051<140>10/157,775<141>2002-05-29<150>60/326,583<151>2001-10-02<160>95<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>12<212>PRT<213>artificial sequence<220>
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<223>peptide<400>66Ser Met His Ala Thr Leu Thr Pro Met1 5<210>67<211>9<212>PRT<213>artificial sequence<220>
<223>peptide<400>67Ser Gly Pro Ala His Gly Met Phe Ala1 5<210>68<211>9
<212>PRT<213>artificial sequence<220>
<223>peptide<400>68Ile Ala Asn Arg Pro Tyr Ser Ala Gln1 5<210>69<211>7<212>PRT<213>artificial sequence<220>
<223>peptide<400>69Val Met Thr Gln Pro Thr Arg1 5<210>70<211>7<212>PRT<213>artificial sequence<220>
<223>peptide<400>70His Met Arg Pro Leu Ser Ile1 5<210>71<211>12<212>PRT<213>artificial sequence<220>
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<400>71Leu Thr Arg Ser Pro Leu His Val Asp Gln Arg Arg1 5 10<210>72<211>12<212>PRT<213>artificial sequence<220>
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<223>peptide<400>77Cys Thr Ser Val His Thr Asn Thr Cys1 5<210>78<211>9<212>PRT<213>artificial sequence<220>
<223>peptide<400>78Cys Pro Ser Leu Ala Met Asn Ser Cys1 5<210>79<211>9<212>PRT<213>artificial sequence<220>
<223>peptide<400>79Cys Ser Asn Asn Thr Val His Ala Cys1 5<210>80<211>9<212>PRT<213>artificial sequence<220>
<223>peptide<400>80Cys Leu Pro Ala Gln Gly His Val Cys1 5<210>81<211>9<212>PRT<213>artificial sequence<220>
<223>peptide<400>81Cys Leu Pro Ala Gln Val His Val Cys1 5
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<223>peptide<400>82Cys Pro Pro Lys Asn Val Arg Leu Cys1 5<210>83<211>9<212>PRT<213>artificial sequence<220>
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<220>
<223>peptide<400>85Thr Met Gly Phe Thr Ala Pro Arg Phe Pro His Tyr1 5 10<210>86<211>12<212>PRT<213>artificial sequence<220>
<223>peptide<400>86Ala Thr Gln Ser Tyr Val Arg His Pro Ser Leu Gly1 5 10<210>87<211>12<212>PRT<213>artificial sequence<220>
<223>peptide<400>87Thr Ser Thr Thr Gln Gly Ala Leu Ala Tyr Leu Phe1 5 10<210>88<211>12<212>PRT<213>artificial sequence<220>
<223>peptide<400>88
Asp Pro Pro Trp Ser Ala Ile Val Arg His Arg Asp1 5 10<210>89<211>12<212>PRT<213>artificial sequence<220>
<223>peptide<400>89Phe Asp Asn Lys Pro Phe Leu Arg Val Ala Ser Glu1 5 10<210>90<211>12<212>PRT<213>artificial sequence<220>
<223>peptide<400>90His Gln Ser His Thr Gln Gln Asn Lys Arg His Leu1 5 10<210>91<211>12<212>PRT<213>artificial sequence<220>
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<223>peptide<400>92Lys Thr Pro Ile His Thr Ser Ala Trp Glu Phe Gln1 5 10<210>93<211>12<212>PRT<213>artificial sequence<220>
<223>peptide<400>93Asp Leu Phe His Leu Lys Pro Val Ser Asn Glu Lys1 5 10<210>94<211>12<212>PRT<213>artificial sequence<220>
<223>peptide<400>94Lys Pro Phe Trp Thr Ser Ser Pro Asp Val Met Thr1 5 10<210>95<211>12<212>PRT<213>artificial sequence<220>
<223>peptide
<400>95Pro Trp Ala Ala Thr Ser Lys Pro Pro Tyr Ser Ser1 5 10
權(quán)利要求
1.一種制備薄膜的方法，其包括下述步驟將具有自裝配功能的生物分子擴增至高濃度，該生物分子包含能與特定的半導體晶面結(jié)合的部分；使半導體材料前體與自裝配的生物分子相接觸，從而生成晶體。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的自裝配的生物分子在表面上露出一個或多個氨基酸寡聚體。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中的寡聚體為7到15個氨基酸的長度。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中通過組合文庫篩選來實現(xiàn)自裝配生物分子的選擇。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中的篩選包括將結(jié)合的自裝配生物分子從晶體上洗脫下來的步驟。
6.權(quán)利要求5所述的方法，還進一步包含將洗脫的氨基酸寡聚體與半導體材料相接觸的步驟；以及重復洗脫步驟。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中的結(jié)合和洗脫重復至5次。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中自裝配的生物分子擴增到液晶的濃度。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中的擴增采用聚合酶鏈式反應來完成。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中半導體材料包括族II-IV的半導體材料。
11.一種控制膽固醇節(jié)距的方法，包括下述步驟將自裝配的病毒顆粒擴增至高濃度，其中該病毒顆粒包含能與特定的半導體晶面結(jié)合的部分；使半導體材料前體與自裝配的生物分子相接觸從而生成晶體。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的自裝配的病毒顆粒在表面上露出一個或多個氨基酸寡聚體。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中的寡聚體為7到15個氨基酸的長度。
14.權(quán)利要求12所述的方法，其中通過組合文庫篩選來實現(xiàn)自裝配病毒顆粒的選擇。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中的篩選包括下述步驟將自裝配的病毒顆粒與一個或多個半導體材料的晶體接觸，從而使得一個或多個晶體相結(jié)合，其中所述的病毒顆粒包括氨基酸寡聚體。
16.權(quán)利要求15所述的方法，還進一步包含將洗脫的氨基酸寡聚體與半導體材料相接觸的步驟；以及重復洗脫步驟。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其中的結(jié)合和洗脫重復至5次。
18.權(quán)利要求12所述的方法，其中自裝配的病毒顆粒擴增達到液晶的濃度。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中擴增采用聚合酶鏈式反應來完成。
20.權(quán)利要求12所述的方法，其中半導體材料包括族II-IV的半導體材料。
21.權(quán)利要求12所述的方法，其中該方法用于控制納米顆粒的近晶排列。
22.權(quán)利要求12所述的方法，其中該方法用于使納米顆粒具有向列相。
23.權(quán)利要求12所述的方法，其中該方法用于制備鑄型薄膜。
24.一種權(quán)利要求1的方法制備的薄膜。
25.一種權(quán)利要求11的方法制備的薄膜。
26.一種制備納米顆粒的方法，其包括下述步驟將半導體結(jié)合肽固定到基底上；使一種或多種半導體材料前體與半導體結(jié)合肽相接觸；以及在半導體結(jié)合肽上生成半導體晶體。
27.權(quán)利要求26所述的方法，其中的半導體結(jié)合肽進一步包含嵌合蛋白，該嵌合蛋白的表面上暴露一種或多種氨基酸寡聚體。
28.權(quán)利要求26所述的方法，其中的半導體結(jié)合肽類包含7至15個氨基酸。
29.權(quán)利要求26所述的方法，其進一步包含將半導體晶體從半導體結(jié)合物上洗脫下來的步驟。
30.權(quán)利要求26所述的方法，其中半導體結(jié)合肽采用化學方式與基底連接。
31.權(quán)利要求26所述的方法，其中半導體結(jié)合肽包含具有自裝配病毒顆粒的嵌合蛋白。
32.權(quán)利要求26所述的方法，其中半導體材料包含族II-IV的半導體材料。
33.權(quán)利要求26所述的方法，其中半導體結(jié)合肽控制納米顆粒的近晶排列。
34.權(quán)利要求26所述的方法，其中半導體結(jié)合肽控制納米顆粒的向列相。
35.權(quán)利要求26所述的方法，其中該方法用于制備薄膜。
36.一種權(quán)利要求26的方法制備的聚合體。
全文摘要
本發(fā)明包括制備半導體材料的納米晶體的方法，該半導體材料具有諸如相位和排列等特定的結(jié)晶特性，該方法是采用自裝配的生物分子來實現(xiàn)的，其中該生物分子經(jīng)過修飾而具有能與半導體材料特異性結(jié)合的氨基酸寡聚體。本發(fā)明方法的一種形式是在自裝配的生物分子液晶內(nèi)構(gòu)建有序的納米顆粒。
文檔編號C12N7/00GK1697884SQ02819565
公開日2005年11月16日 申請日期2002年10月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月2日
發(fā)明者安吉拉·M·貝爾徹, 塞昂-伍克·李 申請人:得克薩斯州立大學董事會