專利名稱：Dna芯片的信號(hào)擴(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA芯片的信號(hào)擴(kuò)增方法。更詳細(xì)說(shuō)，涉及利用形成自聚體的一對(duì)寡核苷酸，可以提高作為結(jié)合用于捕捉靶基因的基因的支撐體或基板(以下稱為支撐體)，使用微板型、載玻片型、微粒型、導(dǎo)電性基板型等支撐體的DNA芯片(以下有的總稱為DNA芯片)上的靶基因的檢出靈敏度的基因信號(hào)的擴(kuò)增方法。
現(xiàn)在，此技術(shù)已經(jīng)被用于基因的表達(dá)解析和變異基因等的檢出，不過(guò)，與過(guò)去已經(jīng)使用的Southern標(biāo)繪法(E.M.Southern，Detection of Specificsequences among DNA fragments separated by gel lectrophoresis，J.Mol.Biol.，98，503-517，1975)相比較，存在有檢出靈敏度低，為十分之一，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題。
還有，為了提高靶基因的檢出靈敏度，已經(jīng)有使用耐熱性DNA連接酶來(lái)使DNA擴(kuò)增的LCR法(USP5,792,607)和耐熱性DNA聚合酶來(lái)使DNA擴(kuò)增的PCR法(R.Saiki，S.Scharf，F(xiàn).Faloona，et al.，Enzymatic amplification ofβ-globin genomic sequence and restriction site analysis for diagnosis of sicklecell anemia，Science，230，1350-1354(1985))等基因擴(kuò)增法，盡管有事前把靶基因擴(kuò)增的方法，但是需要復(fù)雜的操作，而且成本也高。
基于上述問(wèn)題，本發(fā)明人等報(bào)道了不使用酶的新型等溫核酸擴(kuò)增法(USP6,261,846；日本專利3267576和EP1,002,877A)。此方法是，使用由3處區(qū)域構(gòu)成的一對(duì)寡核苷酸(蜂窩探針，以下稱為HCP)的方法，第1HCP和第2HCP各自在3處區(qū)域有互為互補(bǔ)的堿基序列，在兩者反應(yīng)的場(chǎng)合，僅在區(qū)域的1處變成雜交樣的堿基序列。由此變化，在使多個(gè)一對(duì)HCP反應(yīng)的場(chǎng)合，相互雜交，可以由HCP的自聚反應(yīng)而形成自聚體(Probealternation link self-assembly reaction)，以下把此由HCP的自聚反應(yīng)形成自聚體的方法稱為PALSAR法)。
本發(fā)明的目的在于確立通過(guò)對(duì)在DNA芯片上捕捉的靶基因有效使用PALSAR法來(lái)使信號(hào)擴(kuò)增、進(jìn)而提供通過(guò)用PALSAR法的一對(duì)HCP的設(shè)計(jì)可以簡(jiǎn)便地檢出的DNA芯片信號(hào)擴(kuò)增方法。
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的DNA芯片信號(hào)擴(kuò)增方法是利用形成寡核苷酸的2條鏈的有規(guī)則的高級(jí)結(jié)構(gòu)自聚體的自聚反應(yīng)來(lái)提高DNA芯片中靶基因的檢出靈敏度的。
作為上述自聚反應(yīng)，可以利用第一，通過(guò)用幾對(duì)具有n(n≥3)處互補(bǔ)部分所構(gòu)成的探針對(duì)的相互交叉雜交來(lái)使寡核苷酸自聚、形成2條鏈自聚體的自聚反應(yīng)。
作為上述自聚反應(yīng)，可以利用第二，含有由把1號(hào)和2號(hào)一對(duì)寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’一側(cè)區(qū)域、中央?yún)^(qū)域和5’一側(cè)區(qū)域3個(gè)區(qū)域，在各寡核苷酸的中央?yún)^(qū)域形成作為互補(bǔ)的堿基序列的二聚體探針的同時(shí)，于3’一側(cè)區(qū)域和5’一側(cè)區(qū)域形成作為不互補(bǔ)的堿基序列的一對(duì)形成二聚體用探針的第1體系和含有多對(duì)由把3號(hào)和4號(hào)一對(duì)寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’一側(cè)區(qū)域和5’一側(cè)區(qū)域2個(gè)區(qū)域且在各寡核苷酸的3’一側(cè)區(qū)域和5’一側(cè)區(qū)域形成作為不互補(bǔ)的堿基序列的一對(duì)交聯(lián)探針的第2體系，且把此交聯(lián)探針作為由形成所述二聚體用探針形成的二聚體交聯(lián)之可能堿基序列，由此探針(把形成二聚體用探針以及此交聯(lián)探針統(tǒng)稱為探針)的雜交來(lái)使寡核苷酸自聚而形成自聚體的自聚反應(yīng)。
上述探針的堿基序列可以用使第1體系的1號(hào)寡核苷酸的3’一側(cè)區(qū)域與第2體系的3號(hào)寡核苷酸的3’一側(cè)區(qū)域、第1體系的2號(hào)寡核苷酸的5’一側(cè)區(qū)域與第2體系的4號(hào)寡核苷酸的5’一側(cè)區(qū)域、第2體系的4號(hào)寡核苷酸的3’一側(cè)區(qū)域與第1體系的2號(hào)寡核苷酸的3’一側(cè)區(qū)域、第2體系的3號(hào)寡核苷酸的5’一側(cè)區(qū)域與第1體系的1號(hào)寡核苷酸的5’一側(cè)區(qū)域各自互補(bǔ)的堿基序列。
還有，上述堿基序列可以用使第1體系的1號(hào)寡核苷酸的3’一側(cè)區(qū)域與第2體系的3號(hào)寡核苷酸的3’一側(cè)區(qū)域、第1體系的2號(hào)寡核苷酸的5’一側(cè)區(qū)域與第2體系的3號(hào)寡核苷酸的5’一側(cè)區(qū)域、第1體系的2號(hào)寡核苷酸的3’一側(cè)區(qū)域與第2體系的4號(hào)寡核苷酸的3’一側(cè)區(qū)域、第1體系的1號(hào)寡核苷酸的5’一側(cè)區(qū)域與第2體系的4號(hào)寡核苷酸的5’一側(cè)區(qū)域各自互補(bǔ)的堿基序列。
上述DNA芯片具有結(jié)合了用于捕捉靶基因的基因的支撐體，作為所述支撐體用微板型、載玻片型、微粒型和導(dǎo)電性基板型支撐體為合適。所述為板型與微粒型支撐體的材質(zhì)可以使用塑料或聚苯乙烯等。還有載玻片型支撐體可以使用玻璃或塑料等素材。導(dǎo)電性基板型支撐體上可以使用金電極或銦錫氧化物(ITO)電極等。
上述靶基因中可以使用單鏈DNA和/或RNA。
上述靶基因中可以使用雙鏈DNA和/或RNA。
上述靶基因中可以使用SNPs(單堿基多態(tài))。
把使用了上述自聚反應(yīng)的寡核苷酸的堿基序列預(yù)先取為與靶基因?yàn)榛パa(bǔ)序列是優(yōu)選的。
為使所述靶基因與所述自聚體結(jié)合，優(yōu)選使用對(duì)于在靶基因的堿基序列與自聚體形成中使用的寡核苷酸的堿基序列具有各自互補(bǔ)區(qū)域的結(jié)合探針。
對(duì)于通過(guò)所述靶基因結(jié)合的寡核苷酸的自聚反應(yīng)形成的自聚體，可以使標(biāo)記探針雜交來(lái)檢出自聚體的存在。
作為標(biāo)記探針可以用以發(fā)色類酶、發(fā)光類酶或用放射性同位素標(biāo)記的標(biāo)記探針。
對(duì)于所述自聚體，加入具有與核酸結(jié)合性質(zhì)的熒光物質(zhì)，通過(guò)此熒光物質(zhì)的光化學(xué)變化來(lái)檢出所述自聚體的存在是可能的。
預(yù)先用熒光物質(zhì)標(biāo)記形成所述自聚體的寡核苷酸，通過(guò)熒光物質(zhì)的光化學(xué)變化來(lái)檢出所述自聚體的存在是可能的。
預(yù)先用放射性同位素標(biāo)記形成所述自聚體的寡核苷酸，通過(guò)放射性同位素來(lái)檢出所述自聚體的存在是可能的。
預(yù)先用發(fā)色類酶或發(fā)光類酶標(biāo)記形成所述自聚體的寡核苷酸，通過(guò)光化學(xué)變化來(lái)檢出所述自聚體的存在是可能的。
所述寡核苷酸是由從DNA、RNA、PNA或LNA中的任一個(gè)選出的堿基所構(gòu)成的。
圖2是表示本發(fā)明的信號(hào)擴(kuò)增方法的工藝順序的第1～第4例中的步驟102的原理模式圖。
圖3是表示本發(fā)明的信號(hào)擴(kuò)增方法的工藝順序的第1例中的步驟110的原理模式圖。
圖4是表示本發(fā)明的信號(hào)擴(kuò)增方法的工藝順序的第1例中的步驟114的原理模式圖。
圖5是表示本發(fā)明的信號(hào)擴(kuò)增方法的工藝順序的第2例中的步驟122的原理模式圖。
圖6是表示本發(fā)明的信號(hào)擴(kuò)增方法的工藝順序的第2例中的步驟124的原理模式圖。
圖7是表示本發(fā)明的信號(hào)擴(kuò)增方法的工藝順序的第3例中的步驟130的原理模式圖。
圖8是表示本發(fā)明的信號(hào)擴(kuò)增方法的工藝順序的第3例中的步驟132的原理模式圖。
圖9是表示本發(fā)明的信號(hào)擴(kuò)增方法的工藝順序的第3例中的步驟134的原理模式圖。


圖10是表示本發(fā)明的信號(hào)擴(kuò)增方法的工藝順序的第4例中的步驟144的原理模式圖。
圖11是表示實(shí)施例1～3和比較例1～3的結(jié)果的照片。
圖12是表示實(shí)施例4～6和比較例4～6的結(jié)果的照片。
圖13是表示實(shí)施例7～9和比較例7～9的結(jié)果的照片。
圖14是表示實(shí)施例10～12和比較例10～12的結(jié)果的照片。
圖15是表示實(shí)施例13～15和比較例13～15的結(jié)果的照片。
圖16是表示實(shí)施例16～18和比較例16～18的結(jié)果的照片。
圖17是表示實(shí)驗(yàn)例1～4的結(jié)果的照片。
圖1～圖4是本發(fā)明信號(hào)擴(kuò)增方法的工藝順序第1例的原理模式圖。第1例是利用由3個(gè)互補(bǔ)區(qū)域構(gòu)成的一對(duì)自身可以自聚形成自聚體的寡核苷酸探針(即，一對(duì)HCPHCP-1，HCP-2)利用PALSAR法的DNA芯片信號(hào)擴(kuò)增方法，而且使用了具有與靶基因互補(bǔ)的區(qū)域、預(yù)先用熒光物質(zhì)標(biāo)記的一對(duì)HCP的例子。
如圖1所示，在作為支撐體使用的載玻片(符號(hào)A)上結(jié)合具有與靶基因互補(bǔ)區(qū)域的捕捉用DNA探針(符號(hào)B)(步驟100)。接著，如圖2所示，在捕捉靶基因(符號(hào)C)(步驟102)之后，如圖3所示，結(jié)合上述用熒光物質(zhì)標(biāo)記了的、具有與靶基因互補(bǔ)區(qū)域、自身可以形成自聚體的一個(gè)HCP-1(符號(hào)D)(步驟110)。以圖3所示的DNA芯片為對(duì)象，如圖4所示，加入另一HCP-2(符號(hào)E)(步驟112)，由自聚反應(yīng)形成自聚體，可以使信號(hào)擴(kuò)增(步驟114)。另外，步驟110與步驟112可以同時(shí)進(jìn)行。
圖5和圖6是表示本發(fā)明的信號(hào)擴(kuò)增方法工藝順序的第2例中的步驟122的原理模式圖。第2例是用一對(duì)HCP利用PALSAR法的DNA芯片的信號(hào)擴(kuò)增方法，而且用的是具有與靶基因互補(bǔ)區(qū)域而沒(méi)有用熒光物質(zhì)標(biāo)記的一對(duì)HCP的例子。
在進(jìn)行了與上述第1例一樣的步驟100和102之后，加入一對(duì)HCP。在形成自聚體(步驟120)之后，如圖5所示，在形成的自聚體中插入嵌入劑(intercalater，符號(hào)F)(步驟122)，如圖6所示，可以把信號(hào)擴(kuò)增(步驟124)。另外，步驟120和步驟122也可能同時(shí)進(jìn)行。
圖7～圖9是本發(fā)明信號(hào)擴(kuò)增方法工藝順序第3例的原理示意圖。第3例是使用形成自身二聚體的一對(duì)二聚體形成用探針和可以使由此二聚體形成用探針?biāo)纬傻亩垠w交聯(lián)的一對(duì)交聯(lián)探針利用PALSAR法的DNA芯片信號(hào)擴(kuò)增方法，使用預(yù)先用熒光物質(zhì)標(biāo)記的一對(duì)二聚體形成用探針(二聚體形成用探針-1，2)的例子。
在進(jìn)行了與上述第1例一樣的步驟100和步驟102之后，如圖7所示，使具有與此靶基因互補(bǔ)區(qū)域的、自身形成二聚體的二聚體形成用探針-1、2(符號(hào)G、H)與靶基因雜交(步驟130)。接著，如圖8所示，與對(duì)于形成二聚體的二聚體形成用探針-1、2，使具有互補(bǔ)區(qū)域的交聯(lián)探針-1、2(符號(hào)I、J)雜交(步驟132)，如圖9所示，形成二聚體形成用探針與交聯(lián)探針通過(guò)自聚反應(yīng)而形成了自聚體，可以使信號(hào)擴(kuò)增(步驟134)。另外，步驟130與步驟132也可能同時(shí)進(jìn)行。
圖10是本發(fā)明信號(hào)擴(kuò)增方法的工藝順序第4例的原理示意圖。第4例是使用形成自身二聚體的一對(duì)二聚體形成用探針和可以使由此二聚體形成用探針形成的二聚體交聯(lián)的一對(duì)交聯(lián)探針用PALSAR法的DNA芯片信號(hào)擴(kuò)增方法，使用具有與靶基因互補(bǔ)區(qū)域的一對(duì)二聚體形成用探針(二聚體形成用探針-1，2)而二聚體形成用探針和交聯(lián)探針為沒(méi)有標(biāo)記的情況。
在進(jìn)行了與上述第1例一樣的步驟100和步驟102之后，加入一對(duì)二聚體形成用探針和一對(duì)交聯(lián)探針，形成了自聚體(步驟140)之后，如圖10所示，在形成的自聚體中插入嵌入劑(符號(hào)F)(步驟142)，可以把信號(hào)擴(kuò)增(步驟144)。另外，步驟140和步驟142也可能同時(shí)進(jìn)行。
在本發(fā)明的信號(hào)擴(kuò)增方法中，在一對(duì)寡核苷酸探針中作為預(yù)先用于檢出的標(biāo)記物質(zhì)可以是，例如，I125或P32等放射性同位素、異羥基洋地黃毒配質(zhì)或吖啶鎓酯等發(fā)光物質(zhì)或Cy3 Cy5等熒光物質(zhì)、用于利用磷酸4-甲基傘形酮酯等熒光物質(zhì)的生物素(biotin)等、用于利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)使給體熒光色素與受體熒光色素加成，也可以檢出靶基因。
還有，通過(guò)加入有與核酸結(jié)合的性質(zhì)的色素來(lái)檢出靶基因也是可能的。如圖5、圖6和圖10所示，使用嵌入劑那樣的具有與核酸結(jié)合性質(zhì)的熒光物質(zhì)來(lái)檢出靶基因是合適的。作為熒光物質(zhì)，只要是具有與核酸結(jié)合性質(zhì)的熒光物質(zhì)的話，就沒(méi)有特別的限制，可以使用，例如，SYBR綠I染劑、SYBR綠II染劑、SYBR綠金染劑、粘膠絲綠染劑、Gelstar染劑、Radlant紅染劑、Pico綠、Ribo綠、Oll綠、Hoechst 33258(雙苯甲酰亞胺)、丙鎓lodide、YO-PRO-1lodide、YO-PRO-3lodide(以上由Molecular Probes公司生產(chǎn))、溴化乙鎓、偏端霉素A、TOTO、補(bǔ)骨脂靈、吖啶橙、AOAO(均二聚體)等。
構(gòu)成上述一對(duì)寡核苷酸的核酸通常是由DNA或RNA構(gòu)成的，即使是核酸類似物也無(wú)所謂。作為核酸類似物列舉有，例如，肽核酸(PNA，WO92/20702)或鎖核酸(LNA，Koshkin AA et al.，Tetrahedron，1998，54，3607-3630，Koshkin AA et al.，J.Am.Chem.Soc.，1998，120，13252-13253，Wahlestedt C et al.，PNAS.，2000，97，5633-5638.)。還有，一對(duì)寡核苷酸探針通常是由同一種類的核酸所構(gòu)成的，不過(guò)由例如DNA探針與RNA探針成為一對(duì)也無(wú)所謂。即，探針核酸的種類可以從DNA、RNA或核酸類似物(例如PNA或LNA)中來(lái)選擇。另外，一個(gè)探針內(nèi)的核酸組成沒(méi)有必要只是一種例如DNA所構(gòu)成，根據(jù)需要，使用例如由DNA和RNA構(gòu)成的寡核苷酸探針(嵌合體探針)也是可能的，這也包括在本發(fā)明之內(nèi)。
寡核苷酸探針的各互補(bǔ)堿基序列區(qū)域的長(zhǎng)度是，以堿基數(shù)來(lái)說(shuō)，至少要5個(gè)堿基，優(yōu)選10個(gè)～100個(gè)堿基，進(jìn)一步優(yōu)選是15個(gè)～30個(gè)堿基。
這些探針可以用已知方法來(lái)合成。例如，DNA探針的場(chǎng)合，可以使用應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystem Inc.)的DNA合成裝置394型通過(guò)磷酸酰胺法來(lái)合成。作為其它的方法，還有磷酸三酯法、H-磷酸鹽法、硫代磷酸鹽法等，不過(guò)，用任何方法合成都行。
本發(fā)明是，對(duì)于在DNA芯片上捕捉的靶基因，以具有互補(bǔ)區(qū)域的一對(duì)HCP或一對(duì)形成二聚體用探針和一對(duì)交聯(lián)探針來(lái)形成自聚體。雖然對(duì)于所使用的寡核苷酸探針的數(shù)目沒(méi)有特別的限制，不過(guò)選用在102～1015范圍之內(nèi)。對(duì)反應(yīng)緩沖液的組成、濃度也沒(méi)有特別的限制，可以合適使用在核酸擴(kuò)增中常用的普通緩沖液。pH也選在常用的范圍內(nèi)，優(yōu)選pH7.0～9.0范圍。反應(yīng)溫度為40℃～80℃，優(yōu)選55℃～65℃。
本發(fā)明中，測(cè)定靶基因(DNA和/或RNA)用的樣品可以使用有可能含此核酸的所有樣品。靶基因可以是由樣品適當(dāng)調(diào)制或分離者也行。沒(méi)有特別的限制。列舉有，例如，血液、血清、尿、糞便、腦脊髓液、組織液、細(xì)胞培養(yǎng)物等來(lái)自于生物體的樣品、含有或可能感染了病毒、細(xì)菌、霉菌等的樣品等。還有，也可以用已知方法擴(kuò)增后的DNA和/或RNA等核酸來(lái)用作樣品中的靶基因。
(1)材料以下示出實(shí)施例中所用的寡核苷酸探針。
探針1捕捉用DNA探針-1a5’-NH2-AAAAAAGCGG GAAATCGTGC GTGACATTAA-3’[2]探針2靶基因-15’-CGTGGCCATC TCTTGCTCGA AGTCCAGGGC GACGTAGCACAGCTTCTCCT TAATGTCACG CACGATTTCC CGCTCGGCCG-3’[3]探針3HCP-15’-CCTGGACTTC GAGCAAGAGA TGGCCGGCAC CACCATGTACCCTGGCATTG GTCCACCGCA AATGCTTCTA GGCGG-3’[4]探針4HCP-25’-GGCCATCTCT TGCTCGAAGT CCAGGCAATG CCAGGGTACATGGTGGTGCC CCGCCTAGAA GCATTTGCGG TGGAC-3’ 探針5HCP-35’-CCCTGGACTT CGAGCAAGAG CGTGGACATC CGCAAAGACCGCAGGAGTAT GACGAGTCCG-3’[6]探針6HCP-45’-CTCTTGCTCG AAGTCCAGGG GGTCTTTGCG GATGTCCACGCGGACTCGTC ATACTCCTGC-3’[7]探針7二聚體形成用探針-15’-GACTTCGAGC AAGAGATGGC CCTGATAGGG TGCTTGCGAGCCATTGGCAA TGAGCGGTTC-3’[8]探針8二聚體形成用探針-25’-GAGCATCCCC CAAAGTTCAC CTCGCAAGCA CCCTATCAGGGTGGCATCCA CGAAACTACC-3’[9]探針9交聯(lián)探針-15’-GCCATCTCTT GCTCGAAGTC GAACCGCTCA TTGCCAATGG-3’[10]探針10交聯(lián)探針-25’-GTGAACTTTG GGGGATGCTC GGTAGTTTCG TGGATGCCAC-3’[11]探針11捕捉用DNA探針-2a5’-NH2-GATCAGACAC TTCAAGGTCT CTGGCGCTTTAAGATTAGCC TGCGTCCGAT-3’[12]探針12捕捉用DNA探針-1b5’-NH2-AAAAAAGCGG GAAATCGTGC GTGACATTAAGGAGAAGCTG-3’[13]探針13靶基因-25’-TGCTTCTTCT GTGGGTAACG TCCAGTTAAT CAGCTCTTAACCTATCAACC CTCCAACTAG CTAATCGGAC GCAGGCTAATCTTAAAGCGC CAGGCCCGAA-3’[14]探針14HCP-55’-GAGGGTTGAT AGGTTAAGAG CTGGTAGAGA TCGGAAGGAACACCAGCAGC AAACGCGATA AGTTGACCG-3’[15]探針15HCP-6
5’-CAGCTCTTAA CCTATCAACC CTCCTGGTGT TCCTTCCGATCTCTACCGGT CAACTTATCG CGTTTGCTG-3’[16]探針16捕捉用DNA探針-2b5’-SH-GATCAGACAC TTCAAGGTCT CTGGCGCTTTAAGATTAGCC TGCGTCCGAT-3’作為雜交液，用的是(0.8μg/μL聚dA，0.1μg/μL酵母tRNA，0.15μg/μL人Cot-I DNA，5×Denhardt’s液，0.1mg/mL Sarmon sperm DNA，0.2％SDS，6×SSC)的雜交液。(實(shí)施例1～3和比較例1～3)(1)目的用Cy3標(biāo)記的一對(duì)HCP(HCP-1和HCP-2)來(lái)研究信號(hào)擴(kuò)增效果。(2)材料(實(shí)施例1～3)(a)捕捉用探針?lè)謩e使用在500ng/μL(實(shí)施例1)、50ng/μL(實(shí)施例2)、5ng/μL(實(shí)施例3)中調(diào)制的具有與靶基因-1互補(bǔ)區(qū)域的捕捉用DNA探針-1a。
(b)作為1次雜交液，把50ng靶基因-1溶解在10μL雜交液中，在95℃加熱2min，調(diào)制成1次雜交液A。
(c)作為2次雜交液，把25pmol用Cy3標(biāo)記的HCP-1和25pmol用Cy3標(biāo)記的HCP-2溶解在10μL雜交液中，在95℃加熱2min，調(diào)制成2次雜交液A。(比較例1～3)(a)捕捉用探針?lè)謩e使用在500ng/μL(比較例1)、50ng/μL(比較例2)、5ng/μL(比較例3)中調(diào)制的捕捉用DNA探針-1a。
(b)作為1次雜交液，使用上述的1次雜交液A。
(c)作為2次雜交液，把25pmol用Cy3標(biāo)記的HCP-1溶解在10μL雜交液中，在95℃加熱2min，調(diào)制成2次雜交液B。(3)方法將捕捉用探針把點(diǎn)在載玻片上進(jìn)行探針固定。在此載玻片的點(diǎn)面上滴下1次雜交液25μL，用蓋玻片覆蓋后裝入雜交室，在42℃靜置24h。其后，取出載玻片，在室溫的2×SSC、0.1％SDS中把蓋玻片拿掉，用2×SSC、0.1％SDS沖洗載玻片。進(jìn)一步在1×SSC、室溫的0.2×SSC中分別靜置2min后，用空氣噴槍把載玻片干燥。
再在此載玻片的點(diǎn)面上滴下2次雜交液10μL，用蓋玻片覆蓋后裝入雜交室，在42℃靜置16h。其后，取出載玻片，在室溫的2×SSC、0.1％SDS中把蓋玻片拿掉，用2×SSC、0.1％SDS沖洗載玻片。進(jìn)一步在1×SSC、室溫的0.2×SSC中分別靜置2min后，用空氣噴槍把載玻片干燥。(4)檢出方法用熒光顯微鏡(580nm)觀察上述載玻片。(5)結(jié)果圖11示出了實(shí)施例1～3和比較例1～3的結(jié)果。如圖11中所示，形成了自聚體的實(shí)施例1～3，與沒(méi)有形成自聚體的比較例1～3相比，熒光強(qiáng)度的增大非常大。通過(guò)利用由Cy3標(biāo)記的一對(duì)HCP的形成自聚體的反應(yīng)，使得DNA芯片的依賴于捕捉用探針的濃度的信號(hào)有明顯擴(kuò)增。(實(shí)施例4～6和比較例4～6)(1)目的用一對(duì)HCP(HCP-1和HCP-2)由SYBR綠I來(lái)檢出。(2)材料(實(shí)施例4～6)(a)捕捉用探針?lè)謩e使用在500ng/μL(實(shí)施例4)、50ng/μL(實(shí)施例5)、5ng/μL(實(shí)施例6)中調(diào)制的捕捉用DNA探針-1a。
(b)作為1次雜交液，使用上述1次雜交液A。
(c)作為2次雜交液，把25pmolHCP-1和25pmolHCP-2溶解在10μL雜交液中，在95℃加熱2min，調(diào)制成2次雜交液C。(比較例4～6)(a)捕捉用探針?lè)謩e使用在500ng/μL(比較例4)、50ng/μL(比較例5)、5ng/μL(比較例6)中調(diào)制的捕捉用DNA探針-1a。
(b)作為1次雜交液，使用上述的1次雜交液A。
(c)作為2次雜交液，把25pmolHCP-1溶解在10μL雜交液中，在95℃加熱2min，調(diào)制成2次雜交液D。(3)方法按實(shí)施例1～3和比較例1～3同樣的順序和條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(4)檢出方法把原液用0.5×TBE稀釋為1000倍的SYBR綠I滴在載玻片的點(diǎn)面上，在室溫靜置3min。用室溫的0.5×TBE沖洗3次，用空氣噴槍干燥，用熒光顯微鏡(475nm)進(jìn)行觀察。(5)結(jié)果圖12示出了實(shí)施例4～6和比較例4～6的結(jié)果。如圖12中所示，形成了自聚體的實(shí)施例4～6，與沒(méi)有形成自聚體的比較例4～6相比，熒光強(qiáng)度的增大非常大。利用一對(duì)HCP的形成自聚體的反應(yīng)由SYBR綠I檢出，使得DNA芯片的依賴于捕捉用探針的濃度的信號(hào)有明顯擴(kuò)增。(實(shí)施例7～9和比較例7～9)(1)目的用一對(duì)HCP(HCP-1和HCP-2)由Pico綠來(lái)檢出。(2)材料(實(shí)施例7～9)(a)捕捉用探針?lè)謩e使用在500ng/μL(實(shí)施例7)、50ng/μL(實(shí)施例8)、5ng/μL(實(shí)施例9)中調(diào)制的捕捉用DNA探針-1a。
(b)作為1次雜交液，使用上述的1次雜交液A。
(c)作為2次雜交液，使用上述的2次雜交液C。(比較例7～9)(a)捕捉用探針?lè)謩e使用在500ng/μL(比較例7)、50ng/μL(比較例8)、5ng/μL(比較例9)中調(diào)制的捕捉用DNA探針-1a。
(b)作為1次雜交液，使用上述的1次雜交液A。
(c)作為2次雜交液，使用上述的2次雜交液D。(3)方法按上述實(shí)施例1～3和比較例1～3的(3)同樣的順序和條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(4)檢出方法把原液用TE稀釋為200倍的Pico綠滴在載玻片的點(diǎn)面上，在室溫靜置30min。用室溫的0.5×TBE沖洗3次，用空氣噴槍干燥，用熒光顯微鏡(475nm)進(jìn)行觀察。(5)結(jié)果圖13示出了實(shí)施例7～9和比較例7～9的結(jié)果。如圖13中所示，形成了自聚體的實(shí)施例7～9，與沒(méi)有形成自聚體的比較例7～9相比，熒光強(qiáng)度的增大非常大。利用一對(duì)HCP的形成自聚體的反應(yīng)由Pico綠檢出，使得DNA芯片的依賴于捕捉用探針的濃度的信號(hào)有明顯擴(kuò)增。(實(shí)施例10～12和比較例10～12)(1)目的用一對(duì)HCP(HCP-1和HCP-2)由EtBr來(lái)檢出。(2)材料(實(shí)施例10～12)(a)捕捉用探針?lè)謩e使用在500ng/μL(實(shí)施例10)、50ng/μL(實(shí)施例11)、5ng/μL(實(shí)施例12)中調(diào)制的捕捉用DNA探針-1a。
(b)作為1次雜交液，使用上述的1次雜交液A。
(c)作為2次雜交液，使用上述的2次雜交液C。(比較例10～12)(a)捕捉用探針?lè)謩e使用在500ng/μL(比較例10)、50ng/μL(比較例11)、5ng/μL(比較例11)中調(diào)制的捕捉用DNA探針-1a。
(b)作為1次雜交液，使用上述的1次雜交液A。
(c)作為2次雜交液，使用上述的2次雜交液D。(3)方法按實(shí)施例1～3和比較例1～3的(3)同樣的順序和條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(4)檢出方法把10μg/μL的EtBr滴在載玻片的點(diǎn)面上，在室溫靜置30min。用室溫的0.5×TBE沖洗3次，用空氣噴槍干燥，用熒光顯微鏡(580nm)進(jìn)行觀察。(5)結(jié)果圖14示出了實(shí)施例10～12和比較例10～12的結(jié)果。如圖14中所示，形成了自聚體的實(shí)施例10～12，與沒(méi)有形成自聚體的比較例10～12相比，熒光強(qiáng)度的增大非常大。利用一對(duì)HCP的形成自聚體的反應(yīng)由EtBr檢出， 使得DNA芯片的依賴于捕捉用探針的濃度的信號(hào)有明顯擴(kuò)增。(實(shí)施例13～15和比較例13～15)(1)目的用一對(duì)與實(shí)施例1～3的HCP不同的一對(duì)HCP(HCP-3和HCP-4)來(lái)研究用Cy3標(biāo)記的一對(duì)HPC使信號(hào)擴(kuò)增。(2)材料(實(shí)施例13～15)(a)捕捉用探針?lè)謩e使用在500ng/μL(實(shí)施例13)、50ng/μL(實(shí)施例14)、5ng/μL(實(shí)施例15)中調(diào)制的捕捉用DNA探針-1a。
(b)作為1次雜交液，使用上述的1次雜交液A。
(c)作為2次雜交液，把25pmol用Cy3標(biāo)記的HCP-3和25pmol用Cy3標(biāo)記的HCP-4溶解在10μL雜交液中，在95℃加熱2min，調(diào)制成2次雜交液E。(比較例13～15)(a)捕捉用探針?lè)謩e使用在500ng/μL(比較例13)、50ng/μL(比較例14)、5ng/μL(比較例15)中調(diào)制的捕捉用DNA探針-1a。
(b)作為1次雜交液，使用上述的1次雜交液A。
(c)作為2次雜交液，把25pmol用Cy3標(biāo)記的HCP-5溶解在10μL雜交液中，在95℃加熱2min，調(diào)制成2次雜交液F。(3)方法將捕捉用探針點(diǎn)在載玻片上進(jìn)行探針固定。在此載玻片的點(diǎn)面上滴下1次雜交液25μL，用蓋玻片覆蓋后裝入雜交室，在42℃靜置2h。其后，取出載玻片，在室溫的2×SSC、0.1％SDS中把蓋玻片拿掉，用2×SSC、0.1％SDS沖洗載玻片。進(jìn)一步在1×SSC、室溫的0.2×SSC中分別靜置2min后，用空氣噴槍把載玻片干燥。
再在此載玻片的點(diǎn)面上滴下2次雜交液10μL，用蓋玻片覆蓋后裝入雜交室，在54℃靜置6h。其后，取出載玻片，在室溫的2×SSC、0.1％SDS中把蓋玻片拿掉，用2×SSC、0.1％SDS沖洗載玻片。進(jìn)一步在1×SSC、室溫的0.2×SSC中分別靜置2min后，用空氣噴槍把載玻片干燥。(4)檢出方法用熒光顯微鏡(580nm)進(jìn)行觀察上述載玻片。(5)結(jié)果圖15示出了實(shí)施例13～15和比較例13～15的結(jié)果。如圖15中所示，形成了自聚體的實(shí)施例13～15，與沒(méi)有形成自聚體的比較例13～15相比，熒光強(qiáng)度的增大非常大。利用一對(duì)用Cy3標(biāo)記的HCP形成自聚體的反應(yīng)，使得DNA芯片的依賴于捕捉用探針的濃度的信號(hào)有明顯擴(kuò)增。通過(guò)與實(shí)施例1～3的比較可以知道，通過(guò)調(diào)節(jié)一對(duì)HCP的堿基序列以及反應(yīng)條件，可以更提高檢出靈敏度。(實(shí)施例16～18和比較例16～18)(1)目的用一對(duì)Cy3標(biāo)記的二聚體形成用探針和一對(duì)交聯(lián)探針來(lái)研究信號(hào)擴(kuò)增的效果。(2)材料(實(shí)施例16～18)(a)捕捉用探針?lè)謩e使用在500ng/μL(實(shí)施例16)、50ng/μL(實(shí)施例17)、5ng/μL(實(shí)施例18)中調(diào)制的捕捉用DNA探針-1a。
(b)作為1次雜交液，使用上述的1次雜交液A。
(c)2次雜交液按如下調(diào)制把25pmol用Cy3標(biāo)記的二聚體形成用探針-1和25pmol用Cy3標(biāo)記的二聚體形成用探針-2溶解在10μL雜交液中，在95℃加熱2min，在45℃靜置16h。在其中加入0.5μL的50μM的交聯(lián)探針-1溶液和50μM的交聯(lián)探針-2溶液調(diào)制成2次雜交液G。(比較例16～18)(a)捕捉用探針?lè)謩e使用在500ng/μL(比較例16)、50ng/μL(比較例17)、5ng/μL(比較例18)中調(diào)制的捕捉用DNA探針-1a。
(b)作為1次雜交液，使用上述的1次雜交液A。
(c)2次雜交液按如下調(diào)制把25pmol用Cy3標(biāo)記的二聚體形成用探針和25pmol用Cy3標(biāo)記的二聚體形成用探針溶解在10μL雜交液中，在95℃加熱2min后，在45℃靜置16h。在其中加入蒸餾水0.5μL調(diào)制成2次雜交液H。(3)方法將捕捉用探針點(diǎn)在載玻片上進(jìn)行探針固定。在此載玻片的點(diǎn)面上滴下1次雜交液25μL，用蓋玻片覆蓋后裝入雜交室，在42℃靜置2h。其后，取出載玻片，在室溫的2×SSC、0.1％SDS中把蓋玻片拿掉，用2×SSC、0.1％SDS沖洗載玻片。進(jìn)一步在1×SSC、室溫的0.2×SSC中分別靜置2min，用空氣噴槍把載玻片干燥。
再在此載玻片的點(diǎn)面上滴下2次雜交液10μL，用蓋玻片覆蓋后裝入雜交室，在58℃靜置2h。其后，取出載玻片，在室溫的2×SSC、0.1％SDS中把蓋玻片拿掉，用2×SSC、0.1％SDS沖載玻片。進(jìn)一步在1×SSC、室溫的0.2×SSC中分別靜置2min后，用空氣噴槍把載玻片干燥。(4)檢出方法用熒光顯微鏡(580nm)進(jìn)行觀察上述載玻片。(5)結(jié)果圖15示出了實(shí)施例16～18和比較例16～18的結(jié)果。如圖16中所示，形成了自聚體的實(shí)施例16～18，與沒(méi)有形成自聚體的比較例16～18相比，熒光強(qiáng)度的增大非常大。利用用Cy3標(biāo)記的一對(duì)HCP和一對(duì)交聯(lián)探針的形成自聚體的反應(yīng)，使得DNA芯片的依賴于捕捉用探針的濃度的信號(hào)有明顯擴(kuò)增。(實(shí)驗(yàn)例1～4)(1)目的用2種Cy3標(biāo)記的一對(duì)HCP(HCP-3和HCP-4、HCP-5和HCP-6)來(lái)研究用HCP使信號(hào)擴(kuò)增的特異性。(2)材料(a)捕捉用探針使用分別在50pmol/μL或5 pmol/μL調(diào)制的具有與靶基因-2互補(bǔ)區(qū)域的捕捉用DNA探針2a或具有與靶基因-1互補(bǔ)區(qū)域的捕捉用DNA探針1b。
(b)作為實(shí)驗(yàn)例1的1次雜交液，使用按如下調(diào)制的1次雜交液B把3pmol靶基因-1溶解在30μL的雜交液X(5×Denhardt’s液，0.1mg/mL Salmon spermDNA，0.2％SDS，6×SSC)中，在95℃加熱2min，調(diào)制成1次雜交液B。
作為實(shí)驗(yàn)例2的1次雜交液，使用按如下調(diào)制的1次雜交液C把3pmol靶基因-2溶解在30μL的雜交液X中，在95℃加熱2min后，調(diào)制成1次雜交液C。
作為實(shí)驗(yàn)例3的1次雜交液，使用按如下調(diào)制的1次雜交液D把各為3pmol靶基因-1和靶基因-2溶解在30μL的雜交液X中，在95℃加熱2min，調(diào)制成1次雜交液D。
作為實(shí)驗(yàn)例4的1次雜交液，使用按如下調(diào)制的1次雜交液E把不加靶基因的30μL雜交液X在95℃加熱2min，調(diào)制成1次雜交液E。
(c)作為2次雜交液是把各自為30pmol的用Cy3標(biāo)記的HCP-5、用Cy3標(biāo)記的HCP-6、用Cy3標(biāo)記的HCP-3和用Cy3標(biāo)記的HCP-4溶解在30μL雜交液X中，在95℃加熱2min，調(diào)制成2次雜交液X。(3)方法將捕捉用DNA探針-2(50pmol/μL或5 pmol/μL)或捕捉用DNA探針-1b(50pmol/μL或5 pmol/μL)各自點(diǎn)在載玻片上進(jìn)行探針固定。在原位PCR用室內(nèi)分別向同樣的4片載玻片點(diǎn)滴上25μL1次雜交液B～E，密封后，在42℃靜置2h。其后，從室取出，在室溫的2×SSC、0.1％SDS中沖洗2次。接著在1×SSC、室溫的0.2×SSC中分別靜置2min后，用空氣噴槍把載玻片干燥。
再在原位PCR用室內(nèi)滴下2次雜交液25μL，密封，在57.7℃靜置2h。其后，從室取出，在室溫的2×SSC、0.1％SDS中沖洗2次。接著在1×SSC、室溫的0.2×SSC中分別靜置2min后，用空氣噴槍把載玻片干燥，用熒光顯微鏡(580nm)進(jìn)行觀察。(4)結(jié)果圖17示出了實(shí)驗(yàn)例1～4的結(jié)果。如圖17中所示，捕捉用DNA探針-1b被固定的地點(diǎn)，靶基因-1被捕捉，由HCP擴(kuò)增了信號(hào)。還有，捕捉用DNA探針-2a被固定的地點(diǎn)，捕捉靶基因-2，由HCP擴(kuò)增了信號(hào)。(實(shí)驗(yàn)例5和6)(1)目的使用可以用微分脈沖伏特計(jì)法測(cè)定在支撐體上的電流值的金電極，使用電化學(xué)活性的嵌入劑來(lái)代替熒光用嵌入劑，研究用HCP的基因信號(hào)擴(kuò)增。
(實(shí)驗(yàn)例5)(2)材料與方法用0.05μm鋁粉懸浮液(バイカロツクス公司生產(chǎn))研磨金電極(BAS公司生產(chǎn))、用無(wú)菌蒸餾水淋洗之后，在100％乙醇中超聲洗滌15min。在用無(wú)菌蒸餾水淋洗后，把金表面干燥，把2μL的在10pmol/μL中調(diào)制的捕捉用DNA探針2b用于金上。為了防止干燥把它罩了起來(lái)，放入濕潤(rùn)箱中，室溫下靜置一夜。
用無(wú)菌蒸餾水淋洗后，在測(cè)定緩沖液
中靜置180s雜交，用ALS630(BSA公司生產(chǎn))由微分脈沖伏特計(jì)法測(cè)定電流值(捕捉用探針的值為i0)。
作為目標(biāo)溶液用的是由含有1pmol/μL靶基因-2的5×SSC溶液調(diào)制的。在無(wú)菌蒸餾水淋洗之后，把2μL上述靶基因用于金電極上。
罩起來(lái)之后，放入濕潤(rùn)箱中，在45℃靜置180min進(jìn)行雜交，用2×SSC+0.1％SDS洗1次、0.2×SSC+0.1％DS洗2次、1×SSC洗1次和0.2×SSC洗1次，然后干燥。
在測(cè)定緩沖液(0.1M醋酸緩沖液(pH5.6，醋酸鉀/醋酸)、0.1M氯化鉀、50μM Hoechist 33258)中靜置180s后，由微分脈沖伏特計(jì)法測(cè)定電流值(捕捉用探針結(jié)合了目標(biāo)時(shí)的值為i1)。
在無(wú)菌蒸餾水淋洗之后，于金電極上使用2μL含有一對(duì)HCP的溶液[HCP-5和HCP-6各0.156pmol/μL、12×SSC、10μM Hoechist 33258]。
罩起來(lái)之后，放入濕潤(rùn)箱中，在58℃靜置120min，形成聚合物。
用2×SSC+0.1％SDS洗1次、0.2×SSC+0.1％DS洗2次、1×SSC洗1次和0.2×SSC洗2次之后，干燥。在測(cè)定緩沖液
中靜置180s后，由微分脈沖伏特計(jì)法測(cè)定電流值(在捕捉用探針上已經(jīng)結(jié)合的目標(biāo)上結(jié)合的HCP的自聚值為i2)。
(實(shí)驗(yàn)例6)作為目標(biāo)溶液，除了用含有0.5pmol/μL的5×SSC溶液調(diào)制的靶基因-2代替含有1pmol/μL靶基因-2的5×SSC溶液之外，以與上面的實(shí)驗(yàn)例5同樣的順序及條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(5)結(jié)果表1和表2分別給出了實(shí)驗(yàn)例5(靶基因-2；1pmol/μL)和實(shí)驗(yàn)例6(靶基因-2；0.5pmol/μL)的結(jié)果。
如表1和表2所示，即使是表1和表2中僅靶基因被雜交時(shí)，使用了HCP而自聚時(shí)，所得到的電流峰值增加率變大。
表1 1pmol/μL的靶基因-2

表2 0.5pmol/μL的靶基因-2

如上所述，本發(fā)明是利用寡核苷酸的自聚反應(yīng)來(lái)使DNA芯片的信號(hào)擴(kuò)增的方法，不要進(jìn)行繁雜的操作，可以簡(jiǎn)便地明顯提高DNA芯片的靶基因的檢出靈敏度。
序列表SEQUENCE LISTING<110>三光純藥株式會(huì)社<120>DNA芯片的信號(hào)擴(kuò)增方法<130>76161-PCT-CN<140>PCT/JP02/10034<141>2002-09-27<150>JP 2001-303816<151>2001-09-28<160>16<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc-feature<222>(1)<223>5′端連接的氨基<220><213>人工序列的描述探針1<400>1aaaaaagcgg gaaatcgtgc gtgacattaa 30<210>2<211>80<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述探針2<400>2cgtggccatc tcttgctcga agtccagggc gacgtagcac agcttctcct taatgtcacg60cacgatttcc cgctcggccg80<210>3<211>75<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述探針3<400>3cctggacttc gagcaagaga tggccggcac caccatgtac cctggcattg gtccaccgca60aatgcttcta ggcgg 75<210>4<211>75<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述探針4<400>4ggccatctct tgctcgaagt ccaggcaatg ccagggtaca tggtggtgcc ccgcctagaa60gcatttgcgg tggac 75<210>5<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述探針5<400>5ccctggactt cgagcaagag cgtggacatc cgcaaagacc gcaggagtat gacgagtccg60<210>6<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述探針6<400>6ctcttgctcg aagtccaggg ggtctttgcg gatgtccacg cggactcgtc atactcctgc60<210>7<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述探針7<400>7gacttcgagc aagagatggc cctgataggg tgcttgcgag ccattggcaa tgagcggttc60<210>8<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述探針8<400>8gagcatcccc caaagt tcac ctcgcaagca ccctatcagg gtggcatcca cgaaactacc60<210>9<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述探針9<400>9gccatctctt gctcgaagtc gaaccgctca ttgccaatgg 40<210>10<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述探針10<400>10gtgaactttg ggggatgctc ggtagtttcg tggatgccac 40<210>11<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc feature<222>(1)<223>5′端連接的氨基<220><213>人工序列的描述探針11<400>11gatcagacac ttcaaggtct ctggcgcttt aagattagcc tgcgtccgat 50<210>12<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc feature<222>(1)<223>5′端連接的氨基<220><213>人工序列的描述探針12<400>12aaaaaagcgg gaaatcgtgc gtgacattaa ggagaagctg 40<210>13<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述探針13<400>13tgctt cttct gtgggtaacg tccagttaat cagctcttaa cctatcaacc ctccaactag 60ctaat cggac gcaggctaat cttaaagcgc caggcccgaa 100<210>14<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述探針14<400>14gagggttgat aggttaagag ctggtagaga tcggaaggaa caccagcagc aaacgcgata60agttgaccg69<210>15<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述探針15<400>15cagctcttaa cctatcaacc ctcctggtgt tccttccgat ctctaccggt caacttatcg 60cgtttgctg 69<210>16<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc feature<222>(1)<223>5′端連接的巰基<220><213>人工序列的描述探針16<400>16gatcagacac ttcaaggtct ctggcgcttt aagattagcc tgcgtccgat 50
權(quán)利要求
1.一種DNA芯片信號(hào)擴(kuò)增方法，其特征在于，利用形成寡核苷酸的2條鏈的有規(guī)則的高級(jí)結(jié)構(gòu)的自聚體的自聚反應(yīng)來(lái)提高DNA芯片上靶基因的檢出靈敏度。
2.根據(jù)權(quán)利要求項(xiàng)1所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其特征在于，所述自聚反應(yīng)是用多對(duì)由n(n≥3)個(gè)互補(bǔ)部分構(gòu)成的一對(duì)寡核苷酸探針相互交叉雜交使寡核苷酸自聚而形成2條鏈的自聚體。
3.根據(jù)權(quán)利要求項(xiàng)1所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其特征在于，所述自聚反應(yīng)具有，含有多對(duì)把1號(hào)和2號(hào)的一對(duì)寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’一側(cè)區(qū)域、中央?yún)^(qū)域和5’一側(cè)區(qū)域3個(gè)區(qū)域且在將各寡核苷酸的中央?yún)^(qū)域作為互補(bǔ)堿基序列形成二聚體探針的同時(shí)將3’一側(cè)區(qū)域和5’一側(cè)區(qū)域作為不互補(bǔ)堿基序列的一對(duì)二聚體形成用探針的第1體系和含有多對(duì)把3號(hào)和4號(hào)的一對(duì)寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’一側(cè)區(qū)域和5’一側(cè)區(qū)域2個(gè)區(qū)域且將各寡核苷酸的3’一側(cè)區(qū)域和5’一側(cè)區(qū)域作為不互補(bǔ)堿基序列的一對(duì)交聯(lián)探針的第2體系，且將此交聯(lián)探針作為能夠交聯(lián)由所述二聚體形成用探針形成的二聚體的堿基序列，通過(guò)使該探針雜交使寡核苷酸自聚而形成自聚體。
4.根據(jù)權(quán)利要求項(xiàng)3中所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其特征在于，所述探針的堿基序列是使第1體系的1號(hào)寡核苷酸的3’一側(cè)區(qū)域與第2體系的3號(hào)寡核苷酸的3’一側(cè)區(qū)域、第1體系的2號(hào)寡核苷酸的5’一側(cè)區(qū)域與第2體系的4號(hào)寡核苷酸的5’一側(cè)區(qū)域、第2體系的4號(hào)寡核苷酸的3’一側(cè)區(qū)域與第1體系的2號(hào)寡核苷酸的3’一側(cè)區(qū)域、第2體系的3號(hào)寡核苷酸的5’一側(cè)區(qū)域與第1體系的1號(hào)寡核苷酸的5’一側(cè)區(qū)域分別互補(bǔ)的堿基序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求項(xiàng)3中所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其特征在于，所述探針的堿基序列是使第1體系的1號(hào)寡核苷酸的3’一側(cè)區(qū)域與第2體系的3號(hào)寡核苷酸的3’一側(cè)區(qū)域、第1體系的2號(hào)寡核苷酸的5’一側(cè)區(qū)域與第2體系的3號(hào)寡核苷酸的5’一側(cè)區(qū)域、第1體系的2號(hào)寡核苷酸的3’一側(cè)區(qū)域與第2體系的4號(hào)寡核苷酸的3’一側(cè)區(qū)域、第1體系的1號(hào)寡核苷酸的5’一側(cè)區(qū)域與第2體系的4號(hào)寡核苷酸的5’一側(cè)區(qū)域分別互補(bǔ)的堿基序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求項(xiàng)1～5中任一項(xiàng)所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其特征在于，所述DNA芯片具有結(jié)合了用于捕捉靶基因的基因的支撐體且所述支撐體用的是微板型、載玻片型、微粒型或?qū)щ娦曰逍椭误w。
7.根據(jù)權(quán)利要求項(xiàng)1～6中任一項(xiàng)所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其特征在于，在所述靶基因中用的是單鏈DNA和/或RNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求項(xiàng)1～6中任一項(xiàng)所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其特征在于，在所述靶基因中用的是雙鏈DNA和/或RNA。
9.根據(jù)權(quán)利要求項(xiàng)1～6中任一項(xiàng)所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其特征在于，在所述靶基因用的是SNPs(單堿基多態(tài))。
10.根據(jù)權(quán)利要求項(xiàng)1～9中任一項(xiàng)所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其特征在于，預(yù)先使所述自聚反應(yīng)中所用的寡核苷酸堿基序列為與靶基因互補(bǔ)的序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求項(xiàng)1～9中任一項(xiàng)所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其特征在于，為使所述靶基因與所述自聚體結(jié)合而使用對(duì)于靶基因的堿基序列與自聚體形成中使用的寡核苷酸的堿基序列具有各自互補(bǔ)的區(qū)域的結(jié)合探針。
12.根據(jù)權(quán)利要求項(xiàng)1～11中任一項(xiàng)所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其特征在于，對(duì)于通過(guò)與所述靶基因結(jié)合的寡核苷酸的自聚反應(yīng)形成的自聚體，是使標(biāo)記探針雜交來(lái)檢出自聚體的存在。
13.根據(jù)權(quán)利要求項(xiàng)12中所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其特征在于，所述標(biāo)記探針為用發(fā)色類酶、發(fā)光類酶或放射性同位素標(biāo)記的標(biāo)記探針。
14.根據(jù)權(quán)利要求項(xiàng)1～11中任一項(xiàng)所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其特征在于，對(duì)于所述自聚體是用加入具有與核酸結(jié)合性質(zhì)的熒光物質(zhì)而通過(guò)此熒光物質(zhì)的光化學(xué)變化來(lái)檢出所述自聚體的存在。
15.根據(jù)權(quán)利要求項(xiàng)1～11中任一項(xiàng)所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其特征在于，預(yù)先用熒光物質(zhì)標(biāo)記形成所述自聚體的寡核苷酸并通過(guò)熒光物質(zhì)的光化學(xué)變化來(lái)檢出所述自聚體的存在。
16.根據(jù)權(quán)利要求項(xiàng)1～11中任一項(xiàng)所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其特征在于，預(yù)先用放射性同位素標(biāo)記形成所述自聚體的寡核苷酸并通過(guò)放射性同位素來(lái)檢出所述自聚體的存在。
17.根據(jù)權(quán)利要求項(xiàng)1～11中任一項(xiàng)所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其特征在于，預(yù)先用發(fā)色類酶或發(fā)光類酶標(biāo)記形成所述自聚體的寡核苷酸并通過(guò)光化學(xué)變化來(lái)檢出所述自聚體的存在。
18.根據(jù)權(quán)利要求項(xiàng)1～17中任一項(xiàng)所述的信號(hào)擴(kuò)增方法，其特征在于，所述寡核苷酸是由選自DNA、RNA、PNA或LNA中任一個(gè)的堿基所構(gòu)成。
全文摘要
一種DNA芯片的信號(hào)擴(kuò)增方法，確立了用PALSAR法有效使得在DNA芯片上所捕捉的靶基因的信號(hào)擴(kuò)增，進(jìn)而確立了用PALSAR方法的一對(duì)HCP的設(shè)計(jì)可以簡(jiǎn)便地檢出。利用形成寡核苷酸的2條鏈的有規(guī)則的高級(jí)結(jié)構(gòu)的自聚體的自聚反應(yīng)來(lái)提高DNA芯片中的靶基因的檢出靈敏度。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1464910SQ02802653
公開(kāi)日2003年12月31日 申請(qǐng)日期2002年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月28日
發(fā)明者薄井貢, 三塚真理, 波木井千雅子 申請(qǐng)人:三光純藥株式會(huì)社