專利名稱：一株廣譜蘇云金芽孢桿菌及其制備殺蟲劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及芽孢桿菌，更具體涉及一株廣譜蘇云金芽孢桿菌；本發(fā)明還涉及該蘇云金芽孢桿菌制備殺蟲劑的方法。
本發(fā)明所稱的一株廣譜蘇云金芽孢桿菌已于2002年6月7日在中國(guó)武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，編號(hào)CCTCC NOM202025，名稱蘇云金芽孢桿菌Hcy08-02(Bacillus thuringiensisHcy08-02)。
蘇云金芽孢桿菌Hcy08-02(以下簡(jiǎn)稱菌株Hcy08-02)是由土壤樣品中分離、并以甜菜夜蛾、棉鈴蟲和小菜蛾等鱗翅目害蟲為試蟲，經(jīng)過毒力生物測(cè)定所篩選出的對(duì)多種鱗翅目害蟲有高毒力地菌株。根據(jù)分離該菌株的土壤樣品來源地的名稱和該菌株的編號(hào)命名為Hcy08-02。
背景技術(shù)：
鱗翅目害蟲是主要的農(nóng)、林、果、蔬菜害蟲，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有重大危害。蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑是一種無污染的生物農(nóng)藥，為了擴(kuò)大蘇云金芽孢桿菌的殺蟲譜和提高殺蟲活性，目前國(guó)內(nèi)外均致力于新菌株的分離鑒定和新的殺蟲基因的開發(fā)。在蘇云金芽孢桿菌菌株的分離鑒定、篩選方面，文獻(xiàn)“土壤來源的蘇云金芽孢桿菌的形態(tài)、δ-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)及其毒力特性(微生物學(xué)報(bào)，1992，32(6)387-393)”、“從土壤分離的410株蘇云金芽孢桿菌的鑒定(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，第二期)、“我國(guó)南北方土壤中蘇云金芽孢桿菌的分布及殺蟲特性”(微生物學(xué)報(bào)，1996，36(4)；295-302)、及“上壤來源的五個(gè)蘇云金芽孢桿菌新亞種的鑒定(微生物學(xué)報(bào)，1999，39(2)154-159)等對(duì)我國(guó)蘇云金芽孢桿菌的分離、鑒定、分布特點(diǎn)、晶體蛋白質(zhì)形態(tài)、殺蟲特性等進(jìn)行了研究。在高效、特異性菌株的篩選方面，文獻(xiàn)“對(duì)斜紋夜蛾高毒力的Bt新分離株及其特性的研究(微生物學(xué)通報(bào)，1997，24(5)262-265)”、“對(duì)夜蛾幼蟲高毒力的蘇云金芽孢桿菌菌株及其晶體蛋白質(zhì)特征(中國(guó)生物防治，1997，13(2)82-85)”、及“蘇云金芽孢桿菌對(duì)甜菜夜蛾毒性的篩選(中國(guó)病毒學(xué)，2000，Vol.1598-101)”等分別從眾多的蘇云金芽孢桿菌菌株中篩選到了殺鱗翅目夜蛾科害蟲的高效特異性菌株。但天然廣譜高效的蘇云金芽孢桿菌的分離及應(yīng)用仍很少報(bào)道。Hcy08-02是目前分離得到的一株天然高效廣譜殺鱗翅目害蟲的蘇云金芽孢桿菌，含有多個(gè)殺蟲蛋白質(zhì)編碼基因，對(duì)鱗翅目的棉鈴蟲、小菜蛾、甜菜夜蛾、菜青蟲等害蟲有高效毒殺作用；發(fā)酵性能優(yōu)良，是一株極具開發(fā)、應(yīng)用前景的天然蘇云金芽孢桿菌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，提供一株廣譜蘇云金芽孢桿菌Hcy08-02(Bacillus thuringiensis Hcy08-02)，該菌株有優(yōu)良的發(fā)酵性，含有多個(gè)殺蟲蛋白質(zhì)編碼基因，對(duì)鱗翅目的棉鈴蟲、小菜蛾、甜菜夜蛾、菜青蟲等害蟲具有高效的毒殺作用；本發(fā)明的另一目的是提供該菌株制備殺蟲劑的方法。
為了達(dá)到上述目的，發(fā)明采用如下技術(shù)方案
菌株Hcy08-02是按下列步驟分離得到
(1)將含有菌株Hcy08-02的土壤放入無菌培養(yǎng)皿中；
(2)在培養(yǎng)皿中加入75-85℃的瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后，倒置放入28-30℃恒溫箱中，培養(yǎng)3天，挑選產(chǎn)生伴孢晶體的單菌落；
(3)將單菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在28-30℃、200轉(zhuǎn)/分鐘的搖瓶中發(fā)酵，至伴孢晶體脫落，即為發(fā)酵液；
(4)將發(fā)酵液分別與其重量1000倍、2000倍、4000倍和8000倍的人工飼料混合；
(5)將每種混合物放在3個(gè)養(yǎng)蟲板中，每種混合物的3個(gè)養(yǎng)蟲板分別放入初孵甜菜夜蛾、棉鈴蟲和3齡小菜蛾的試蟲，置于25-28℃恒溫箱中培養(yǎng)3天，進(jìn)行靶標(biāo)昆蟲的生物測(cè)定；
(6)挑選殺蟲效果最佳的菌株，命名為Hcy08-02。
上述(2)中瓊脂培養(yǎng)基為(重量％)
蛋白胨1、牛肉膏0.5、瓊脂2、食鹽0.5、余者為水；其pH值為7.0～7.5。
上述(3)中的發(fā)酵培養(yǎng)基為(重量％)
淀粉4.0、豆餅粉2.4、棉子餅粉1.5、蛋白胨0.5、酵母粉0.4、玉米漿2.0、MgSO47H2O 0.04、KH2PO4 0.2、K2HPO4 0.2、CaCO4 0.1、α-淀粉酶0.01、余者為水；
其pH值為7.5-8.0。
上述(4)中的人工飼料(重量％)為
瓊脂1.5、大豆粉7、酵母粉5、Vc 0.5、苯甲酸鈉0.2、余者為水。
菌株Hcy08-02的特征如下
1.H血清型以Hcy08-02的鞭毛抗原與Bt的標(biāo)準(zhǔn)抗血清進(jìn)行交叉凝集反應(yīng)及交叉吸收凝集反應(yīng)試驗(yàn)，Hcy08-02的H血清型為H7。
2.生化特性按伯杰斯(Barjac)的經(jīng)典方法進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。
蘇云金芽孢桿菌Hcy08-02菌株的生化特征
3.殺蟲晶體蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分析，菌株Hcy08-02產(chǎn)生68-70千道爾頓和130～135千道爾頓兩種殺蟲晶體蛋白質(zhì)。
4.質(zhì)粒菌株Hcy08-02至少含有12個(gè)質(zhì)粒，其中有一個(gè)分子量大于染色體DNA的質(zhì)粒。
5.殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因經(jīng)過PCR檢測(cè)，菌株Hcy08-02的殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因?yàn)閏rylAc、crylAb、crylC、crylAa。
6.殺蟲特性經(jīng)毒力生物測(cè)定，菌株Hcy08-02對(duì)鱗翅目的棉鈴蟲、甜菜夜蛾、小菜蛾、菜青蟲均有較高殺蟲活性。
菌株Hcy08-02制備殺蟲劑的方法按下列步驟順序進(jìn)行
(1)在發(fā)酵罐中配置發(fā)酵培養(yǎng)基(重量％)淀粉4.0、豆餅粉2.4、棉子餅粉1.5、蛋白胨0.5、酵母粉0.4、玉米漿2.0、MgSO47H2O0.04、KH2PO4 0.2、K2HPO4 0.2、CaCO4 0.1、α-淀粉酶0.01、余者為水；
(2)用NaOH將培養(yǎng)基的pH值調(diào)至7.5-8.0；
(3)蒸汽115-120℃滅菌25-30分鐘；
(4)將發(fā)酵培養(yǎng)基重量的0.001-0.005％的菌種放入60℃的溫水中30分鐘，制成孢子懸液；
(5)待培養(yǎng)基的溫度降至37℃時(shí)，把孢子懸液接入發(fā)酵罐中；
(6)在32℃、400轉(zhuǎn)/分、通氣量(立方米/分鐘)與發(fā)酵罐容積比為0.8～1.2∶1的條件下發(fā)酵10小時(shí)；
(7)在29℃、500轉(zhuǎn)/分、通氣量(立方米/分鐘)與發(fā)酵罐容積比為1.0～1.5∶1的條件下發(fā)酵10-14小時(shí)；
(8)在32℃、500轉(zhuǎn)/分、通氣量(立方米/分鐘)與發(fā)酵罐容積比為1.0～1.5∶1的條件下發(fā)酵10-15小時(shí)；
(9)在芽孢脫落50％時(shí)終止發(fā)酵，用HCL將發(fā)酵液的pH值調(diào)至4.5-5.0；
(10)按照常規(guī)方法制備成各種規(guī)格的殺蟲劑。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有殺多種鱗翅目害蟲的特點(diǎn)，擴(kuò)大蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑的使用范圍，降低農(nóng)藥防治費(fèi)用、減少化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的污染，增加農(nóng)作物產(chǎn)量。本發(fā)明的菌株及其制備的殺蟲劑對(duì)人、畜及動(dòng)植物無害，不污染環(huán)境，生產(chǎn)和使用成本低、工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)成熟具有良好的推廣應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式
以下是利用菌株Hcy08-02制備殺蟲劑粉劑的
具體實(shí)施例方式
(1)在3噸的發(fā)酵罐中放入2噸發(fā)酵培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基的配比為(重量％)淀粉4.0、豆餅粉2.4、棉子餅粉1.5、蛋白胨0.5、酵母粉0.4、玉米漿2.0、MgSO47H2O 0.04、KH2PO4 0.2、K2HPO4 0.2、CaCO4 0.1、α-淀粉酶0.01、其余為水；
(2)用NaOH將培養(yǎng)基的pH值調(diào)至7.8；
(3)蒸汽120℃滅菌30分鐘；
(4)將25克的菌種放入60℃的溫水中30分鐘，制成孢子懸液；
(5)待培養(yǎng)基的溫度降至37℃時(shí)，把孢子懸液接入發(fā)酵罐中；
(6)在32℃、400轉(zhuǎn)/分、通氣量2立方米/分鐘的條件下發(fā)酵10小時(shí)；
(7)在29℃、500轉(zhuǎn)/分、通氣量2.5立方米/分鐘的條件下發(fā)酵12小時(shí)；
(8)在32℃、500轉(zhuǎn)/分、通氣量2.5立方米/分鐘的條件下發(fā)酵15小時(shí)；
(9)在芽孢脫落50％時(shí)終止發(fā)酵，用HCL將發(fā)酵液的pH值調(diào)至4.5；
(10)在2噸發(fā)酵液中加入200公斤的輕質(zhì)碳酸鈣、20公斤農(nóng)乳700號(hào)乳化劑、20公斤961粉滲透劑和50公斤食鹽，充分混合；
(11)在噴霧干燥塔中，采用進(jìn)口溫度175℃、出口溫度90℃，將混合液制成殺蟲劑粉劑。
權(quán)利要求
1、一株廣譜蘇云金芽孢桿菌，其特征在于，該菌株名稱為蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)Hcy08-02，CCTCC NO.M202025。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘇云金芽孢桿菌，其特征在于，該菌株有以下特征
(1)H血清型為H7；
(2)生化特征為
(3)產(chǎn)生68～70千道爾頓和130～135千道爾頓兩種殺蟲晶體蛋白質(zhì)；
(4)至少含有12個(gè)質(zhì)粒，其中有一個(gè)分子量大于染色體DNA的質(zhì)粒；
(5)殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因?yàn)閏rylAc、crylAb、crylC、crylAa；
(6)對(duì)鱗翅目的棉鈴蟲、甜菜夜蛾、小菜蛾、菜青蟲均有較高殺蟲活性。
3、用權(quán)利要求1所述的蘇云金芽孢桿菌Hcy08-02制備殺蟲劑的方法，其特征在于，該方法按下列步驟順序進(jìn)行
a、在發(fā)酵罐中放入發(fā)酵培養(yǎng)基；
b、用NaOH將培養(yǎng)基的pH值調(diào)至7.5-8.0；
c、蒸汽115-120℃滅菌25-30分鐘；
d、將發(fā)酵培養(yǎng)基重量的0.001-0.005％的菌種放入60℃的溫水中30分鐘，制成孢子懸液；
e、待培養(yǎng)基的溫度降至37℃時(shí)，把孢子懸液接入發(fā)酵罐中；
f、在32℃、400轉(zhuǎn)/分、每分鐘通氣量與發(fā)酵罐容積比為0.8～1.2∶1的條件下發(fā)酵10小時(shí)；
g、在29℃、500轉(zhuǎn)/分、每分鐘通氣量與發(fā)酵罐容積比為1.0～1.5∶1的條件下發(fā)酵10-14小時(shí)；
h、在32℃、500轉(zhuǎn)/分、每分鐘通氣量與發(fā)酵罐容積比為1.0～1.5∶1的條件下發(fā)酵10-15小時(shí)；
i、在芽孢脫落50％時(shí)終止發(fā)酵，用HCL將發(fā)酵液的pH值調(diào)至4.5-5.0；
j、按照常規(guī)方法制備成各種規(guī)格的殺蟲劑。
4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備殺蟲劑的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基各組份的重量百分比為淀粉4.0、豆餅粉2.4、棉子餅粉1.5、蛋白胨0.5、酵母粉0.4、玉米漿2.0、MgSO47H2O 0.04、KH2PO4 0.2、K2HPO4 0.2、CaCO4 0.1、α-淀粉酶0.01、余者為水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株廣譜蘇云金芽孢桿菌Hcy08－02，在武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，編號(hào)CCTCCNOM202025，該菌株有優(yōu)良的發(fā)酵性，含有多個(gè)殺蟲蛋白質(zhì)編碼基因，對(duì)鱗翅目的棉鈴蟲、小菜蛾、甜菜夜蛾、菜青蟲等害蟲具有高效的毒殺作用。本發(fā)明還公開了該菌株制備殺蟲劑的方法，該殺蟲劑具有殺多種鱗翅目害蟲的特點(diǎn)，擴(kuò)大了蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑的使用范圍，降低農(nóng)藥防治費(fèi)用、減少化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的污染。本發(fā)明的菌株及其制備的殺蟲劑對(duì)人、畜及動(dòng)植物無害，不污染環(huán)境，生產(chǎn)和使用成本低、工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)成熟具有良好的推廣應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1392248SQ0213871
公開日2003年1月22日 申請(qǐng)日期2002年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月26日
發(fā)明者高梅影, 彭可凡, 戴順英 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所