蘇云金芽胞桿菌LTS290、殺蟲(chóng)基因cry57Ab、表達(dá)蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物防治技術(shù)領(lǐng)域，特別是本發(fā)明涉及對(duì)鱗翅目農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)具有高毒力 的Bt殺蟲(chóng)基因及由該基因所編碼的蛋白質(zhì)。
【背景技術(shù)】
[0002] 蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱(chēng)Bt)是一種分布廣泛的革蘭 氏陽(yáng)性細(xì)菌，是一種對(duì)害蟲(chóng)毒力強(qiáng)且對(duì)天敵無(wú)毒性的昆蟲(chóng)病原微生物，對(duì)高等動(dòng)物和人 無(wú)毒性。它是目前研宄最為深入、使用最為廣泛的微生物殺蟲(chóng)劑，對(duì)16個(gè)目3000多種 害蟲(chóng)有活性。Bt在芽胞形成期可形成殺蟲(chóng)晶體蛋白（Insecticidal CrystalProteins， ICPs)，也稱(chēng)S-內(nèi)毒素（delta-endotoxin)，它的形狀、結(jié)構(gòu)和大小均與其毒力有著密切 關(guān)系[Schnepf. E, Crickmore. N, Van Rie. J. , Lereclus. D, Baum. J, Feitelson. J, Zeigler. D.R. , Dean. D. H. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev, 1998, 62(3) :775-806.]。自 1981 年 Schn印f 等克隆了 Bt 的第 一個(gè)ICPs基因，并于1985年發(fā)表了它的DNA堿基序列及其編碼蛋白的氨基酸序列起，目前 (2014年4月）共776個(gè)，其中cry基因738個(gè)，cry模式基因289個(gè)；cyt基因38個(gè)，cyt 模式基因11個(gè)。當(dāng)今，采用噴施化學(xué)農(nóng)藥防治手段固然可以減輕害蟲(chóng)對(duì)農(nóng)作物的為害，但 化學(xué)農(nóng)藥造成環(huán)境污染，長(zhǎng)期以來(lái)，大量噴施化學(xué)殺蟲(chóng)劑，不僅會(huì)增強(qiáng)害蟲(chóng)的抗藥性，使益 蟲(chóng)及其它生態(tài)區(qū)系遭受破壞，而且嚴(yán)重污染環(huán)境，提高生產(chǎn)成本，破壞生態(tài)平衡。蘇云金芽 胞桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白因其殺蟲(chóng)效果好、安全、高效等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛的應(yīng)用于蟲(chóng)害防治。蘇 云金芽胞桿菌除了直接作為生物農(nóng)藥以外，1996年全世界第一例轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物在美國(guó)獲 準(zhǔn)應(yīng)用，它使用的基因來(lái)自Bt crylAc。在接下來(lái)的幾年里，轉(zhuǎn)crylAb基因的抗蟲(chóng)玉米，轉(zhuǎn) cry3Aa基因的抗蟲(chóng)土豆等相距問(wèn)世。在中國(guó)，自1998年開(kāi)始正式推廣含有crylAc/crylAb 基因的抗蟲(chóng)棉以來(lái)，已經(jīng)被普遍種植。在轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化的第一個(gè)12年（1996-2007)中， 由于能得到持續(xù)穩(wěn)定的收益，農(nóng)民種植轉(zhuǎn)基因作物量逐年增加。2013年，27個(gè)國(guó)家的1800 萬(wàn)農(nóng)民種植了 1.752億公頃（4. 33億英畝）的轉(zhuǎn)基因作物，比2012年持續(xù)增長(zhǎng)了 3%，即 500萬(wàn)公頃（1200萬(wàn)英畝）。1800萬(wàn)農(nóng)民從轉(zhuǎn)基因作物中獲益，其中90%為資源匱乏的小農(nóng) 戶(hù)。前五個(gè)種植轉(zhuǎn)基因作物的發(fā)展中國(guó)家是亞洲的中國(guó)和印度、拉丁美洲的巴西和阿根廷 以及非洲的南非，共種植8270萬(wàn)公頃的轉(zhuǎn)基因作物，占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的47%， 并且這五個(gè)國(guó)家的人口約占全球70億人口的41%。中國(guó)750萬(wàn)資源匱乏的小農(nóng)戶(hù)種植了 420萬(wàn)公頃的Bt棉花，采用率為90%，平均每戶(hù)農(nóng)民種植0. 5公頃的Bt棉花。轉(zhuǎn)基因作物 商業(yè)化給工業(yè)化國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家的農(nóng)民都帶來(lái)了經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益。蘇云金芽胞桿菌及其 基因發(fā)掘已成為可持續(xù)發(fā)展農(nóng)業(yè)中重要課題。
[0003] 由于目前商品化的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物的抗蟲(chóng)基因種類(lèi)比較單一，如此大面積推廣種 植存在害蟲(chóng)避難所減少與害蟲(chóng)抗藥性上升的風(fēng)險(xiǎn)。因此需要不斷分離高毒力的或者新的基 因組合來(lái)避免害蟲(chóng)抗藥性上升的風(fēng)險(xiǎn)。因此，篩選分離克隆新的、高毒力的Bt殺蟲(chóng)基因，可 以豐富殺蟲(chóng)基因資源，為轉(zhuǎn)基因作物與工程菌株提供新的基因來(lái)源，提高Bt轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的 抗蟲(chóng)效果，并且可以降低害蟲(chóng)對(duì)Bt毒蛋白的抗性風(fēng)險(xiǎn)，避免新的生態(tài)災(zāi)難降臨，具有重要 的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)小菜蛾，甜菜夜蛾，棉鈴蟲(chóng)等活性的蘇云金芽胞桿 菌LTS290,及其殺蟲(chóng)新基因基因cry57Abl和其晶體殺蟲(chóng)蛋白，以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物和植 物，使之表現(xiàn)出對(duì)相關(guān)害蟲(chóng)的毒性，并克服、延緩害蟲(chóng)對(duì)工程菌和轉(zhuǎn)基因植物的抗藥性產(chǎn) 生。
[0005] 蘇云金芽胞桿菌菌株LTS290,其保藏編號(hào)為：CGMCCNo. 10232。
[0006] 蘇云金芽胞桿菌菌株LTS290在殺滅鱗翅目小菜蛾，甜菜夜蛾，棉鈴蟲(chóng)農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)和 抑制鐮孢菌中的應(yīng)用。
[0007] 殺蟲(chóng)蛋白Cry57Ab，其氨基酸序列如SEQIDNO2所示。
[0008] 殺蟲(chóng)基因cry57Ab，編碼殺蟲(chóng)蛋白Cry57Ab。
[0009] 殺蟲(chóng)基因cry57Ab，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。
[0010] 一種表達(dá)載體，其特征是含有Cry57Abl基因。
[0011] 所述表達(dá)載體為pEB-cry57Ab，其骨架載體為pEB，其結(jié)構(gòu)如圖6所示。
[0012] 一種微生物轉(zhuǎn)化體，其特征是含有cry57Ab基因。
[0013] 殺蟲(chóng)基因cry57Ab在殺滅鱗翅目農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)中的應(yīng)用。
[0014] 所述應(yīng)用是將殺蟲(chóng)基因cry57Ab轉(zhuǎn)化到植物中，使植物表達(dá)對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的抗性， 或者是將殺蟲(chóng)基因cry57Ab表達(dá)的蛋白作為生物殺蟲(chóng)劑的有效成分殺滅農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)。
[0015] 本發(fā)明從黑龍江省五常市拉林鎮(zhèn)附近土壤中分離得到一株蘇云金芽胞桿菌菌株 LTS290,其保藏編號(hào)為CGMCC No. 10232,該菌株生物學(xué)特性為在生長(zhǎng)周期中可以產(chǎn)生芽胞， 并且同時(shí)產(chǎn)生有毒殺鱗翅目害蟲(chóng)小菜蛾，甜菜夜蛾，玉米螟，棉鈴蟲(chóng)的作用和抑制鐮孢菌的 作用的伴胞晶體；從該菌株中得到一個(gè)新基因的陽(yáng)性克隆，即pEB-cry57Ab (見(jiàn)圖6)，對(duì)其 進(jìn)行測(cè)序分析，在NCBI網(wǎng)站上應(yīng)用BLAST并應(yīng)用DNAMAN等生物軟件進(jìn)行分析，分析結(jié)果證 明所克隆的基因是cry57Abl基因，該基因編碼框是由大小為2064bp，編碼687個(gè)氨基酸殘 基，與cry57Aal的氨基酸相似度為90. 2%，所以該基因應(yīng)屬于第三等級(jí)的新基因，經(jīng)國(guó)際 S -內(nèi)毒素命名委員會(huì)正式命名為cry57Abl。
[0016] cry57Abl基因可按生物技術(shù)的常規(guī)方法轉(zhuǎn)化微生物、植物，表現(xiàn)出對(duì)相關(guān)鱗翅目 小菜蛾，甜菜夜蛾，玉米螟，棉鈴蟲(chóng)害蟲(chóng)的毒性。
[0017] 將上述基因轉(zhuǎn)化菌株，表達(dá)得到的蛋白可以制成生物農(nóng)藥用于殺死鱗翅目害蟲(chóng)。 同時(shí)，可以轉(zhuǎn)入植物構(gòu)建抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物，用于害蟲(chóng)的防治。
[0018] 本發(fā)明分離克隆的BtCry57Abl基因序列及其基因表達(dá)產(chǎn)物能夠?qū)[翅目農(nóng)業(yè)害 蟲(chóng)甜菜夜蛾，棉鈴蟲(chóng)無(wú)毒殺作用，而對(duì)小菜蛾、亞洲玉米螟有一定的毒殺力，cry57Abl可擴(kuò) 大對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)的殺蟲(chóng)譜。通過(guò)應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物和植物，使它們表現(xiàn)出對(duì)相關(guān)害蟲(chóng)的毒 性，可克服或延緩昆蟲(chóng)對(duì)工程菌和轉(zhuǎn)基因植物抗藥性的產(chǎn)生。
[0019] 菌株保藏信息：
[0020] 菌種分類(lèi)命名：蘇云金芽胞桿菌（Bacillusthuringiensis)
[0021] 保藏機(jī)構(gòu)：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心
[0022] 保藏日期：2014年12月23日
[0023]保藏編號(hào)：CGMCC No. 10232
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1光學(xué)顯微鏡下觀察菌株LTS290菌體的形態(tài)，
[0025] 其中：A為光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果，B為電鏡下菌株LTS290菌體形態(tài)觀察結(jié)果，
[0026] 圖2Bt LTS290無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯干腐病6種致病鐮孢菌的抑菌作用，
[0027] 圖3Bt菌株LTS290對(duì)燕麥鐮孢菌菌絲的抑制作用，
[0028] 其中A :Bt菌株LTS290對(duì)燕麥鐮孢菌菌絲菌體的抑制作用；B光學(xué)顯微鏡下正常 生長(zhǎng)的菌絲形態(tài)；C光學(xué)顯