專利名稱：蛋白質(zhì)分解物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對試樣中的蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白酶處理制備蛋白質(zhì)分解物的方法。
背景技術(shù)：
以前，為了檢測試樣中的目的蛋白質(zhì)(包括肽)，或者使影響測定的蛋白質(zhì)的功能失活，在各種測定方法中，適用通過蛋白酶分解上述蛋白質(zhì)的方法。
例如，目前正在嘗試通過酶法測定作為糖尿病診斷或治療等的重要指標(biāo)的血細(xì)胞中的糖蛋白，特別是反映生物體血糖值過去歷史的紅細(xì)胞中的糖化血紅蛋白，這時也適用對糖蛋白進(jìn)行蛋白酶分解的方法。在上述酶法中，使果糖基氨基酸氧化酶(以下稱為“FAOD”)對溶血試樣中的糖蛋白的糖化部分作用，產(chǎn)生過氧化氫。該過氧化氫量與上述糖蛋白量相對應(yīng)。然后，向這種FAOD處理后的上述試樣中添加過氧化物酶(以下稱為“POD”)和還原劑，以上述POD作為催化劑，使上述過氧化氫和上述還原劑之間發(fā)生氧化還原反應(yīng)。這時，如果使用通過氧化發(fā)色的發(fā)色性基質(zhì)作為上述還原劑，則可以通過測定其發(fā)色來測定上述過氧化氫量，結(jié)果可以得知試樣中的糖蛋白量。
但是，與糖蛋白或糖肽相比，對上述糖化部分作用的FAOD容易作用于糖化氨基酸或更短的肽片斷。因此，預(yù)先用蛋白酶將糖蛋白分解，使FAOD容易作用于糖化部分，從而提高測定精度。
發(fā)明公開但是，由于蛋白酶具有基質(zhì)特異性，分解活性根據(jù)處理的基質(zhì)而不同，因此存在下述問題，即根據(jù)目的蛋白質(zhì)的種類，分解需要長時間，不能迅速進(jìn)行測定。而且，象上述糖蛋白那樣，目的蛋白質(zhì)被糖化的場合，有時由于其立體位阻等難以分解。基于這種理由，例如在如上所述糖蛋白的測定中，同樣由于預(yù)先進(jìn)行的蛋白酶處理，因而導(dǎo)致整個測定需要較長時間。因此，從用于臨床檢查等領(lǐng)域的觀點出發(fā)，也需要能夠更迅速地測定上述糖蛋白的方法。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種迅速且有效地分解試樣中的蛋白質(zhì)制備蛋白質(zhì)分解物的方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的蛋白質(zhì)分解物的制備方法是在四唑鎓化合物的存在下對含有蛋白質(zhì)的試樣進(jìn)行蛋白酶處理的方法。另外，在本發(fā)明中，上述蛋白質(zhì)也包括肽。
這樣，如果在四唑鎓化合物存在下進(jìn)行蛋白酶處理，能夠迅速分解試樣中的蛋白質(zhì)。
上述四唑鎓化合物是指具有四唑環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物。在本發(fā)明的制備方法中，作為上述四唑鎓化合物，可以使用下述物質(zhì)，優(yōu)選在四唑環(huán)的至少2個部位具有環(huán)結(jié)構(gòu)取代基，特別優(yōu)選2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓鹽。
在本發(fā)明的制備方法中，上述四唑鎓化合物的添加量沒有特別的限定，可以根據(jù)上述蛋白酶的種類和添加量、上述試樣的種類或含有的蛋白質(zhì)的量等適當(dāng)確定。具體而言，每1μL試樣優(yōu)選添加例如上述四唑鎓化合物達(dá)到0.02～10μmol的范圍，更優(yōu)選0.05～2μmol的范圍，特別優(yōu)選0.1～2μmol的范圍。
另外，關(guān)于蛋白酶和四唑鎓化合物的添加比例，相對于1KU蛋白酶，例如為0.001～100μmol的范圍，優(yōu)選0.01～20μmol的范圍，更優(yōu)選0.05～5μmol的范圍。
在本發(fā)明的制備方法中，優(yōu)選在四唑鎓化合物和表面活性劑的存在下進(jìn)行蛋白酶處理。這樣，如果在還有表面活性劑共存的條件下進(jìn)行蛋白酶處理，可以進(jìn)一步促進(jìn)蛋白酶引起的分解，迅速進(jìn)行蛋白質(zhì)的分解。
作為上述表面活性劑，沒有特別的限定，例如可以使用非離子表面活性劑等，具體而言可以例舉聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、脫水山梨醇脂肪酸酯等。其中優(yōu)選聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚。此外，也可以使用月桂基硫酸鈉、脫氧膽酸等。
具體而言，可以使用例如作為聚氧乙烯對叔辛基苯基醚的市售Triton類表面活性劑等、作為聚氧乙烯脫水山梨醇烷基酯的市售Tween類表面活性劑等、作為聚氧乙烯烷基醚的市售Brij類表面活性劑等。此外，也可以使用例如聚氧乙烯(10)月桂基醚、商品名NikkolBL-9EX(聚氧乙烯的重均聚合度N為9，和光純藥工業(yè)社制)等聚氧乙烯(9)月桂基醚、商品名Tergitol NPX(聚氧乙烯的重均聚合度N為約10.5，ナカライテスク社制)以及商品名Tergitol NP-40(聚氧乙烯的重均聚合度N為20，ナカライテスク社制)等聚氧乙烯辛基苯基醚等。
在本發(fā)明的制備方法中，上述表面活性劑的添加量沒有特別的限定，每1mol四唑鎓化合物優(yōu)選例如0.01～300mol的范圍，更優(yōu)選0.05～150mol的范圍，特別優(yōu)選0.2～100mol的范圍。
另外，表面活性劑相對于1μL試樣的添加量優(yōu)選例如0.01～50μmol的范圍，更優(yōu)選0.05～10μmol的范圍。
在本發(fā)明的制備方法中，上述分解的蛋白質(zhì)優(yōu)選為糖蛋白。作為上述糖蛋白，例如糖化血紅蛋白、糖化白蛋白等，其中優(yōu)選糖化血紅蛋白。如果按照本發(fā)明的制備方法制備糖蛋白的分解物，在后述糖蛋白(包括糖肽)的測定方法中，可以迅速地測定上述糖蛋白。
在本發(fā)明的制備方法中，上述蛋白酶沒有特別的限定，可以使用例如絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、金屬蛋白酶等，具體而言優(yōu)選胰蛋白酶、蛋白酶K、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、彈性蛋白酶、氨肽酶等。
另外，上述分解的蛋白質(zhì)是糖化血紅蛋白時，上述蛋白酶是選擇性分解上述糖化血紅蛋白的蛋白酶，優(yōu)選菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、來源于豬胰臟的胰蛋白酶、金屬蛋白酶、來源于枯草桿菌(Bacillussubtillis)的蛋白酶等。作為上述來源于枯草桿菌的蛋白酶，可以例舉商品名蛋白酶N(例如フルカ社制)、商品名蛋白酶N“アマノ”(天野制藥社制)等。作為上述金屬蛋白酶，可以例舉來源于桿菌屬(Bacillus)的金屬蛋白酶(EC3.4.24.4)(例如東洋紡社制，商品名トヨチ-ム)等。其中更優(yōu)選金屬蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶，特別優(yōu)選金屬蛋白酶。這是因為，如果使用選擇性分解的蛋白酶，可以選擇性地制備特定蛋白質(zhì)的分解物。
在本發(fā)明的制備方法中，蛋白酶的添加量可以根據(jù)使用的蛋白酶的種類、分解的蛋白質(zhì)的種類和量等適當(dāng)確定，例如相對于1μL試樣，優(yōu)選10～1000,000U的范圍，更優(yōu)選100～500,000U的范圍，特別優(yōu)選500～200,000U的范圍。
在本發(fā)明的制備方法中，上述試樣沒有特別的限定，除全血、血漿、血清、血細(xì)胞等血液試樣以外，還可以例舉尿、髓液、唾液等生物體試樣，或者果汁等飲料，醬油、調(diào)味汁等食品類等。其中優(yōu)選全血等血液試樣或血細(xì)胞試樣。
其次，本發(fā)明的糖蛋白的測定方法是按照上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)分解物的制備方法，將試樣中的糖蛋白分解，使得到的糖蛋白分解物的糖化部分與FAOD反應(yīng)，通過測定該氧化還原反應(yīng)測定糖蛋白量的方法。另外，糖蛋白與上述同樣包括糖肽。
在四唑鎓化合物非存在下進(jìn)行的現(xiàn)有方法中，為了用蛋白酶將糖蛋白充分分解，使FAOD容易作用于糖化部分，有必要進(jìn)行蛋白酶處理約6～40小時。因此，采用上述酶法測定糖蛋白時，需要長時間，很難說是有用的方法。但是，按照本發(fā)明的測定方法，能夠在短時間內(nèi)分解蛋白質(zhì)，因此能夠迅速進(jìn)行糖蛋白的測定。按照本發(fā)明的測定方法，例如除添加四唑鎓化合物以外，在與現(xiàn)有方法相同的條件下進(jìn)行測定時，與四唑鎓化合物不存在的條件下進(jìn)行測定時相比，可以縮短測定時間約25～1200倍。
在本發(fā)明的制備方法中，上述四唑鎓化合物和上述蛋白酶可以使用與上述同樣的物質(zhì)，其添加量也同樣。
在本發(fā)明的測定方法中，上述糖蛋白可以例舉與上述同樣的物質(zhì)，特別優(yōu)選糖化血紅蛋白。血液中的血紅蛋白濃度較高，為約60～200g/L，而且分解困難，因此蛋白酶處理需要數(shù)小時～數(shù)日，但是采用本發(fā)明的測定方法，例如20秒～2小時的處理成為可能，能夠迅速進(jìn)行糖化血紅蛋白的測定。
在本發(fā)明的測定方法中，上述氧化還原反應(yīng)的測定優(yōu)選測定通過使糖蛋白分解物的糖化部分與FAOD反應(yīng)生成的過氧化氫量。
上述過氧化氫量的測定優(yōu)選使用氧化酶和通過氧化顯色的基質(zhì)(發(fā)色性基質(zhì))進(jìn)行測定。作為上述氧化酶，沒有特別的限定，優(yōu)選POD。作為上述發(fā)色性基質(zhì)，沒有特別的限定，從能夠高靈敏度檢測出發(fā)，例如優(yōu)選N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-二(二甲基氨基)二苯胺鈉(例如商品名DA-64，和光純藥工業(yè)社制)。
在本發(fā)明的測定方法中，上述試樣沒有特別的限定，可以例舉與上述相同的物質(zhì)。
在本發(fā)明的測定方法中，作為上述FAOD，優(yōu)選對下述式(1)表示的反應(yīng)進(jìn)行催化的FAOD。
…(1)在上述式(1)中，R1表示羥基或來源于糖化反應(yīng)前的糖的殘基(糖殘基)。在反應(yīng)前的糖為醛糖時，上述糖殘基(R1)為醛糖殘基，在反應(yīng)前的糖為酮糖時，上述糖殘基(R1)為酮糖殘基。例如，反應(yīng)前的糖為葡萄糖時，由于阿瑪竇利(Amadori)重排，反應(yīng)后的結(jié)構(gòu)采取果糖結(jié)構(gòu)，但這時糖殘基(R1)為葡萄糖殘基(醛糖殘基)。該糖殘基(R1)例如可以用下式表示，n為0～6的整數(shù)。
-〔CH(OH)〕n-CH2OH上述式(1)中，R2沒有特別的限定，例如糖化氨基酸、糖肽或糖蛋白的場合，α-氨基被糖化的場合與除此以外的氨基被糖化的場合不同。
上述式(1)中，α-氨基被糖化的場合，R2為下述式(2)表示的氨基酸殘基或肽殘基。
-CHR3-CO-R4…(2)上述式(2)中，R3表示氨基酸側(cè)鏈基。另外，R4表示羥基、氨基酸殘基或肽殘基，例如可以用下述式(3)表示。下述式(3)中，n為0以上的整數(shù)，R3與上述同樣表示氨基酸側(cè)鏈基。
-(NH-CHR3-CO)n-OH…(3)另外，上述式(1)中，α-氨基以外的氨基被糖化(氨基酸側(cè)鏈基被糖化)的場合，R2可以用下述式(4)表示。
-R5-CH(NH-R6)-CO-R7…(4)上述式(4)中，R5表示氨基酸側(cè)鏈基中被糖化的氨基以外的部分。例如被糖化的氨基酸為賴氨酸時，R5為下述基團(tuán)，-CH2-CH2-CH2-CH2-被糖化的氨基酸為精氨酸時，R5為下述基團(tuán)。
-CH2-CH2-CH2-NH-CH(NH2)-另外，上述式(4)中，R6為氫、氨基酸殘基或肽殘基，例如可以用下述式(5)表示。另外，下述式(5)中，n為0以上的整數(shù)，R3與上述同樣表示氨基酸側(cè)鏈基。
-(CO-CHR3-NH)n-H…(5)
另外，上述式(4)中，R7為羥基、氨基酸殘基或肽殘基，例如可以用下述式(6)表示。另外，下述式(6)中，n為0以上的整數(shù)，R3與上述同樣表示氨基酸側(cè)鏈基。
-(NH-CHR3-CO)n-OH …(6)發(fā)明的最佳實施方式本發(fā)明的制備方法中使用的四唑鎓化合物優(yōu)選四唑環(huán)的至少2個部位具有環(huán)結(jié)構(gòu)取代基，更優(yōu)選3個部位具有環(huán)結(jié)構(gòu)取代基。
上述四唑鎓化合物如上所述在上述四唑環(huán)的至少2個部位具有環(huán)結(jié)構(gòu)取代基時，優(yōu)選在上述四唑環(huán)的2位和3位具有上述取代基。另外，四唑鎓化合物在3個部位具有環(huán)結(jié)構(gòu)取代基時，優(yōu)選在上述四唑環(huán)的2位、3位和5位具有上述取代基。
上述四唑鎓化合物的至少2個環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的環(huán)結(jié)構(gòu)優(yōu)選為苯環(huán)。另外，作為苯環(huán)以外的環(huán)結(jié)構(gòu)取代基，可以例舉環(huán)骨架中含有S或O且為共振結(jié)構(gòu)的取代基，例如噻吩基、噻唑基等。
上述四唑鎓化合物優(yōu)選在四唑環(huán)的至少3個部位具有環(huán)結(jié)構(gòu)取代基，且上述環(huán)結(jié)構(gòu)取代基中至少2個環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的環(huán)結(jié)構(gòu)為苯環(huán)。
優(yōu)選上述四唑鎓化合物的至少1個環(huán)結(jié)構(gòu)取代基具有官能團(tuán)，更優(yōu)選上述官能團(tuán)的數(shù)目較多。
作為上述官能團(tuán)，優(yōu)選吸電子性官能團(tuán)，例如鹵素基團(tuán)、醚基、酯基、羧基、?；?、亞硝基、硝基、羥基、磺基等。除此之外，還可以例舉氫過氧基、氧基、環(huán)氧基、環(huán)二氧基、酮基等含有氧的特性基團(tuán)，巰基、烷硫基、甲硫基甲基、硫代基團(tuán)、亞磺基、苯磺?；?、苯基磺?；妆交酋；?、對甲苯基磺?；?、甲苯磺?；被酋；?、異硫氰酸酯基等含有硫的特性基團(tuán)等。這些吸電子性官能團(tuán)中優(yōu)選硝基、磺基、鹵素基團(tuán)、羧基、羥基、甲氧基、乙氧基。另外，除上述吸電子性官能團(tuán)以外，還可以例舉苯基(C6H5-)、苯乙烯基(C6H5CH＝CH-)等不飽和烴基等。另外，上述官能團(tuán)也可以通過解離進(jìn)行離子化。
上述四唑鎓化合物優(yōu)選在四唑環(huán)的2位和3位具有苯環(huán)，且上述苯環(huán)中至少一個具有選自鹵素基團(tuán)、羧基、硝基、羥基、磺基、甲氧基和乙氧基的至少一個官能團(tuán)。另外，也可以是上述兩個苯環(huán)具有上述官能團(tuán)。在上述苯環(huán)中，可以在任何位置(ortho-、meta-、para-)具有上述官能團(tuán)。另外，官能團(tuán)的數(shù)目沒有特別的限定，可以具有相同的官能團(tuán)，也可以具有不同的官能團(tuán)。
上述四唑鎓化合物作為例如在上述四唑環(huán)的2位、3位和5位具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的化合物，可以例舉2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓鹽、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓鹽、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓鹽、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓鹽、3，3’-(1，1’-聯(lián)苯-4，4’-二基)-二(2，5-二苯基)-2H-四唑鎓鹽、3，3’-〔3，3’-二甲氧基-(1，1’-聯(lián)苯)-4，4’-二基〕-二〔2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓鹽〕、2，3-二苯基-5-(4-氯苯基)四唑鎓鹽、2，5-二苯基-3-(對二苯基)四唑鎓鹽(2，5-diphenyl-3-(p-diphenyl)tetrazolium salt)、2，3-二苯基-5-(對二苯基)四唑鎓鹽、2，5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑鎓鹽、2，5-二苯基-3-(間甲苯基)四唑鎓鹽以及2，5-二苯基-3-(對甲苯基)四唑鎓鹽等。
另外，上述四唑鎓化合物并不限于上述化合物，此外也可以使用在上述四唑環(huán)的2個部位具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)取代基并在1個部位具有其它環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的化合物，例如2，3-二苯基-5-(2-噻吩基)四唑鎓鹽、2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-〔4-(2-磺基乙基氨基甲?；?苯基〕-2H-四唑鎓鹽、2，2’-二苯并噻唑基-5，5’-二〔4-二(2-磺基乙基)氨基甲酰基苯基〕-3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’-亞聯(lián)苯基)二四唑鎓鹽和3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓鹽等。
另外，也可以使用在上述四唑環(huán)的2個部位具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)取代基并在1個部位具有非環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的四唑鎓化合物，例如2，3-二苯基-5-氰基四唑鎓鹽、2，3-二苯基-5-羧基四唑鎓鹽、2，3-二苯基-5-甲基四唑鎓鹽、2，3-二苯基-5-乙基四唑鎓鹽等。
在上述四唑鎓化合物中，如上所述優(yōu)選具有3個環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的化合物，更優(yōu)選具有3個環(huán)結(jié)構(gòu)為苯環(huán)的取代基，且具有多個吸電子性官能團(tuán)的化合物，特別優(yōu)選2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓鹽。這種四唑鎓化合物例如可以是鹽，也可以呈離子化的狀態(tài)等。另外，四唑鎓化合物可以為1種，也可以2種以上同時使用。
關(guān)于本發(fā)明的蛋白質(zhì)分解物的制備方法，以分解血細(xì)胞中的糖蛋白為例進(jìn)行說明。
首先，將全血直接溶血，或者采用離心分離等常規(guī)方法由全血分離血細(xì)胞級分并將其溶血，制備溶血試樣。該溶血方法沒有特別的限定，例如可以采用使用表面活性劑的方法、利用超聲波的方法、利用滲透壓差的方法等，其中優(yōu)選上述使用表面活性劑的方法。
作為溶血用表面活性劑，沒有特別的限定，可以使用例如聚氧乙烯對叔辛基苯基醚(Triton類表面活性劑等)、聚氧乙烯脫水山梨醇烷基酯(Tween類表面活性劑等)、聚氧乙烯烷基醚(Brij類表面活性劑等)等非離子表面活性劑，具體而言例如商品名TritonX-100、商品名Tween-20、商品名Brij35等。關(guān)于利用上述表面活性劑進(jìn)行處理的條件，通常在處理溶液中的血細(xì)胞濃度為1～10體積％的場合，可以添加上述表面活性劑達(dá)到上述處理溶液中的濃度為0.1～1重量％，在室溫下攪拌5秒～1分鐘。
另外，上述利用滲透壓差的場合，例如相對于全血的體積添加2～100倍體積量的蒸餾水可以溶血。
其次，在上述四唑鎓化合物存在下對上述溶血試樣進(jìn)行上述蛋白酶處理。從而得到糖蛋白分解物。
上述蛋白酶處理通常在緩沖液中進(jìn)行。上述緩沖液的種類沒有特別的限定，例如可以使用Tris鹽酸緩沖液、EPPS緩沖液、PIPES緩沖液、磷酸緩沖液、ADA緩沖液、枸櫞酸緩沖液、醋酸緩沖液、甘氨酰胺緩沖液、CHES緩沖液等，其pH優(yōu)選pH5～12的范圍，更優(yōu)選6～10的范圍，特別優(yōu)選7～9的范圍。
關(guān)于上述蛋白酶的添加量，例如前處理溶液中的血細(xì)胞濃度為0.1～10體積％的場合，優(yōu)選添加蛋白酶達(dá)到0.1～100g/升的范圍，更優(yōu)選0.3～50g/升的范圍，特別優(yōu)選0.5～20g/升的范圍。
另外，分解對象蛋白質(zhì)為糖化血紅蛋白時，蛋白酶如上所述是選擇性分解糖化血紅蛋白的蛋白酶，上述蛋白酶優(yōu)選菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、來源于豬胰臟的胰蛋白酶、金屬蛋白酶、來源于枯草桿菌的蛋白酶。關(guān)于這些蛋白酶的添加比例，例如前處理溶液中的血細(xì)胞濃度為0.1～10體積％的場合，優(yōu)選添加蛋白酶達(dá)到0.1～50g/升的范圍，更優(yōu)選0.3～30g/升的范圍，特別優(yōu)選1～20g/升的范圍。具體而言，蛋白酶為金屬蛋白酶的場合，優(yōu)選向血細(xì)胞濃度0.3～5體積％的前處理溶液中添加至0.1～30g/升的范圍，更優(yōu)選0.3～20g/升的范圍，特別優(yōu)選1～10g/升的范圍。
關(guān)于上述四唑鎓化合物的添加比例，例如前處理溶液中血細(xì)胞濃度為0.1～10體積％的場合，優(yōu)選添加至濃度達(dá)到0.1～50mmol/升的范圍，更優(yōu)選0.2～20mmol/升的范圍，特別優(yōu)選0.3～10mmol/升的范圍。具體而言，上述四唑鎓化合物為2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓鹽，且前處理溶液中的血細(xì)胞濃度為0.1～10體積％的場合，優(yōu)選添加至濃度達(dá)到0.3～15mmol/升的范圍，更優(yōu)選0.5～15mmol/升的范圍，特別優(yōu)選1～10mmol/升的范圍。
上述四唑鎓化合物可以直接使用，從操作的簡便性和處理效率等觀點出發(fā)，優(yōu)選制成溶解于溶劑中得到的四唑鎓化合物溶液使用。上述溶液的濃度可以根據(jù)四唑鎓化合物的種類(例如分子量等)等適當(dāng)確定，例如為0.01～120mmol/升的范圍，優(yōu)選0.1～50mmol/升的范圍，更優(yōu)選0.2～20mmol/升的范圍。作為上述溶劑，例如可以使用蒸餾水、生理鹽水、緩沖液等，作為上述緩沖液，可以使用例如前述的緩沖液等。另外，上述四唑鎓化合物可以使用1種，也可以2種以上同時使用。
上述四唑鎓化合物存在下的蛋白酶處理的條件沒有特別的限定，例如溫度為10～37℃的范圍，處理時間為30秒～60分鐘的范圍，優(yōu)選溫度為20～37℃的范圍，處理時間為30秒～10分鐘的范圍，更優(yōu)選溫度為25～37℃的范圍，處理時間為30秒～5分鐘的范圍。
如果如上所述在四唑鎓化合物存在下對試樣進(jìn)行蛋白酶處理，則可以促進(jìn)試樣中糖蛋白的分解。因此，可以在短時間內(nèi)且以優(yōu)良的分解效率得到糖蛋白的分解物。
另外，如果不僅存在上述四唑鎓化合物，而是在四唑鎓化合物與表面活性劑共存的條件下進(jìn)行該蛋白酶處理，則可以進(jìn)一步促進(jìn)蛋白酶引起的分解。
表面活性劑的添加量沒有特別的限定，例如在前處理溶液中血細(xì)胞濃度為0.3～5體積％的場合，優(yōu)選添加至濃度達(dá)到0.1～500mmol/升的范圍，更優(yōu)選0.5～150mmol/升的范圍，特別優(yōu)選1～100mmol/升的范圍。具體而言，上述表面活性劑為商品名TritonX-100的場合，優(yōu)選添加至濃度達(dá)到0.2～400mmol/升的范圍，更優(yōu)選1～150mmol/升的范圍，特別優(yōu)選2～100mmol/升的范圍。另外，商品名Brij35的場合，優(yōu)選添加至濃度達(dá)到0.1～200mmol/升的范圍，更優(yōu)選0.5～10mmol/升的范圍，特別優(yōu)選1～50mmol/升的范圍。
另外，上述表面活性劑相對于上述四唑鎓化合物1mmol，可以添加至0.01～300mmol的范圍，優(yōu)選0.05～150mmol的范圍，更優(yōu)選0.2～100mmol的范圍。
具體而言，上述表面活性劑為商品名TritonX-100的場合，相對于四唑鎓化合物1.5mmol，優(yōu)選添加至0.2～400mmol的范圍，更優(yōu)選1～150mmol的范圍，特別優(yōu)選2～100mmol的范圍。另外，商品名Brij35的場合，相對于四唑鎓化合物1.5mmol，優(yōu)選添加至0.1～200mmol的范圍，更優(yōu)選0.5～150mmol的范圍，特別優(yōu)選1～50mmol的范圍。
另外，如上所述通過表面活性劑處理進(jìn)行試樣的溶血處理時，也可以預(yù)先在溶血步驟中添加表面活性劑，使之在預(yù)處理中達(dá)到必要的濃度。
其次，關(guān)于本發(fā)明的糖蛋白的測定方法，以測定血細(xì)胞中的糖蛋白量為例進(jìn)行說明。
首先，與上述同樣由全血試樣或血細(xì)胞試樣制備溶血試樣。接著，與上述同樣在四唑鎓化合物存在下對上述溶血試樣進(jìn)行蛋白酶處理，制備糖蛋白的分解物。這樣用蛋白酶處理糖蛋白是由于如上所述與糖蛋白相比，在后處理中使用的FAOD容易作用于糖化氨基酸或較短的糖肽片斷，因而進(jìn)行分解使之容易作用于糖化部分。如上所述，如果在四唑鎓化合物存在下進(jìn)行蛋白酶處理，則能夠在短時間內(nèi)且以高分解效率分解糖蛋白，因此即使蛋白酶處理時間短，F(xiàn)AOD也能充分作用于糖化部分。另外，也可以在四唑鎓化合物和表面活性劑的存在下進(jìn)行處理，因為這樣可以進(jìn)一步促進(jìn)分解。
接著，對通過上述蛋白酶處理得到的分解物用上述FAOD進(jìn)行處理。通過這種FAOD處理，可以催化上述式(1)表示的反應(yīng)。
該FAOD處理與上述蛋白酶處理同樣優(yōu)選在緩沖液中進(jìn)行。其處理條件可以根據(jù)使用的FAOD的種類、作為測定對象物的糖蛋白的種類及其濃度等適當(dāng)確定。
具體而言，例如反應(yīng)液中的FAOD濃度為50～50,000U/升，反應(yīng)液中的血細(xì)胞濃度為0.01～1體積％，反應(yīng)溫度為15～37℃，反應(yīng)時間為1～60分鐘，pH為6～9的范圍。上述緩沖液的種類也沒有特別的限定，可以使用與上述蛋白酶處理同樣的緩沖液。
接著，使用POD和上述發(fā)色性基質(zhì)，通過氧化還原反應(yīng)測定上述FAOD處理生成的過氧化氫。
作為上述發(fā)色性基質(zhì)，可以例舉N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-二(二甲基氨基)二苯基胺鈉、鄰苯二胺(OPD)、トリンダ-試劑和4-氨基安替比林組合而成的基質(zhì)等。作為上述トリンダ-試劑，例如苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等。另外，除上述4-氨基安替比林以外，也可以使用氨基安替比林衍生物、香蘭素二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑啉酮腙(SMBTH)等。這些發(fā)色性基質(zhì)中，如上所述特別優(yōu)選N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-二(二甲基氨基)二苯基胺鈉。
上述氧化還原反應(yīng)通常在緩沖液中進(jìn)行，其條件可以根據(jù)上述生成的過氧化氫的濃度等適當(dāng)確定。通常，反應(yīng)液中的POD濃度為10～20,000IU/升，發(fā)色性基質(zhì)濃度為0.001～1mmol/l，反應(yīng)溫度為20～37℃，反應(yīng)時間為1～5分鐘，pH為6～9。另外，上述緩沖液沒有特別的限定，例如可以使用與上述蛋白酶處理和FAOD處理等同樣的緩沖液等。
在上述氧化還原反應(yīng)中，例如使用上述發(fā)色性基質(zhì)的場合，用分光光度計測定上述反應(yīng)液的顯色程度(吸光度)，從而可以測定過氧化氫的量。而且，可以使用該過氧化氫濃度與標(biāo)準(zhǔn)曲線等，求出試樣中的糖蛋白量。
另外，除上述使用POD等的酶法以外，也可以通過例如電的方法測定上述過氧化氫量。
按照這種本發(fā)明的測定方法，能夠如上所述迅速進(jìn)行測定。另外，按照現(xiàn)有方法，如果縮短蛋白酶處理的時間，恐怕測定精度會降低，但是按照本發(fā)明的測定方法，則可以在短時間內(nèi)以優(yōu)良的精度進(jìn)行測定。
實施例以下，對于實施例結(jié)合比較例進(jìn)行說明。
(實施例1、比較例1)該實施例是在四唑鎓化合物存在下對血紅蛋白(Hb)進(jìn)行蛋白酶處理，測定其分解物的糖化物量，考察Hb的分解程度的實例。使用的試樣、試劑和方法如下所示。
(Hb的制備)采集健康正常人的全血，用0.9重量％NaCl水溶液洗滌3～5次。用蒸餾水將血細(xì)胞稀釋5倍(體積)，使之溶血，離心分離(7000g，30分鐘)，回收上清液(溶血試樣)(約75～200mL)。用20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)500mL使陽離子交換凝膠(商品名POROS HS/50，アプライドバイオシステムズ社制)約30g膨潤，向其中加入上述上清液，攪拌，使之吸附Hb。靜置約60分鐘后，用直徑95mm的桐山漏斗過濾，用上述磷酸鈉緩沖液洗滌回收的凝膠，直到濾液透明。接著，用50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)洗脫，回收洗脫級分(約300～400ml)，以其作為純化Hb試樣。另外，上述試樣的Hb濃度按照常規(guī)方法(例如SLS法等)進(jìn)行測定，保存溫度為-80℃。
(蛋白酶溶液)將商品名蛋白酶K(和光純藥工業(yè)社制)、商品名トヨチ-ム(東洋紡社制)、商品名蛋白酶Nアマノ(天野制藥社制)、商品名木瓜蛋白酶(ロシユ社制)分別溶解于蒸餾水中，配制各蛋白酶溶液(2g/L)。
(WST-3溶液以下相同)將作為四唑鎓化合物的下式(7)表示的2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓一鈉鹽(商品名WST-3，同仁化學(xué)研究所社制)溶解于蒸餾水中，使?jié)舛冗_(dá)到5mM，進(jìn)行配制。 (緩沖液)80mM甘氨酸-鈉緩沖液(pH10、pH11)(蛋白酶反應(yīng)液的組成)實施例1 比較例1 終濃度純化Hb試樣 50μl50μl 1.87mg/ml蒸餾水 250μl 350μl-緩沖液 50μl50μl 8.0mM蛋白酶溶液 50μ150μl 0.2g/LWST-3溶液100μl - 1.7mM合計液量 500μl 500μl(試劑A)POD(東洋紡績社制，以下相同) 20KU/L商品名DA-64(和光純藥工業(yè)社制) 40μmol/L磷酸鉀緩沖液(KPB)pH7.00.1mol/L(試劑B)FAOD(旭化成社制) 14.6KU/LKPB 0.1mol/L(方法)使用上述各種蛋白酶，將蛋白酶反應(yīng)溶液混合達(dá)到上述組成，在37℃下開始反應(yīng)，反應(yīng)給定的時間(0分鐘、10分鐘、30分鐘和60分鐘)后，用冰冷卻反應(yīng)溶液，使反應(yīng)停止。用超濾膜(分級分子量10000、7000G、60分鐘、4℃)處理這些反應(yīng)溶液，回收濾液。
接著，向上述濾液25μl中添加上述試劑A 45μl，5分鐘后，再添加上述試劑B 20μl。然后，以添加上述試劑B時為0分鐘，用生物化學(xué)自動分析裝置(商品名JCA BM-8，日本電子社制)測定3分鐘后的吸光度的增加。測定波長為主波長751nm、副波長884nm。WST-3存在下的實施例1的吸光度如下述表1所示。以反應(yīng)開始0分鐘的吸光度為0.000。另外，作為比較例1，如上述反應(yīng)液組成所示除了添加蒸餾水代替WST-3以外，與上述實施例1同樣進(jìn)行處理，測定吸光度。
(表1)蛋白酶反応液 蛋白酶處理時間的pH 10分鐘 30分鐘 60分鐘蛋白酶K 100.022--110.0110.018-トヨチ一ム100.0040.0070.010110.0020.0040.004蛋白酶Nアマノ 100.0030.0110.017110.0040.0040.005木瓜蛋白酶100.0000.0020.004在比較例1中，即使進(jìn)行蛋白酶處理60分鐘，也不能確認(rèn)吸光度的增加(吸光度0.00)，蛋白酶處理3～6小時后才勉強見到吸光度的增加(0.000～0.004)。與此相對，在WST-3存在下進(jìn)行蛋白酶處理的實施例1中，Hb經(jīng)過10～60分鐘的蛋白酶處理而被分解，因此如上述表1所示可以確認(rèn)吸光度隨時間的經(jīng)過增加。
(實施例2)該實施例是進(jìn)一步在WST-3和表面活性劑存在下對血紅蛋白進(jìn)行蛋白酶處理，考察其分解程度的實例。以下，說明使用的試樣、試劑和方法。除了特殊說明以外，與上述實施例1同樣進(jìn)行。
(表面活性劑溶液)將商品名TritonX-100(和光純藥工業(yè)社制)和商品名Brij35(Sigma社制)添加到蒸餾水中達(dá)到0.3重量％，進(jìn)行配制。
除了將蒸餾水250μl更換為上述表面活性劑溶液250μl以外，與上述實施例1同樣進(jìn)行蛋白酶反應(yīng)(表面活性劑的終濃度為0.15重量％)，同樣測定吸光度。在WST-3和TritonX-100存在下處理時的結(jié)果如下述表2所示，在WST-3和Brij35存在下處理時的結(jié)果如下述表3所示。
(表2)(WST-3和TritonX-100)蛋白酶 反応液蛋白酶處理時間的pH 10分鐘 30分鐘 60分鐘蛋白酶K 11 0.0200.0210.019トヨチ一ム 10 0.0140.0180.020蛋白酶Nアマノ 10 0.0210.0220.022木瓜蛋白酶 10 0.0030.0050.005(表3)(WST-3和Brij35)蛋白酶 反応液 蛋白酶處理時間的pH 10分鐘 30分鐘 60分鐘蛋白酶K 11 0.0230.0210.021トヨチ一ム 10 0.0120.0150.016蛋白酶Nアマノ 10 0.0180.0180.020如上述表2和表3所示，在WST-3存在下進(jìn)行蛋白酶處理時通過同時使用表面活性劑，可以見到比上述表1所示的實施例1的吸光度更高的吸光度增加。另外，見不到吸光度從0.020附近增加，認(rèn)為這是因為反應(yīng)已經(jīng)結(jié)束。
由此可以得知，如果在WST-3存在下進(jìn)行蛋白質(zhì)的蛋白酶處理，則能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)的分解，因此可以在短時間內(nèi)且以高分解效率分解蛋白質(zhì)。另外，通過進(jìn)一步同時使用表面活性劑，可以進(jìn)一步促進(jìn)蛋白酶處理。
工業(yè)實用性如上所述，本發(fā)明的蛋白質(zhì)分解物的制備方法通過在四唑鎓化合物存在下對試樣進(jìn)行蛋白酶處理，能夠迅速分解試樣中的蛋白質(zhì)。因此，按照適用該制備方法的本發(fā)明的糖蛋白的測定方法，能夠迅速進(jìn)行例如糖尿病診斷中重要的紅細(xì)胞中糖化血紅蛋白等的測定。
權(quán)利要求
1.蛋白質(zhì)分解物的制備方法，在四唑鎓化合物的存在下對含有蛋白質(zhì)的試樣進(jìn)行蛋白酶處理。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，四唑鎓化合物在四唑環(huán)的2位和3位具有苯環(huán)，且上述苯環(huán)中至少一個具有選自鹵素基團(tuán)、羧基、硝基、羥基、磺基、甲氧基和乙氧基中的至少一個官能團(tuán)。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，四唑鎓化合物是2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓鹽。
4.如權(quán)利要求1所述的測定方法，四唑鎓化合物的添加量為每1μL試樣添加0.02～10μmol的范圍。
5.如權(quán)利要求1所述的測定方法，蛋白酶的添加量為每1μL試樣添加10～1000,000U的范圍。
6.如權(quán)利要求1所述的測定方法，四唑鎓化合物的添加量為每1KU蛋白酶添加0.001～100μmol的范圍。
7.如權(quán)利要求1所述的制備方法，在四唑鎓化合物和表面活性劑的存在下進(jìn)行蛋白酶處理。
8.如權(quán)利要求7所述的制備方法，表面活性劑為非離子表面活性劑。
9.如權(quán)利要求8所述的制備方法，非離子表面活性劑是選自聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和脫水山梨醇脂肪酸酯的至少一種表面活性劑。
10.如權(quán)利要求7所述的制備方法，表面活性劑的添加量為每1mmol四唑鎓化合物添加0.01～300mmol的范圍。
11.如權(quán)利要求7所述的制備方法，表面活性劑的添加量為每1μL試樣添加0.01～50μmol。
12.如權(quán)利要求1所述的制備方法，蛋白酶是選自胰蛋白酶、蛋白酶K、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、彈性蛋白酶和氨肽酶的至少一種。
13.如權(quán)利要求1所述的制備方法，蛋白酶是選擇性分解糖化血紅蛋白的蛋白酶中，選自菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、來源于豬胰臟的胰蛋白酶、金屬蛋白酶、來源于枯草桿菌的蛋白酶的至少一種蛋白酶。
14.如權(quán)利要求1所述的制備方法，分解的蛋白質(zhì)為糖蛋白。
15.如權(quán)利要求14所述的制備方法，糖蛋白為糖化血紅蛋白。
16.如權(quán)利要求1所述的制備方法，試樣為全血。
17.如權(quán)利要求1所述的制備方法，試樣為含有紅細(xì)胞的試樣。
18.糖蛋白的測定方法，按照權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)分解物的制備方法，將試樣中的糖蛋白分解，使得到的糖蛋白分解物的糖化部分與果糖基氨基酸氧化酶反應(yīng)，通過測定該氧化還原反應(yīng)測定糖蛋白的量。
19.如權(quán)利要求18所述的測定方法，氧化還原反應(yīng)的測定是測定通過使糖蛋白分解物與果糖基氨基酸氧化酶反應(yīng)生成的過氧化氫的量。
20.如權(quán)利要求19所述的測定方法，過氧化氫的測定是使用過氧化氫與通過氧化顯色的基質(zhì)進(jìn)行的測定。
21.如權(quán)利要求20所述的測定方法，過氧化氫的測定是使用氧化酶使過氧化氫與基質(zhì)反應(yīng)，測定顯色的上述基質(zhì)的吸光度。
全文摘要
提供一種能夠迅速且有效分解試樣中蛋白質(zhì)(包括肽)的蛋白質(zhì)分解物的制備方法。通過在四唑鎓化合物的存在下，對含有蛋白質(zhì)的試樣進(jìn)行蛋白酶處理，制備蛋白質(zhì)分解物。另外，使按照這種蛋白質(zhì)分解物的制備方法得到的糖蛋白分解物的糖化部分與果糖基氨基酸氧化酶反應(yīng)，通過測定該氧化還原反應(yīng)，可以迅速測定糖蛋白量。作為上述四唑鎓化合物，可以使用2－(4－碘苯基)－3－(2，4－二硝基苯基)－5－(2，4－二磺基苯基)－2H－四唑鎓鹽等。
文檔編號C12Q1/37GK1466631SQ01816493
公開日2004年1月7日 申請日期2001年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月28日
發(fā)明者八木雅之, 石丸香 申請人:愛科來株式會社