專利名稱：一種重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子的質(zhì)粒載體、其宿主及制備重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子或其等位變異體的質(zhì)粒載體，具體地說涉及一種重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子及其變異體的雙順反子表達(dá)質(zhì)粒。
本發(fā)明還涉及由本發(fā)明質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及制備重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子及其變異體的方法。
KGF在皮膚損傷后的組織修復(fù)過程中起重要作用。在傷口愈合時，KGFmRNA在基底角質(zhì)細(xì)胞中的誘生160倍，而aFGF、bFGF和FGF-5僅誘生2到10倍，而FGF-3、FGF-4、FGF-6無論是在正常的還是在損傷的皮膚中都沒有表達(dá)。在一豬的皮膚損傷模型上，KGF能顯著促進(jìn)皮膚再生。
KGF的變異體，這些變異體如N端缺失23個氨基酸的KGF，具有天然KGF的生物學(xué)活性，其生物學(xué)活性甚至比天然的KGF還高，在專利US patent5843883中做了詳盡的描述。
基于KGF的生物學(xué)作用，KGF可望應(yīng)用于治療或預(yù)防放化療引起的消化道損傷，以及其他形式的消化道黏膜病損及其他疾病。
目前制備KGF的方法是采用基因工程方法。公開的PCT專利申請WO90/108771描述了從人胚胎成纖維的細(xì)胞條件培養(yǎng)基中純化KGF，分離的多肽之部分氨基酸測序，該基因的克隆及在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)以得到重組的具生物學(xué)活性的KGF。公開的PCT專利申請WO96/11951描述了KGF蛋白的新型類似物，以及這些新型類似物基因的克隆及在大腸桿菌(E.coli)中的表達(dá)。
在大腸桿菌中表達(dá)人KGF及其變異體，因表達(dá)產(chǎn)物對大腸桿菌有毒性(Ron et al，J.Biol.Chem.268(4)2984-2988)，表達(dá)出的KGF及其變異體在菌體中累積不多，且必須通過嚴(yán)格控制基礎(chǔ)表達(dá)來控制雜菌的產(chǎn)生從而獲得表達(dá)。Ron等用T7啟動子表達(dá)KGF及其變異體，用BL21(DE3)pLysE菌株作為宿主菌以降低基礎(chǔ)表達(dá)。相對其它的啟動子，T7啟動子啟動轉(zhuǎn)錄的能力最強(qiáng)，而且BL21(DE3)宿主菌對毒性蛋白的耐受性也比較好，BL21(DE3)還是一種蛋白酶缺陷型菌株，但所獲得的KGF或KGF變異體的表達(dá)量也只占總蛋白的2％以下(Ron et al，J.Biol.Chem.268(4)2984-2988)。US patent9513075中描述的表達(dá)方法用的是低基礎(chǔ)表達(dá)的PL啟動子，所用的表達(dá)質(zhì)粒在低溫(30℃)培養(yǎng)時拷貝數(shù)非常低，從而進(jìn)一步降低了基礎(chǔ)表達(dá)。US patent5707805描述了用trk啟動子表達(dá)KGF，這種啟動子的基礎(chǔ)表達(dá)相對較高，但所用的表達(dá)質(zhì)粒pKK233-2是一種低拷貝數(shù)的質(zhì)粒從而在一定程度上降低了基礎(chǔ)表達(dá)。
本發(fā)明的另一目的是提供了由上述的表達(dá)重組人KGF或其變異體的重組質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的再一目的是提供一種利用銅離子在大腸桿菌中表達(dá)重組人KGF或其變異體的方法，該方法包括在含有1-10mM的培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠表達(dá)人KGF或其變異體的大腸桿菌菌株，表達(dá)出的KGF或其變異體以可溶性形式存在，分離純化表達(dá)產(chǎn)物，得到重組KGF或其變異體蛋白。在一個較佳例子中，該大腸桿菌菌株為GI724/pLacKGF。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供的表達(dá)質(zhì)粒是在invitrogen公司的pTrxFus表達(dá)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，invitrogen公司的pTrxFus表達(dá)系統(tǒng)具有低基礎(chǔ)表達(dá)的特性，這種特性由兩方面決定一方面此表達(dá)系統(tǒng)使用的是低基礎(chǔ)表達(dá)的PL啟動子，另一方面在未誘導(dǎo)表達(dá)時菌體在低溫(30℃)培養(yǎng)，表達(dá)質(zhì)粒的拷貝數(shù)較低，降低了基礎(chǔ)表達(dá)。在此基礎(chǔ)上我們作了改進(jìn)，引入雙順反子表達(dá)方法。雙順反子表達(dá)方法就是在編碼目的蛋白的基因之前引入另一易于表達(dá)的編碼較短氨基酸序列的(一般在20個氨基酸以內(nèi))一段DNA序列，從而克服目的基因內(nèi)不利的二級結(jié)構(gòu)對翻譯起始的影響，獲得目的基因的有效表達(dá)。有多種方法克服翻譯起始區(qū)不利二級結(jié)構(gòu)對翻譯的影響，比如通過對翻譯起始區(qū)內(nèi)的序列進(jìn)行改造，但這種改造依賴于不太精確的計算機(jī)mRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，因此改造結(jié)果難以預(yù)料，而雙順反子表達(dá)方法是一種比較有效的方法，其原理在于前導(dǎo)順反子的有效翻譯能打開后續(xù)順反子內(nèi)的不利二級結(jié)構(gòu)。所以本發(fā)明提供的表達(dá)質(zhì)粒pLacKGF不僅可用于表達(dá)KGF及其變異體，在表達(dá)質(zhì)粒內(nèi)導(dǎo)入其它基因也可用于表達(dá)其它的蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，適用于本發(fā)明的宿主細(xì)胞為大腸桿菌，優(yōu)選為大腸桿菌GI724和GI698菌株。表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化可采用常規(guī)的方法，用pLacKGF轉(zhuǎn)化GI724，經(jīng)反復(fù)篩選，獲得高表達(dá)的穩(wěn)定的菌株。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，在通過表達(dá)載體制備重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子的方法中，因表達(dá)的KGF或其變異體對大腸桿菌有毒，如克服這種毒性，對表達(dá)將更有利。在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的銅離子有助于某些重組蛋白的表達(dá)，在US patent 5523215中對此作了詳盡描述，但在此專利中重組蛋白都以包涵體形式存在，重組蛋白至少要有一個以上的半胱氨酸，而且培養(yǎng)基必須高度通氣及富氧化。銅離子在重組變性蛋白的復(fù)性中常用做氧化劑，因此此篇專利中在培養(yǎng)基中加入銅離子提高了培養(yǎng)基的氧化能力，間接提高細(xì)胞內(nèi)的氧化性，有利于表達(dá)的蛋白之間形成分子間二硫鍵從而形成包涵體。本發(fā)明在培養(yǎng)基中加入銅離子有利于KGF及其變異體的表達(dá)，但表達(dá)的KGF及其變異體是以可溶性形式存在，而不是以不可溶的包涵體形式存在，與USpatent 5523215中的描述不同，銅離子起作用的機(jī)理與US patent 5523215中的機(jī)理并不相同，可能與其增強(qiáng)細(xì)胞色素酶的活性，提高細(xì)胞代謝能力有關(guān)。加入銅離子后，細(xì)菌的生長速率提高，誘導(dǎo)時至細(xì)菌生長停滯時這一段時間間隔延長，最終的表達(dá)量和細(xì)菌得率都比未加銅離子的高。在實施例四中比較了在培養(yǎng)基中加銅離子與不加銅離子得到的結(jié)果。銅離子的這種作用可能也有助于在大腸桿菌中表達(dá)其它對大腸桿菌有毒性的外源蛋白。
可用多種方法使轉(zhuǎn)化表達(dá)載體的菌株GI724/pLacKGF或GI698/pLacKGF表達(dá)KGF，在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中培養(yǎng)基(特別是誘導(dǎo)前的培養(yǎng)基)用甘油作碳源。在invitrogen公司的說明書中建議用葡萄糖作碳源，US patent5760189中描述的用類似的表達(dá)體系制備重組IL-11的方法中也用葡萄糖作碳源，在我們的實驗中發(fā)現(xiàn)用此套表達(dá)體系不利于表達(dá)KGF及其變異體。在實施例四中作了具體描述。
表達(dá)KGF及其變異體以可溶性形式存在，隨后的純化工藝設(shè)計充分利用了KGF的特性KGF能結(jié)合肝素，而且是一極堿性蛋白，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中給出了一種用肝素親和層析柱和SP柱純化KGF的方法，實施例五中純化方法二給出一種用兩步陽離子柱純化KGF的方法，結(jié)合凝膠過濾層析等方法最終得到的KGF純度大于95％。
圖2示出本發(fā)明的一個實施例中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pLacKGF中的雙順反子片段的核苷酸序列及相應(yīng)的氨基酸序列。
圖3示出本發(fā)明的另一實施例中表達(dá)ΔN23 KGF的重組質(zhì)粒pLacΔN23KGF的圖譜。圖譜中所有元件的說明除用ΔN23 KGF(SEQ ID No.3)代替KGF外，其它均于

圖1中描述的相同。發(fā)明的詳細(xì)描述以下通過實施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明，實施例中未注明具體條件的實驗方法，基本上都按照Sambrook等人編著的《分子克隆實驗室手冊》(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照廠商所建議的條件。實施例一表達(dá)人KGF的重組質(zhì)粒pLacKGF的構(gòu)建1中國人角質(zhì)細(xì)胞生長因子cDNA的克隆取行包皮切割病人手術(shù)后的包皮組織，按invitrogen公司動物細(xì)胞總RNA提取試劑盒操作說明提取包皮組織的總RNA，以KGFP1(5’TAAGAAGGAGATATACATATGTGCAAT GACATGACTCCAGAGCA)和KGFP2(5’GAGTCGACTTAAGTTATTGCCATAGGAAGA AA)為引物，按Pharmacia公司的RT-PCR試劑盒的操作說明，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物(500bp左右)與大連寶生物公司的T克隆載體pMD18-T連接，用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取白色菌落進(jìn)行鑒定。
挑取白色菌落，用RV-M(5’AGCGGATAACAATTTCACACAGG)和KGFP2為引物進(jìn)行PCR鑒定，挑取能擴(kuò)增出500bp左右片段的菌落，過夜培養(yǎng)后，以常規(guī)快速質(zhì)粒提取法提取質(zhì)粒，用NdeI和SalI雙酶切鑒定，挑取能酶切出500bp片段的質(zhì)粒，命名為pMD18KGF，以M13-47(5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)為引物進(jìn)行全自動序列測定，測序結(jié)果表明克隆到的KGF cDNA序列正確。2表達(dá)人KGF的重組質(zhì)粒pLacKGF的構(gòu)建以pMD18KGF為模板，以RV-M和KGFP2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的500bp左右產(chǎn)物用Sal I酶切后備用。Invitrogen公司出售的質(zhì)粒pTrxFus，經(jīng)Nde I酶切后用Klenow酶補(bǔ)平，最后用Sal I酶切，酶切產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳，電泳分離出360bp左右片段和3.4kbp左右片段，用invitrogen公司的凝膠回收試劑盒回收3.4kbp左右片段，將其與上述經(jīng)Sal I酶切的PCR產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌GI724(購自Invitrogen公司)，以KGFP1和KGFP2為引物用PCR法篩選菌落，陽性菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，再用Nde I和Sal I雙酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒以TrxR(5’TGTAAAACGACGGCCAGTGC)為引物進(jìn)行全序列測定，測序結(jié)果證實重組質(zhì)粒pLacKGF具有如下特征在原pTrxFus質(zhì)粒的Nde I位點和Sal I位點間插入了SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1組成的SEQ ID NO.4的序列。
在SEQ ID NO.4序列中，原Nde I位點CATATG突變?yōu)镃ATATA(1-6nt)，第37堿基至第87堿基為編碼第一順反子的序列(編碼17個氨基酸MTMITNSSSVPGDPLEI)，在此順反子之前有一核糖體結(jié)合位點AGGA(26nt-29nt)，在此順反子之后為終止密碼子TAA，隨后是另一核糖體結(jié)合位點GAAGGAGA(91nt-98nt)，接著第106nt至第600nt編碼KGF蛋白，在終止密碼子TAA后是Sal I酶切位點。
實施例二表達(dá)人KGF變異體ΔN23 KGF的重組質(zhì)粒pLacΔN23 KGF的構(gòu)建以KGFP3(5’GCACATATGAGTTATGATTACATG)和KGFP2為引物，質(zhì)粒pMD18KGF為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用Nde I和Sal I雙酶切后備用。將pLacKGF用Nde I和Sal I雙酶切，回收酶切得到的3.4kbp左右片段，與上述經(jīng)酶切的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化入GI724，以KGFP3和KGFP2為引物用PCR法篩選菌落，陽性菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，再用Nde I和Sal I雙酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒以TrxR(5’TGTAAAACGACGGCCAGTGC)為引物進(jìn)行全序列測定，測序結(jié)果正確(SEQ ID NO.3)。
H3BO3 2.5g(NH4)6Mo7O24·4H2O1.32gFeCl3·6H2O 3.4g復(fù)合維生素液(1升)維生素B1 20g維生素B12 200mg維生素B6 2.5g維生素B2 1.0g生物素12.5mg發(fā)酵參數(shù)培養(yǎng)溫度30℃，pH控制在6.8-7.2，灌壓為常壓，通氣量2vvm，溶解氧通過控制攪拌速率或通純氧控制在10％以上。
當(dāng)培養(yǎng)至菌密度為OD660＝4左右時(大約在接種后4.5小時)，加入誘導(dǎo)物(1克色氨酸)和30毫升100mM CuCl2，生溫至36℃，繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)養(yǎng)分消耗情況補(bǔ)充酸水解干酪素、甘油和酵母抽提物，直至菌體生長停滯，大約在誘導(dǎo)后5小時，終發(fā)酵菌密度在OD660＝20左右，離心收集菌體，凍存于-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 在另一實驗中，在誘導(dǎo)時不加入銅離子，發(fā)酵結(jié)果與加銅離子的實驗比較如表1表1銅離子對發(fā)酵的影響

由上表可見，在誘導(dǎo)的同時加入銅離子，提高了生長速率，延長了出現(xiàn)生長停滯的時間，提高了終發(fā)酵菌密度，提高了表達(dá)量，從而提高了表達(dá)產(chǎn)量。為避免較高密度發(fā)酵時參數(shù)不易控制，此兩項實驗我們有意在低菌密度誘導(dǎo)以使結(jié)果容易進(jìn)行比較。將誘導(dǎo)時間推后，在菌密度為6左右誘導(dǎo)，終發(fā)酵菌密度為40，表達(dá)量在2-3％。
在另一實驗中，我們用葡萄糖代替甘油作為碳源，起始培養(yǎng)基中含0.2％葡萄糖，0.2％酸水解干酪素，0.2％酵母抽提物，培養(yǎng)至菌密度為OD660＝5左右時(還未誘導(dǎo))菌體生長停滯，說明用葡萄糖作碳源對于本表達(dá)系統(tǒng)是不利的，可能提高了基礎(chǔ)表達(dá)的量，從而導(dǎo)致菌體死亡。因此用本表達(dá)方法制備KGF及其變異體，最好用甘油作為培養(yǎng)基中的碳源。實施例五重組KGF的制備純化方案一菌體按10％的量懸浮于裂解緩沖液(10mM Tris-HCl，2mM EDTA，200mMNaCl，pH7.5)，冰浴下超聲破碎，破碎液用9000g離心力離心30分鐘除去細(xì)胞殘渣，取出上清作為粗樣作以下純化。
肝素親和層析柱用緩沖液A1(10mM Tris-HCl，200mM NaCl，pH7.5)預(yù)先平衡好，將上述粗樣過此柱，然后用緩沖液A1沖洗直至檢測基線接近上樣前基線，然后以緩沖液A1為流動相加0-1N NaCl梯度進(jìn)行梯度洗脫，分部收集洗脫液，用12％SDS-PAGE證實含目的蛋白的各分部收集樣品(這些樣品集中在0.5N NaCl洗脫峰處)，合并這些收集樣品，用稀釋液(50mMphosphate，pH6.8)稀釋至電導(dǎo)約為0.2，過SP柱，SP柱預(yù)先用緩沖液A2(50mMNaPO4，200mM NaCl，pH6.8)平衡好，然后以緩沖液A2為流動相加0-0.5NNaCl梯度進(jìn)行梯度洗脫，分部收集，用12％SDS-PAGE證實含目的蛋白的各分部收集樣品(這些分部收集樣品大概集中在0.45N NaCl洗脫峰處)，合并這些收集樣品并用截留分子量為10,000的膜片進(jìn)行超濾濃縮。
上述濃縮液上樣至Sephacryl S-200柱，柱子預(yù)先用平衡液(20mM NaPO4，150mM NaCl，Ph7.2)平衡好，待樣品完全進(jìn)入膠中后，用平衡液從此凝膠過濾介質(zhì)中洗脫出蛋白質(zhì)，回收那些含目的蛋白的收集液。
純化方案二菌體按10％的量懸浮于裂解緩沖液(10mM Tris-HCl，2mM EDTA，200mMNaCl，pH7.5)，冰浴下超聲破碎，破碎液用9000g離心力離心30分鐘除去細(xì)胞殘渣，取出上清作為粗樣作以下純化。
粗樣上樣至SP柱，SP柱預(yù)先用緩沖液A3(20mM Tris-HCl，200mM NaCl，pH7.5)平衡好，然后用緩沖液A3沖洗直至檢測基線接近上樣前基線，然后作階段梯度洗脫，先用緩沖液A4(20mM Tris-HCl，400mM NaCl，pH7.5)洗脫，后用緩沖液A5(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH7.5)洗脫(SDS-PAGE證實目的蛋白在此梯度被洗脫出來)。分部收集洗脫液，用12％SDS-PAGE證實含目的蛋白的各分部收集樣品，合并這些收集樣品，加入等體積的去離子水，然后上樣至另一SP柱，次柱預(yù)先用緩沖液A6(50mM NaPO4，350mMNaCl，pH6.8)平衡好，然后以緩沖液A6為流動相加0-0.3N NaCl梯度進(jìn)行梯度洗脫，分部收集，用12％SDS-PAGE證實含目的蛋白的各分部收集樣品，合并這些收集樣品并用截留分子量為10,000的膜片進(jìn)行超濾濃縮。
上述濃縮液上樣至Sephacryl S-200柱，柱子預(yù)先用平衡液(20mM NaPO4，150mM NaCl，Ph7.2)平衡好，待樣品完全進(jìn)入膠中后，用平衡液從此凝膠過濾介質(zhì)中洗脫出蛋白質(zhì)，回收那些含目的蛋白的收集液。
純化得到的重組KGF蛋白，純度都大于95％，采用BALB/MK角質(zhì)細(xì)胞株進(jìn)行體外生物學(xué)活性測定，兩種純化方法所得的KGF蛋白的活性沒有明顯差別，ED50在3ng/ml左右，與Ron等報道的相似(Ron et al，J.Biol.Chem.268(4)2984-2988)。Ron等得到的純化產(chǎn)物中有一免疫印跡(Westernblotting)呈陽性的片段(用抗完整KGF的抗體)，SDS-PAGE分子量為16-17KD(而另一免疫印跡陽性片段的SDS-PAGE分子量為21KD)，具同樣生物學(xué)活性。此片段用抗KGF33-44氨基酸抗體做免疫印跡呈陰性，提示此片段為重組KGF的降解產(chǎn)物。但這種現(xiàn)象在我們的實驗中并不存在，用購自SantCruze公司的抗完整人KGF抗體所做的免疫印跡顯示無論是表達(dá)總菌體、純化過程中的中間樣品，還是終純化產(chǎn)物，免疫印跡方法只檢測到一個條帶，此條帶的分子量在常規(guī)的SDS-PAGE凝膠電泳上為21KD，而不是理論上的18KD，這種現(xiàn)象與Ron等的報道一致。實施例六重組KGF蛋白的體外生物學(xué)活性測定BALB/MK角質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)基(50％Eagle’s low-Ca2+MEM，50％Ham’sF-12 medium，5ug/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，5ng/ml亞硒酸鈉，0.0005％HAS，0.005％吐溫20)中于37℃培養(yǎng)，維持培養(yǎng)箱中CO2在10％，濕度在99％。以5×103個細(xì)胞每孔接種入用1ug/cm2 fibronectin預(yù)處理的12孔培養(yǎng)板上，加1ml培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2天更換培養(yǎng)基。八天后，KGF蛋白樣品(用含2％膠原的PBS溶液稀釋)加入培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)17個小時，更換培養(yǎng)基，洗滌一次，然后加入1ml含25μCi[3H]thymidine的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6個小時。然后去處培養(yǎng)基，洗滌，用1ml 0.1％SDS在37℃溶解一個小時，在4℃以12000rpm離心10分鐘，取上清，加入1ml預(yù)冷的200mg/ml三氯乙酸，混勻，冰浴30分鐘，在4℃以12000rpm離心10分鐘，去除上清，沉淀用1ml 1N NaOH溶解，然后用液閃儀測定放射強(qiáng)度。用本方法測定我們純化到的KGF蛋白，ED50在3ng/ml左右，與Ron等報道的相似(Ron et al，J.Biol.Chem.268(4)2984-2988)?；钚詼y定結(jié)果見表2。
表2重組KGF蛋白對BALB/MK角質(zhì)細(xì)胞的有絲分裂原活性處 理 [3H]-胸腺嘧啶摻入量cpm對 照 216±60rKGF(1ng/ml) 5817±1153rKGF(5ng/ml) 13659±2036rKGF(10ng/ml) 24873±3984rKGF(50ng/ml) 21000±4025以上對本發(fā)明較佳實施例的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變和變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明的范圍。
SEQUENCE LISTING<110>上海漢殷藥業(yè)有限公司昆明博賽科技有限公司<120>一種重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子的質(zhì)粒載體、其宿主及制備重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子的方法<130>PI011118<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>489<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>misc_feature<223>編碼人成熟角質(zhì)細(xì)胞生長因子<400>1tgcaatgaca tgactccaga gcaaatggct acaaatgtga actgttccag ccctgagcga60cacacaagaa gttatgatta catggaagga ggggatataa gagtgagaag actcttctgt120cgaacacagt ggtacctgag gatcgataaa agaggcaaag taaaagggac ccaagagatg180aagaataatt acaatatcat ggaaatcagg acagtggcag ttggaattgt ggcaatcaaa240ggggtggaaa gtgaattcta tcttgcaatg aacaaggaag gaaaactcta tgcaaagaaa300gaatgcaatg aagattgtaa cttcaaagaa ctaattctgg aaaaccatta caacacatat360gcatcagcta aatggacaca caacggaggg gaaatgtttg ttgccttaaa tcaaaagggg420attcctgtaa gaggaaaaaa aacgaagaaa gaacaaaaaa cagcccactt tcttcctatg480gcaataact489<210>2<211>104<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>前導(dǎo)順反子<400>2tagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgaat tcgagctcgg60tacccgggga tcctctagag atttaagaag gagatataca tatg 104<210>3<211>420<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>misc_feature<223>編碼人氨基端缺失23個氨基酸的角質(zhì)細(xì)胞生長因子ΔN23 KGF<400>3agttatgatt acatggaagg aggggatata agagtgagaa gactcttctg tcgaacacag60tggtacctga ggatcgataa aagaggcaaa gtaaaaggga cccaagagat gaagaataat120tacaatatca tggaaatcag gacagtggca gttggaattg tggcaatcaa aggggtggaa180agtgaattct atcttgcaat gaacaaggaa ggaaaactct atgcaaagaa agaatgcaat240gaagattgta acttcaaaga actaattctg gaaaaccatt acaacacata tgcatcagct300aaatggacac acaacggagg ggaaatgttt gttgccttaa atcaaaaggg gattcctgta360agaggaaaaa aaacgaagaa agaacaaaaa acagcccact ttcttcctat ggcaataact420<210>4<211>606<212>DNA<213>人工序列<220><221>mutation<222>(6)..(6)<223>G to A<220><221>RBS<222>(26)..(29)<223><220><221>RBS<222>(91)..(98)<223><220><221>CDS<222>(37)..(87)<223>順反子<220><221>CDS<222>(106)..(600)<223>編碼人角質(zhì)細(xì)胞生長因子<400>4catatagcgg ataacaattt cacacaggaa acagct atg acc atg att acg aat54Met Thr Met Ile Thr Asn15tcg agc tcg gta ccc ggg gat cct cta gag att taagaaggag atatacat105Ser Ser Ser Val Pro Gly Asp Pro Leu Glu Ile10 15atg tgc aat gac atg act cca gag caa atg gct aca aat gtg aac tgt153Met Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala Thr Asn Val Asn Cys20 25 30tcc agc cct gag cga cac aca aga agt tat gat tac atg gaa gga ggg201Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly35 40 45gat ata aga gtg aga aga ctc ttc tgt cga aca cag tgg tac ctg agg249Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg50 55 60 65atc gat aaa aga ggc aaa gta aaa ggg acc caa gag atg aag aat aat297Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn
70 75 80tac aat atc atg gaa atc agg aca gtg gca gtt gga att gtg gca atc345Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile85 90 95aaa ggg gtg gaa agt gaa ttc tat ctt gca atg aac aag gaa gga aaa393Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys100 105 110ctc tat gca aag aaa gaa tgc aat gaa gat tgt aac ttc aaa gaa cta441Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu115 120 125att ctg gaa aac cat tac aac aca tat gca tca gct aaa tgg aca cac489Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His130 135 140 145aac gga ggg gaa atg ttt gtt gcc tta aat caa aag ggg att cct gta537Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val150 155 160aga gga aaa aaa acg aag aaa gaa caa aaa aca gcc cac ttt ctt cct 585Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro165 170 175atg gca ata act taa gtcgac 606Met Ala Ile Thr180<210>5<211>17<212>PRT<213>人工序列<400>5Met Thr Met Ile Thr Asn Ser Ser Ser Val Pro Gly Asp Pro Leu Glu1 5 10 15Ile<210>6<211>164<212>PRT<213>人工序列<400>6Met Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala Thr Asn Val Asn Cys15 10 15Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly20 25 30Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg35 40 45Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn50 55 60Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile65 70 75 80Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys85 90 95Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu100 105 110Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His115 120 125Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val130 135 140Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro145 150 155 160Met Ala Ile Thr
權(quán)利要求
1.一種重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子或其變異體的質(zhì)粒載體，其特征在于它包括一表達(dá)人角質(zhì)細(xì)胞生長因子的基因序列或其等位變異體；一順反子序列，與所述表達(dá)人角質(zhì)細(xì)胞生長因子的基因序列或其等位變異體連接；一啟動子，與所述順反子序列連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒載體，其特征在于所述表達(dá)人角質(zhì)細(xì)胞生長因子的基因序列為SEQ ID NO.1所示DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒載體，其特征在于所述表達(dá)人角質(zhì)細(xì)胞生長因子的基因序列為SEQ ID NO.3所示的DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒載體，其特征在于所述順反子序列為SEQ IDNO.2所示的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒載體，其特征在于所述啟動子為噬菌體PL啟動子。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的質(zhì)粒載體，其特征在于所述SEQ ID NO.1的DNA來源于中國人皮膚組織。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒載體，其特征在于所述質(zhì)粒載體中進(jìn)一步包含一轉(zhuǎn)導(dǎo)終止子。
8.一種由權(quán)利要求1所述質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述大腸桿菌為E.coliGI724/pLacKGF。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述大腸桿菌為E.coliGI698/pLacKGF。
12.一種由權(quán)利要求9所述大腸桿菌宿主制備重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子或其變異體的方法，包括以下步驟1)在包含有有效銅離子劑量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子基因或其等位變異體的大腸桿菌，表達(dá)出的重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子或其變異體以可溶的形式存在；2)用適當(dāng)?shù)姆椒呀馀囵B(yǎng)后的大腸桿菌，分離裂解液，從可溶性成分中用適當(dāng)?shù)姆椒兓鲋亟M人角質(zhì)細(xì)胞生長因子或其變異體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述銅離子劑量為1～10mM。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述培養(yǎng)基中以甘油作為碳源。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述大腸桿菌宿主為E.ColiGI724/pLacKGF。
16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述大腸桿菌宿主為E.ColiGI698/DLacKGF。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子或其等位變異體的質(zhì)粒載體、其大腸桿菌宿主及重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子的制備方法。該重組質(zhì)粒載體含有重組的人KGF或KGF衍生序列，與編碼KGF的基因相連接的編碼lacZ酶N端17個氨基酸的一個順反子，噬菌體P
文檔編號C12N15/63GK1408872SQ01126938
公開日2003年4月9日 申請日期2001年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月29日
發(fā)明者趙彬, 徐林, 楊上川 申請人:上海漢殷藥業(yè)有限公司, 昆明博賽科技有限公司