)的種子中分離。參見，例如，Rasmussen，U.，等人，Acta Pharm.Suec. 1978; 15:133-140。毒胡蘿卜素通過強(qiáng)力抑制關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)蛋白、肌質(zhì)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 狀鈣ATP酶（sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase，（SERCA))栗起作用， 該SERCA栗的正常功能是維持所有細(xì)胞類型中的細(xì)胞內(nèi)的鈣體內(nèi)平衡。SERCA栗的適當(dāng)功能 被需要用于所有細(xì)胞類型的生命力。因此，毒胡蘿卜素對(duì)SERCA栗的抑制導(dǎo)致所有測(cè)試的細(xì) 胞類型（正常的和惡性的兩者）的死亡。參見，例如，Thastrup，0 .，等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990；87:2466-2470；Denmeade,S.R.,Cancer Biol.Ther.2005； 4:14-22〇
[0054] 基于此，G-202被設(shè)計(jì)為靶向具有獨(dú)特的作用機(jī)制的此強(qiáng)力的細(xì)胞毒素，用于通過 由在前列腺癌的位點(diǎn)內(nèi)的前列腺癌上皮細(xì)胞以及由在其他癌細(xì)胞類型（例如肝細(xì)胞癌）中 的腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的PSMA而選擇性地活化。不受任何特定的理論束縛，相信的是，PSMA是 細(xì)胞外羧肽酶，其順次地從G-202前藥裂解酸性的氨基酸以最終放出毒胡蘿卜素的細(xì)胞毒性 的類似物。參見，例如，Pinto J.T.，等人，Clin. Cancer Res .1996; 2:1445-1451 ;Carter, R.F.,等人，Proc.Natl.Acad.Sci. ,USA 1996;93:749_753;Mhaka,A.,等人，Cancer Biol Ther. 2004; 3:551-558。被稱為12ADT-Asp的此高度親脂性的類似物在從其水溶性的肽載體 釋放后快速地分配到周圍的細(xì)胞膜中。參見，例如，Jak 〇bsen，CM.，等人，J.Med.Chem.2001; 44:4696-4703。該類似物然后結(jié)合至SERCA栗，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)鈣的持續(xù)升高，這導(dǎo)致細(xì)胞凋亡 的活化（參見，例如，圖 1A-1D ;Denmeade，S · R.，等人· J · Natl · Cancer Inst.2003;9:990-1000; Singh，P ·，等人，J · Med · Chem · 48，3005-3014(2005))。因?yàn)?12ADT-Asp類似物被細(xì)胞外 地釋放至腫瘤微環(huán)境中，每個(gè)細(xì)胞不需要產(chǎn)生PSMA以通過前藥活化被殺死。通過將活性藥 物釋放到腫瘤微環(huán)境中實(shí)現(xiàn)實(shí)質(zhì)上的旁觀者效應(yīng)(bystander effect)。
[0055] 對(duì)G-202的臨床前研究已經(jīng)證實(shí)，前藥通過PSMA在體外被選擇性地活化并且相對(duì) 于PSMA非表達(dá)腫瘤細(xì)胞對(duì)PSMA表達(dá)腫瘤細(xì)胞是~60倍更大的毒性。PSMA以對(duì)宿主動(dòng)物最低 限度毒性的劑量在體內(nèi)示出針對(duì)一組的前列腺癌、乳腺癌、腎癌、肝癌和膀胱癌的顯著的生 長(zhǎng)抑制。參見，例如，Denmeade,S.，等人，www.Science Translational Medicine.org，第4 卷，第 140 期：1-12(2012)。
[0056]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生G-202(式1)、粗制的G-202(式9)和某些 中間體的方法。如在圖1A-1D中所示出地概述和闡明用于粗制的G-202的總反應(yīng)方案。
[0057] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，化合物(式2)
[0058]
[0059]被用作起始物料。此化合物與在乙醇中的乙醇鈉在_15±5°C的溫度下發(fā)生反應(yīng)以 產(chǎn)生
[0060]
[0061 ](式3)。接著，此化合物(8-0-去丁?；?毒胡蘿卜素(DBTg))與4-二甲基氨基吡啶 (4-DMAP)、12-(叔-丁氧羰基氨基)十二烷酸（12-Boc-AD)和二氯甲烷發(fā)生反應(yīng)直至獲得均 一的溶液。二異丙基碳二亞胺(DIC)被添加到此溶液以獲得：
[0062]
[0063](式 5)(Boc-12ADT 或 12-BOC-ADTKBOC-12ADT 被溶解于二氯甲烷(CH2C12)并與三氟 乙酸(TFA)混合以得到：
[0064]
[0065] (式6) (12-ADT)。此后，此化合物12-ADT接著與純化的肽：
[0066]
[0067](式7)在二甲基甲酰胺(DMF)和羥基苯并三唑(HOBt)的混合物中發(fā)生反應(yīng)。二異丙 基乙胺(DIPEA)被添加到該混合物，隨后是(3-二甲基氨基丙基）乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC-HC1)以產(chǎn)生：
[0068]
[0069](式8)(PG-202)。接著，此化合物與二氯甲烷、三乙基硅烷(Et3SiH)和三氟乙酸發(fā) 生反應(yīng)以產(chǎn)生化合物：
[0070]
[0071](式9)(粗制的G-202)。粗制的G-202然后被純化以產(chǎn)生式1的化合物。
[0072]本發(fā)明還提供用于產(chǎn)生被用于產(chǎn)生粗制的G-202(式9)的反應(yīng)物Boc-12-AD(式4) 的方法，如在上文的反應(yīng)方案中所示。Boc-12-AD的總反應(yīng)方案可以如下概述和闡明：
[0073]
[0074]以前，Boc-12-AD通過在氫氧化鈉的存在下用過量二叔丁基二碳酸酯處理從12-氨 基十二烷酸在一個(gè)步驟中被構(gòu)建(方案1)。在從庚烷重結(jié)晶后，所期望的產(chǎn)物被報(bào)道以優(yōu)良 的收率和純度被獲得。然而，由于在HPLC分析時(shí)的很小的UV吸收，Boc-12-AD純度通過NMR確 定。
[0075] 方案 1
[0076]
[0077] 當(dāng)12-氨基十二烷酸在叔丁醇中在40°C下用1.9當(dāng)量Boc20和0.98當(dāng)量的Na0H(5M) 處理、隨后后處理并從庚烷中重結(jié)晶時(shí)，期望的是產(chǎn)生純的Boc-12-AD。然而，雖然由此方法 產(chǎn)生的材料是雪白的并且是晶狀的，但通過lc/ms的分析表明其包含顯著的量的三種化合 物，如下所示(方案2)。由于顯著的信號(hào)重疊，可能的是，這些雜質(zhì)通過NMR是不可鑒定的。
[0078]方案 2
[0079]
[0080] 因此，通過方案1產(chǎn)生的組分之一是所需要的Boc-12-AD，但其余兩個(gè)是起始物料 的二聚體。從僅基于lc/ms的結(jié)構(gòu)確認(rèn)，相信雜質(zhì)1是游離酸并且相信雜質(zhì)2是叔丁基酸酐。 對(duì)在從庚烷中的第一重結(jié)晶之前和之后的材料的分析表明，其在除去這些雜質(zhì)上不是有效 的。從庚烷中的第二重結(jié)晶被發(fā)現(xiàn)減少雜質(zhì)2的量，但沒有減少雜質(zhì)1。材料還可以從乙酸乙 酯或甲基叔丁基醚(MTBE)與庚烷的混合物中重結(jié)晶，具有良好的回收率。然而，兩種體系減 少雜質(zhì)2但對(duì)雜質(zhì)1的量具有很小的作用。如果留在反應(yīng)物中，雜質(zhì)1將與DBTg發(fā)生反應(yīng)并且 產(chǎn)生貫穿余下的合成的非常難以除去的雜質(zhì)。
[0081 ]因此，本文提供的是新穎的方法，該方法基本上消除在現(xiàn)有的合成中生成的雜質(zhì)。 該方法包括經(jīng)由以下方案3中示出的三步路線生成Boc-12-AD。
[0082]方案 3
[0083]
[0084] 12-氨基十二烷酸的酸催化的酯化生成甲基酯鹽酸鹽。在此反應(yīng)之后是將氮保護(hù) 為氨基甲酸叔丁酯并且最后水解以給出期望的產(chǎn)物。
[0085] 雖然此路線較長(zhǎng)(3步對(duì)1步），但其是非常高收率的（對(duì)每步分別為96%、97%和 98%)并且其基本上消除二聚體雜質(zhì)的形成。此外，對(duì)于將DBTg轉(zhuǎn)化為Boc-12-ADT的反應(yīng)， 副產(chǎn)物二異丙基脲(DIU)通過從MTBE/庚烷中沉淀而除去；未反應(yīng)的DIC通過新穎的ACN/庚 烷分配而除去，并且開發(fā)了硅膠純化12-ADT-TFA。
[0086] 方案3還可用于生成Boc-12-AD的變型，例如具有式Boc-(CH2) n-NH2的化合物，其中 η是大于2的整數(shù)。對(duì)于這樣的化合物，起始物料將具有式(CH2)n-NH2,其中η是大于2的整數(shù) (式 13)。
[0087] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供式1至式12的化合物(包括其變型和衍生物）、以 及使用它們的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過本文公開的方法制造的式1至式 12的化合物，包括其變型和衍生物。
[0088] 實(shí)施例
[0089] 現(xiàn)將通過參考以下的非限制性實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
[0090] 實(shí)施例1:8-0-去丁?；竞}卜素(DBTg)的制備
[00911
[0092]用709g毒胡蘿卜素(對(duì)于水和溶劑校正的重量是693g)裝載22L的圓底燒瓶(RB