一種制備構(gòu)樹人工種子的方法及其專用培養(yǎng)液的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種制備構(gòu)樹人工種子的方法及其專用培養(yǎng)液。
【背景技術(shù)】
[0002] 構(gòu)樹又稱楮樹，Broussoneti Papyrifera(L)Vent，屬?？浦参锏穆淙~喬木，各種 類型的土壤幾乎都能生長，極少病蟲害，耐干冷，耐濕熱，根系發(fā)達(dá)，是保護(hù)生態(tài)環(huán)境和水土 保持的一種優(yōu)良樹種。構(gòu)樹的樹冠較大，對空氣中汽車尾氣和其它類型的霾塵等吸附能力 較強(qiáng)，因此還是環(huán)境綠化及行道樹的常用樹種。構(gòu)樹全身都能利用:樹皮纖維潔白、細(xì)長，是 制造銅版紙等高檔紙的原料和紡織原料，價值高，市場需求量大;樹桿是生產(chǎn)紙張、纖維板 的好原料;樹葉含有豐富的粗蛋白、氨基酸、微量元素，是制備優(yōu)質(zhì)青儲飼料的原料;樹葉中 含有黃酮等活性成分，具有降糖和血脂的用途。采用高密度栽培技術(shù)種植構(gòu)樹，畝產(chǎn)韌皮纖 維200公斤，樹桿1500公斤，優(yōu)質(zhì)飼料樹葉1500公斤。目前，環(huán)境綠化造林和經(jīng)濟(jì)農(nóng)業(yè)等對于 構(gòu)樹種苗的需求非常大，每年將達(dá)到2000萬株。
[0003] 目前構(gòu)樹的種苗制備主要靠扦插和組培苗供應(yīng)。扦插存在著季節(jié)性、場地占用面 積大、效率低、勞動強(qiáng)度大等問題。常規(guī)組培方法存在著人工成本高、勞動量大、成本高等問 題。因此，采用效率更高、成本更低、勞動量更小的生物技術(shù)進(jìn)行構(gòu)樹種苗的快速繁殖與生 產(chǎn)具有重要的實際意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種制備構(gòu)樹人工種子的方法及其專用培養(yǎng)液。
[0005] 本發(fā)明首先提供了一種制備構(gòu)樹人工種子的方法，包括如下步驟：
[0006] (al)在培養(yǎng)液丁中孵育構(gòu)樹體細(xì)胞胚；
[0007] 培養(yǎng)液丁的制備方法：每升1/10MS培養(yǎng)基中加入1.8-2.2mg 6-BA、0.9-1. Img NAA、18-22g蔗糖、0.9-1. Ig低分子量殼聚糖、0.9-1. Ig草酸和36-44g海藻酸鈉；
[0008] (a2)將步驟(al)得到的體系加入0.9-l.lg/100mL CaCl2水溶液中，孵育，得到構(gòu) 樹人工種子。
[0009] 所述步驟(al)中，所述孵育的條件為:室溫靜置孵育3分鐘。
[0010]所述步驟(a2)中，所述孵育的條件為:室溫靜置孵育30分鐘。
[0011] 所述培養(yǎng)液丁的制備方法具體可:每升1/10MS培養(yǎng)基中加入2mg 6-BA、lmg NAA、 2〇g蔗糖、I g低分子量殼聚糖、I g草酸和40g海藻酸鈉。
[0012] 所述培養(yǎng)液丁的pH具體可為6.0。
[0013] 所述CaCl27jC溶液具體可為lg/l〇〇mL CaCl27jC溶液。
[0014] 所述制備構(gòu)樹人工種子的方法中，所述構(gòu)樹體細(xì)胞胚、所述培養(yǎng)液丁和所述CaCl2 水溶液的配比如下：1.5 X IO4個構(gòu)樹體細(xì)胞胚:1500mL培養(yǎng)液丁 :3000mL CaCl2水溶液。
[0015] 所述步驟(a2)中，還包括如下步驟:進(jìn)行所述孵育后，棄上清并用無菌去離子水沖 洗。
[0016]本發(fā)明還提供了一種構(gòu)樹擴(kuò)繁方法，包括如下步驟(bl):將以上任一所述方法制 備的構(gòu)樹人工種子置于MS固體培養(yǎng)基上，20-25Γ、光暗交替培養(yǎng)。所述光暗交替培養(yǎng)具體 可為12小時光照/12小時黑暗。所述光照的光照強(qiáng)度具體可為30001x。所述培養(yǎng)具體可為靜 置培養(yǎng)。所述培養(yǎng)的時間具體可為20天。
[0017]所述構(gòu)樹擴(kuò)繁方法還可包括如下步驟(b2):完成步驟(bl)后，將小苗置于20-25 °C、光暗交替的條件下培養(yǎng)。所述光暗交替具體可為12小時光照/12小時黑暗。所述光照的 光照強(qiáng)度具體可為30001x。所述培養(yǎng)時的空氣濕度具體可為100%。所述培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基 質(zhì)的制備方法為:取砂子，用水沖洗，然后用5g/1OOmL多菌靈水溶液拌濕，10分鐘后用水沖 洗3遍。所述培養(yǎng)的時間具體可為25天。
[0018]以上任一所述構(gòu)樹體細(xì)胞胚的制備方法可為方法甲，包括如下步驟：
[0019] (I)取構(gòu)樹無菌苗的葉片，切成〇. 5 X 0.5cm2，接種到培養(yǎng)基甲上，23 ± 2°C黑暗培 養(yǎng)25天；
[0020] (Π )取步驟（I)得到的胚性愈傷組織，接種到所述培養(yǎng)基甲上，23±2°C黑暗培養(yǎng) 25天；
[0021] (ΙΠ )取步驟（Π )得到的胚性愈傷組織，接種到所述培養(yǎng)基甲上，23±2°C黑暗培養(yǎng) 25天；
[0022] (IV)將Ig步驟（m )得到的胚性愈傷組織加至10m 1培養(yǎng)基乙中，23 ± 2 °C、黑暗、 IOOrpm振蕩培養(yǎng)25天；
[0023] ( V )完成步驟（IV)后，將1體積份培養(yǎng)體系與1體積份所述培養(yǎng)基乙混合，23 ± 2 °C、黑暗、IOOrpm振蕩培養(yǎng)25天；
[0024] (VI)完成步驟（V )后，將1體積份培養(yǎng)體系與1體積份所述培養(yǎng)基乙混合，23 ± 2 °C、黑暗、IOOrpm振蕩培養(yǎng)25天；
[0025] (VD)完成步驟（VI)后，將1體積份培養(yǎng)體系與1體積份所述培養(yǎng)基乙混合，23 ± 2 °C、黑暗、IOOrpm振蕩培養(yǎng)25天；
[0026] (VI)完成步驟(VD)后，將1體積份培養(yǎng)體系與1體積份所述培養(yǎng)基乙混合，23 ± 2 °C、黑暗、IOOrpm振蕩培養(yǎng)25天；
[0027] (IX)將1體積份步驟(VI)得到的培養(yǎng)體系與2體積份培養(yǎng)基丙混合，23± 2°C、12小 時光照/12小時黑暗、IOOrpm振蕩培養(yǎng)30天；
[0028]所述培養(yǎng)基甲為含0.5mg/L 2,4_二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L瓊脂粉的MS培 養(yǎng)基;所述培養(yǎng)基乙為含〇. 5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和30g/L蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基;所述培 養(yǎng)基丙為含〇.5mg/L NAA、0.2mM TDZ、0.4mg/L IBA、0.4mg/L 6-BA和30g/L蔗糖的 1/2MS培 養(yǎng)基。
[0029] 步驟(K)中，所述光照的條件可為1500-20001x，具體可為15001x。
[0030]以上任一所述構(gòu)樹體細(xì)胞胚的制備方法可為方法乙，包括如下步驟：
[0031] (1)將構(gòu)樹的胚性愈傷組織加至培養(yǎng)基乙中進(jìn)行培養(yǎng);所述培養(yǎng)基乙為含〇.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和3(^/1蔗糖的1/21^培養(yǎng)基；
[0032] (2)完成步驟（1)后，將培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基丙中進(jìn)行培養(yǎng);所述培養(yǎng)基丙為含 0.5mg/L NAA、0.2mM TDZ、0.4mg/L IBA、0.4mg/L 6-BA和30g/L蔗糖的 1/2MS培養(yǎng)基。
[0033] 方法乙中，所述構(gòu)樹的胚性愈傷組織的制備方法如下:取構(gòu)樹的外植體，接種到培 養(yǎng)基甲上，進(jìn)行培養(yǎng);所述培養(yǎng)基甲為含0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L瓊 脂粉的MS培養(yǎng)基。
[0034]方法乙中，所述構(gòu)樹的胚性愈傷組織的制備方法如下：
[0035] ①取構(gòu)樹的外植體，接種到培養(yǎng)基甲上，培養(yǎng)；
[0036] ②取步驟①得到的胚性愈傷組織，接種到所述培養(yǎng)基甲上，培養(yǎng)；
[0037] ③取步驟②得到的胚性愈傷組織，接種到所述培養(yǎng)基甲上，培養(yǎng)；
[0038]所述培養(yǎng)基甲為含0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5g/L瓊脂粉的MS培 養(yǎng)基。
[0039] 所述構(gòu)樹的外植體為構(gòu)樹無菌苗的葉或構(gòu)樹無菌苗的莖。所述構(gòu)樹的外植體具體 如下:取構(gòu)樹無菌苗的葉片，切成0.5 X 0.5cm2。所述構(gòu)樹的外植體具體如下:取構(gòu)樹無菌苗 的莖，切成Icm的莖段。
[0040] ①、②和③中，所述培養(yǎng)的條件均為:23±2°C黑暗培養(yǎng)25天。
[0041] 所述步驟(1)具體包括如下步驟：
[0042] (1-1)將Ig構(gòu)樹的胚性愈傷組織加至IOml所述培養(yǎng)基乙中，23 ±2°C、黑暗、IOOrpm 振蕩培養(yǎng)25天；
[0043] (1-2)完成步驟（1-1)后，將1體積份培養(yǎng)體系與1體積份所述培養(yǎng)基乙混合，23±2 °C、黑暗、IOOrpm振蕩培養(yǎng)25天；
[0044] (1-3)完成步驟（1-2)后，將1體積份培養(yǎng)體系與1體積份所述培養(yǎng)基乙混合，23±2 °C、黑暗、IOOrpm振蕩培養(yǎng)25天；
[0045] (1-4)完成步驟（1-3)后，將1體積份培養(yǎng)體系與1體積份所述培養(yǎng)基乙混合，23±2 °C、黑暗、IOOrpm振蕩培養(yǎng)25天；
[0046] (1-5)完成步驟（1-4)后，將1體積份培養(yǎng)體系與1體積份所述培養(yǎng)基乙混合，23±2 °C、黑暗、IOOrpm振蕩培養(yǎng)25天。
[0047]所述步驟(2)中，所述培養(yǎng)的條件為:23±2°C、12小時光照/12小時黑暗、振蕩培養(yǎng) 30天。
[0048] 所述步驟(2)中，培養(yǎng)體系和所述培養(yǎng)基丙的配比為：
[0049] 1體積份培養(yǎng)體系:2體積份培養(yǎng)基丙。
[0050] 所述步驟(2)中，所述振蕩培養(yǎng)具體可為IOOrpm振蕩培養(yǎng)。
[0051 ] 所述步驟(2)中，所述光照的條件可為1500-20001x，具體可為15001x。
[0052]本發(fā)明還保護(hù)一種制備構(gòu)樹人工種子的培養(yǎng)液，為培養(yǎng)液丁;所述培養(yǎng)液丁的制 備方法:每升1/10MS培養(yǎng)基中加入1 · 8-2 · 2mg 6-BA、0 · 9-1 · Img NAA、18-22g蔗糖、0 · 9-1 · Ig 低分子量殼聚糖、〇. 9-1. Ig草酸和36-44g海藻酸鈉。所述培養(yǎng)液丁的制備方法具體可:每升 1/10MS培養(yǎng)基中加入2mg 6-BA、lmg NAA、20g蔗糖、Ig低分子量殼聚糖、Ig草酸和40g海藻酸 鈉。
[0053]以上任一所述低分子量殼聚糖為分子量為2000-4000道爾頓的殼聚糖。以上任一 所述低分子量殼聚糖的分子式為"(C6HnN〇4)n"，n = 10-20。以上任一所述低分子量殼聚糖 具體可為購自上海三杰生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號為9012-76-4的殼聚糖。
[0054]以上任一所述 1/10MS 培養(yǎng)基具體可為：NH4N〇3l65mg/L、KN〇3l90mg/L、KH2P〇4l7mg/ L、MgS〇4 · 7H20 37mg/L、CaCl2 · 2H20 44mg/L、MnS〇4 · 4H20 22.3mg/L、ZnS〇4 · 7H208.6mg/L、 H3B036.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2Mo〇4 · 2H20 0.25mg/L、CuS〇4 · 5H20 0.025mg/L、CoCl2 · 6H2O 0.025mg/L、Na2-EDTA 37.25mg/L、FeS〇4.7H20 27.85mg/L、甘氨酸2mg/L、維生素 BlO · 4mg/L、維生素 B60 · 5mg/L、煙酸 O · 5mg/L、肌醇 100mg/L、鹿糖 30000mg/L，余量為水。
[0055] 以上任一所述構(gòu)樹具體可為大連中植環(huán)境生物科技有限公司培育的快活林品牌 雜交構(gòu)樹。