的表面，所以很難 將小表面（< 20nm)特征與小納米顆粒相區(qū)分；由于這一原因，將CHX-HMP-5納米顆粒和 CHX-HMP-0. 5納米顆粒也沉積在新裂開的云母上以區(qū)分出這些顆粒中最小的顆粒。
[0160] 將每種涂覆有CHX-HMP-5納米顆粒和CHX-HMP-0. 5納米顆粒的材料的8個樣品都 放置到適用于紫外分光光度計的各個被標記的比色皿中。向各比色皿中添加去離子水，然 后使用比色皿蓋將其緊密密封。將比色皿置于以150rpm旋轉的軌道式振蕩器上振動。使 這些比色皿保持密封，并在60-90天期間內每個間隔處取樣測氯己定濃度。制備對照組：樣 品浸漬于去離子水中，和樣品浸漬于25yMCHX溶液中，該25yM是CHX-HMP-5膠體懸浮液 中殘余的含水CHX的濃度。
[0161] 從膠體懸浮液中可選地取出NP
[0162] 可選地，可以在反應已經執(zhí)行之后從懸浮液中取出NP。這在本實施例的事件中并 沒有進行，然而通過下述選項中的一種可以實現(xiàn)：
[0163] 1)置于高耐受力（high-g)離心管或艾本德離心機（Eppendorfs)中并在21000g 下離心60分鐘。這給出了中等的分離；仍舊有NP殘留在看起來稍微渾濁的液體的上清液 中的跡象。移出上清液并棄掉，然后使用NP漿體或者在40-60度的烘箱中干燥幾天，刮出 并研磨成精細的白色粉末，給出了NP的聚集體。這些例如可以添加到牙科水門汀或其他材 料中。
[0164] 2)可替代地，將25mL的1MKC1添加到250mL5/5膠體懸浮液中，靜置15分鐘，然 后由于電荷層壓縮，大量的NP將在容器底部沉積。倒出并棄掉上清液，然后將底部的粒子 密集的液體收集到離心管中。在5000g下離心10分鐘。由于NP周圍電荷層的壓縮，這給 出了更加有效的分離，且能夠用于以更典型的實驗設備加工處理更大量的NP。將上清液棄 掉后，刮出漿體；該漿體可以用于例如添加到涂料或其他材料中?？蛇x地，可以按照如上所 述那樣干燥并使用該漿體。
[0165] 表4示出了CHX-HMP-0. 5懸浮液和CHX-HMP-5懸浮液的主要粒徑和Zeta-電勢。
[0166]表 4
[0167]
[0168]DLS表明一些樣品的雙模態(tài)尺寸分布，其中在大約20-60nm處觀察到更小尺寸的 第二峰。納米顆粒功能化表面的SEM圖像示出于圖5-8中，且功能化玻璃、鈦和云母表面的 AFM示出于圖9-11中。鈦和玻璃樣品展現(xiàn)了納米尺度的粗糙度，這使得有可能將基質表面 與尺寸小于約40nm的納米顆粒相區(qū)分，但對照的云母表面是原子級平坦的，且這些圖像給 出了清楚指示，表明了尺寸通常為20-100nm的納米顆粒的融合層。
[0169] 圖12-15示出了氯己定從納米顆粒功能化表面的洗脫。
[0170] 所研究的不同材料樣品均成功地用CHX-HMP抗微生物納米顆粒功能化，并展現(xiàn)了 在高達90天的期間內的可溶性CHX的逐漸洗脫。圖5-11的SEM和AFM圖像給出了單獨的 納米顆粒和在大多數(shù)表面上自發(fā)地自組裝的多孔納米顆粒聚集體的清楚的可視化。
[0171] 表5示出了不同功能化材料的CHX釋放期。對于CHX的釋放量，參見圖12-15。
[0172]表 5
[0173]
[0174]
[0175] 實施例7--用CHX-HMP-5功能化的玻璃
[0176] 實施例8--用CHX-HMP-0. 5功能化的玻璃
[0177] 對比例4--暴露于25yMCHX溶液的玻璃
[0178] 納米顆粒功能化的玻璃表面在整個實驗期間釋放了CHX(圖13)，且該CHX釋放與 納米顆?；蚣{米顆粒聚集體的初始密度有關，更加密集涂覆CHX-HMP-5的表面要比不太密 集涂覆CHX-HMP-0. 5的表面展現(xiàn)了更高且更加延長的釋放（圖6)。對于CHX-HMP-0. 5樣 品，可溶性CHX的釋放在大約20-25天后停止，然而對于CHX-HMP-5樣品，該釋放在90天時 間點時仍然繼續(xù)。用25yMCHX溶液處理的對照組并未顯示任何CHX釋放，表明可溶性CHX 完全通過清洗步驟被去除了，因此在納米顆粒功能化的樣品中觀察到的CHX釋放歸功于這 些納米顆粒的存在。這一發(fā)現(xiàn)可以在將得益于延長的抗微生物功能的含玻璃和玻璃狀生物 醫(yī)學產品及消費產品中具有應用，例如玻璃離子體水門汀、包含埋植于水門汀基質中的玻 璃顆粒的牙齒充填材料。
[0179] 實施例9--用CHX-HMP-5功能化的海藻酸鹽創(chuàng)傷敷料
[0180] 實施例10--用CHX-HMP-0. 5功能化的海藻酸鹽創(chuàng)傷敷料
[0181] 對比例5--暴露于對照25yMCHX溶液的海藻酸鹽創(chuàng)傷敷料
[0182] 當歸一化為表面面積時，最高的CHX釋放來自海藻酸鹽創(chuàng)傷敷料（圖12)。SEM圖 像清楚地示出了CHX-HMP-5納米顆粒在幾乎所有纖維上的納米顆粒聚集體的密集涂層，以 及涂覆有CHX-HMP-0. 5納米顆粒的樣品上的稀疏分布（圖5)。用對照25yMCHX溶液處理 的樣品也有一些CHX釋放，表明材料從溶液中吸收了一些可溶性CHX，但對照樣品中CHX釋 放的量要遠小于從納米顆粒功能化的樣品中釋放的量（圖12)。具有劑量-響應關系，因 此CHX-HMP-5樣品比CHX-HMP-0. 5樣品展現(xiàn)了更大的釋放，且這與CHX-HMP-5制劑的納米 顆粒的較寬廣的覆蓋有關（圖5)。對于CHX-HMP-5樣品和CHX-HMP-0. 5樣品，二者的釋放 在實驗結束時都還在繼續(xù)，表明納米顆粒在這時并未耗盡。這些發(fā)現(xiàn)在研發(fā)保護慢性或不 愈性創(chuàng)傷免受感染的創(chuàng)傷敷料中可能是很有用的。
[0183] 實施例11--用CHX-HMP-5功能化的EVA聚合物
[0184] 實施例12--用CHX-HMP-0. 5功能化的EVA聚合物
[0185] 對比例6--暴露于對照25yMCHX溶液的EVA聚合物
[0186] 涂覆有CHX-HMP-5納米顆粒的EVA聚合物表面示出了與在玻璃和海藻酸鹽創(chuàng)傷敷 料上觀察到的相同特征的納米顆粒聚集體，盡管其覆蓋通常有點不像在其他基質上那樣密 集（圖7)。
[0187]EVACHX-HMP-0. 5樣品示出了非常低且短暫的可溶性CHX釋放。然而，CHX-HMP-5 樣品示出了直到至少80天的延長的CHX釋放（圖14)，并且當歸一化為表面面積時，這與從 玻璃樣品中見到的釋放是具有可比性的，但稍高于從玻璃樣品中見到的釋放。這些發(fā)明在 研發(fā)諸如靜脈導管和導尿管的以抗微生物聚合物為基礎的醫(yī)用設備中、以及在諸如運動牙 托和磨牙癥牙托的可移動性聚合物產品的抗微生物涂層的周期性局部應用中可以發(fā)現(xiàn)應 用。
[0188] 實施例13--用CHX-HMP-5功能化的鈦
[0189] 實施例14--用CHX-HMP-0. 5功能化的鈦
[0190] 對比例7--暴露于對照25yMCHX溶液的鈦
[0191] 鈦表面示出了CHX納米顆粒聚集的清楚跡象，如圖8所示。CHX-HMP-5功能化的樣 品示出了在整個實驗期間連續(xù)的且持續(xù)的可溶性CHX釋放；在數(shù)值上這一釋放是從玻璃和 聚合物表面上所見到的CHX釋放的大約兩倍。CHX-HMP-0. 5功能化表面釋放了很少的CHX， 且該釋放在大約5天后就停止了。CHX-HMP-5納米顆粒可以在研發(fā)由鈦和鈦合金制造的 牙種植體和骨科種植體的抗微生物涂層中具有應用，并提供了優(yōu)于傳統(tǒng)抗微生物涂層的優(yōu) 勢，該優(yōu)勢為納米顆粒產生了具有大量鈦的仍暴露的并且可用于成骨細胞定殖的非連續(xù)涂 層。
[0192]實施例15-18 :對比例8-10:微牛物學研究
[0193] 微生物學：細菌菌株
[0194] 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA;NCTC13142)在米勒-亨頓（Mueller-Hinton; MH)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。銅綠假單胞菌NCHMB8626(ATCC9027)在營養(yǎng)肉湯（NB)或營養(yǎng)瓊脂 (NA)中培養(yǎng)。所有的培養(yǎng)在整個研究中均在37°C下有氧培育中進行。
[0195] 微生物學：最小抑制濃度
[0196] 在96孔微量滴定板中以總體積為100yL的適宜介質中通過系列雙倍稀釋法 (0-25ym)測定了對照含水25yM氯己定和CHX-HMP-5膠體對浮游菌的最小抑制濃度 (MIC)(根據英國學會（BritishSociety)的抗微生物化學療法的MIC測定法）。培養(yǎng)在有 氧條件下在37°C下培育16小時，使用標準微量滴定板讀出器（SpectroStarNano;伯齊實 驗技術（BMGLabtech))在620nm(A62。）下測量了光密度（0D)讀數(shù)。
[0197] 微生物學：總活菌計數(shù)
[0198] 樣品取自微量滴定板的各個孔并且以磷酸鹽緩沖液（PBS)系列稀釋（10LlO6); 用MH或NA作為非選擇性培養(yǎng)基，使用麥爾斯（Miles)和米斯拉（Misra)總活菌細胞（TVC) 計數(shù)法（見衛(wèi)生年鑒（HYg(Lond)，卷38,頁732-749,1938))計算了 10yL等份。回收的細 胞數(shù)量計算為cfumli。
[0199] 微生物學：靜態(tài)生物膜模型
[0200] 細菌菌株最初生長16小時，然后通過離心收獲這些穩(wěn)定期的培養(yǎng)，然后調整至 0D65Q= 0. 1。生物膜在50yL適宜介質中在37°C下有氧生長48小時，然后移出并棄掉該介 質。通過用100yL的PBS清洗該生物膜兩次去除松散粘附的細菌。使用如上所述（0-25yM) 的雙倍稀釋將以PBS稀釋的氯己定或氯己定納米顆粒添加到生物膜中。該板在37°C下培育 2小時；為估算生物量，一般吸除并棄掉未粘附的細胞，然后使用PBS兩次清洗粘附的細胞， 并用結晶紫（0. 25%w/v)染色10分鐘；然后進一步用PBS清洗兩次，用7%乙酸重新溶解 結合結晶紫的細胞，然后在595nm下測量吸光度（A595)。
[0201] 微生物學：在納米功能化的EVA聚合物樣品上的生物膜
[0202] MRSA和銅綠假單胞菌的預培養(yǎng)在適宜介質中在37°C下有氧初始生長16小時。通 過將聚合物片的每個方塊置于24孔MTP的各孔中，然后添加lml適宜的液體介質（足以覆 蓋該聚合物樣品）來確定聚合物片上的生長分析。聚合物樣品是表3所指定的EVA聚合 物，這些聚合物樣品在MS中超聲10分鐘進行清洗，然后：不處理（對照），或者在攪拌的 CHX-HMP-5中浸漬30秒，然后在去離子水中浸漬10秒（低NP)，以及在攪拌的CHX-HMP-5 中浸漬30秒，但沒有清洗（高NP)。每個孔均培育有10y1MRSA或者銅綠假單胞菌的預培 養(yǎng)，然后在37°C下培育24小時。使用無菌鉗從孔中移出聚合物樣品，然后轉移到含有l(wèi)ml PBS的微型離心機的管中。漩渦震蕩該管1分鐘以移除粘附的細菌，然后將細胞懸浮液系列 稀釋（10i-lO6)，并使用MilesMisra法計算細菌。
[0203] 表6示出了對照的和CHX-HMP-5介質的MIC。
[0204]表6
[0205]
[0206] 表7示出了不同介質對MRSA和銅綠假單胞菌的靜態(tài)細菌生物膜的作用。
[0207] 表 7
[0208]
[0209] 表8示出了納米功能化EVA聚合物樣品的抗微生物作用。
[0210] 表 8
[0211]
[0212]
[0213] 發(fā)現(xiàn)CHX-HMP-5膠體懸浮液對MRSA的MIC是膠體的8倍稀釋，這相當于總（可溶 性的和結合的）CHX濃度為0. 625mM且可溶性CHX濃度為3. 12yM。25yM氯己定對MRSA 的MIC不能確定，表明該溶液不能有效抵抗MRSA(圖19)。對于銅綠假單胞菌，CHX-HMP-5 的MIC被發(fā)現(xiàn)是膠體的16倍稀釋，這是檢測的最小濃度；這相當于總CHX濃度為0. 312mM 且可溶性CHX濃度為1. 56yM。25yM氯己定的MIC濃度是未稀釋的溶液，即25yM，表明銅 綠假單胞菌對納米顆粒比MRSA對納米顆粒更敏感（圖20)。TVC證實了MIC數(shù)據，未處理 對照有1. 5X1012cfuml1的MRSA回收，在CHX-HMP-5膠體的8倍稀釋液和4倍稀釋液生長 的樣品中沒有細菌回收，表明MIC也是殺菌濃度。相似地，對于銅綠假單胞菌，與未處理對 照中回收1. 34X109cfuml1相比，不能從在CHX-HMP-5膠體的16倍稀釋液和8倍稀釋液 生長的樣品中回收到細菌。
[0214]MRSA的生物膜被CHX-HMP-5膠體分解了，但被含水的25yM氯己定分解的程度較 輕（圖21)。CHX-HMP-5膠體還在16倍和4倍的稀釋之間比含水的25yM氯己定更加有效 地分解了銅綠假單胞菌的生物膜（圖22);在2倍稀釋和未稀釋水平處，25yM氯己定與納 米顆粒是同等效果。關于在納米功能化的EVA聚合物上生長的生物膜，對于對照聚合物，在 所有所用的稀釋液中從樣品中回收的銅綠假單胞菌細胞多到不能計數(shù)；以5X105cfuml1 回收了MRSA。對于涂覆有低濃度納米顆粒的聚合物片，對于銅綠假單胞菌，細菌細胞在所有 稀釋處多至不能計數(shù)；但對于MRSA，沒有細胞是可回收的。應該注意的是，對于銅綠假單胞 菌，盡管回收了高數(shù)量的細菌，但周圍液體介質沒有對照那樣渾濁（表明較少的生長），而 對于MRSA，周圍介質是清澈的，表明沒有生長。對于涂覆有高濃度納米顆粒的聚合物片，對 于MRSA和銅綠假單胞菌都沒有細菌是可回收的，兩種情形下周圍介質都是清澈的。
[0215] 微生物學實驗表明CHX-HMP-5膠體在體外對浮游生長的MRSA和銅綠假單胞菌都 是有效的，并且表明這一作用不是由于在容納有膠體的溶液中存在有殘余的25yM可溶性 CHX。此外，生物膜研究表明CHX-HMP-5膠體在體外對MRSA和銅綠假單胞菌的生物膜都是 有效的。此外，涂覆有CHX-HMP-5納米顆粒的EVA聚合物樣品展現(xiàn)了對抗MRSA和銅綠假單 胞菌的生物膜的作用。
[0216]實施例19-24:對比例11 :CHX_HMPNP替代的玻璃離子體水門汀
[0217]CHX-HMP納米顆粒的合成及制備
[0218] 使氯己定二葡萄糖酸鹽（西格瑪-奧德里奇）的含水儲備液和六偏磷酸鈉（西格 瑪-奧德里奇）的含水儲備液在去離子水中混合，以便最終濃度為4mMCHX和5mM。產生的 膠體懸浮液被徹底混合，然后在21000g下離心60分鐘。移出并棄掉上清液，然后使NP漿 體在40°C下至少干燥48小時。然后從離心管中移出該漿體，并使用研缽和研杵研磨至精細 的白色粉末。將該粉末替代玻璃粉末添加到GIC中。
[0219] 納米功能化的玻璃離子體水門汀
[0220] 市售GIC(鉆石切割（DiamondCarve) (TM)，開普敦（Kemdent)，泊頓（Purton)，英 國）被用作起始物料。根據制造商指示通過混合GIC并將其填充到涂覆有一薄層用于輔助 移除的凡士林的有機玻璃模具中，形成直徑6mm且高3mm的正常尺寸的圓柱形GIC樣品。 通過對GIC制備具有豐富經驗的個人執(zhí)行該混合。使用卡尺測量每個樣品的精確尺寸并記 錄。NP粉末以0、1、2、5、10、20和30被％的替代與等份的61(：玻璃粉末混合。每個替代建 立十個樣品，共給出了 70個樣品。在60分鐘內將這些樣品從模具中去除，并置于單獨的小 的、密封的塑料容器中，這些容器包含有不與樣品直接接觸的濕的棉紙，以實現(xiàn)100 %濕度 的氛圍，但防止樣品與液體水接觸而導致的在設置的關鍵早期期間的溶解。這些樣品都在 37°C下儲存7天。
[0221] 在這一時間后，將樣品分為兩組，每組5個樣品。為了拉伸強度測試和形態(tài)測試， 每個替代都預留一組，然后其他組被用于研究氯己定和氟化物從水門汀中的浸出。
[0222] 對于氯己定和氟化物釋放的研究，每個樣品都浸漬于37°C下單獨標記