步，根據(jù)一些 實施方案，小規(guī)模生物反應(yīng)器是4L反應(yīng)器。根據(jù)進一步的實施方案，小規(guī)模生物反應(yīng)器是 3-5L反應(yīng)器。根據(jù)進一步的實施方案，小規(guī)模生物反應(yīng)器是3-10L反應(yīng)器。根據(jù)進一步的 實施方案，小規(guī)模生物反應(yīng)器是4-8L反應(yīng)器。
[0180] 小規(guī)模生物反應(yīng)器可以由任何合適材料制成，如玻璃、金屬、塑料和/或任何類型 聚合物。根據(jù)一些實施方案，小規(guī)模生物反應(yīng)器是一次性的。如果小規(guī)模生物反應(yīng)器不是 一次性的，根據(jù)一些實施方案，在兩次使用期間通過任何合適方式清潔和滅菌。
[0181] 如上所述，已知當較大數(shù)量的果實細胞在生物反應(yīng)器中生長時，次生代謝物包括 多酚如白藜蘆醇的產(chǎn)生與在小規(guī)模生產(chǎn)如使用玻璃瓶如Erlenmeyers中相同代謝物相比 顯著降低。然而，本文詳細描述的大規(guī)模方法提供果實細胞，當在生物反應(yīng)器中生長時其中 的次生代謝物的量不降低。進一步地，某些次生代謝物的產(chǎn)生甚至是擴大的。
[0182]因此，根據(jù)本發(fā)明的實施方案，在小規(guī)模生物反應(yīng)器中生長的果實細胞的次生代 謝物的相對量與其在第一步中的相對量相比不顯著降低。根據(jù)一些實施方案，上述用于第 一步中生長培養(yǎng)基中的成分也可用于第二步。根據(jù)一些實施方案，小規(guī)模生物反應(yīng)器中使 用的生長培養(yǎng)基與大規(guī)模生產(chǎn)方法的第一步中使用的培養(yǎng)基相同。根據(jù)一些實施方案，在 第二步生長培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的不同成分的相對量與第一步相同。根據(jù)其它的實施方案，在第 二步生長培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的不同成分的相對量與在第一步中使用的相對量不同。根據(jù)一些實 施方案，在第二步將另外的物質(zhì)加入生長培養(yǎng)基中。
[0183] 根據(jù)一些實施方案，小規(guī)模生物反應(yīng)器包括一個入口，果實細胞（來自第一步）、 空氣、培養(yǎng)基及任何其它物質(zhì)通過其置于生物反應(yīng)器中。根據(jù)進一步的實施方案，小規(guī)模生 物反應(yīng)器包括一個出口，由此排出任何希望的物質(zhì)。根據(jù)一些實施方案，出口包括一個氣體 出口，設(shè)計為釋放生物反應(yīng)器中過量的氣體。根據(jù)一些實施方案，氣體出口是人工操作的。 根據(jù)其它的實施方案，氣體出口是自動操作的，其中一旦生物反應(yīng)器中氣壓達到預定壓力， 則氣體從生物反應(yīng)器中釋出。根據(jù)一些實施方案，預定壓力是8PSI。
[0184] 根據(jù)一些實施方案，果實細胞和培養(yǎng)基在第二步是持續(xù)混合的。根據(jù)進一步的實 施方案，果實細胞和培養(yǎng)基在第二步是間歇混合的。根據(jù)一些實施方案，第二步的溫度是 20-30攝氏度。根據(jù)一些實施方案，果實細胞在第二步生長多于一周但少于兩周。在本發(fā)明 的一些實施方案中果實細胞在接種于下一個生物反應(yīng)器中之前生長9-16天。
[0185] 對于大規(guī)模方法的第三步，將收獲的果實細胞置于大規(guī)模生物反應(yīng)器中。根據(jù)一 些實施方案，大規(guī)模生物反應(yīng)器是30-50L反應(yīng)器。根據(jù)進一步的實施方案，大規(guī)模生物反 應(yīng)器是40-60L反應(yīng)器。根據(jù)進一步的實施方案，大規(guī)模生物反應(yīng)器是30-70L反應(yīng)器。根 據(jù)進一步的實施方案，大規(guī)模生物反應(yīng)器是20-100L反應(yīng)器。
[0186] 大規(guī)模生物反應(yīng)器可以由任何合適材料制成，如玻璃、金屬、塑料和/或任何類型 聚合物。根據(jù)一些實施方案，大的生物反應(yīng)器是一次性的。如果大規(guī)模生物反應(yīng)器不是一 次性的，根據(jù)一些實施方案，在兩次使用期間通過任何合適方式清潔和滅菌。
[0187]與小規(guī)模生物反應(yīng)器相似，根據(jù)本發(fā)明的實施方案，在大規(guī)模生物反應(yīng)器中生長 的果實細胞的次生代謝物與其在該方法的任何先前步驟中的相對量相比不顯著降低。根據(jù) 一些實施方案，上述任何先前步驟中用于生長培養(yǎng)基中的成分也可以用于第三步。根據(jù)一 些實施方案，大規(guī)模生物反應(yīng)器中使用的生長培養(yǎng)基與該方法的任何先前步驟中使用的培 養(yǎng)基相同。根據(jù)一些實施方案，第三步生長培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的不同成分的相對量與該方法任 何先前步驟中的量相同。根據(jù)其它的實施方案，第三步生長培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的不同成分的相 對量與該方法任何先前步驟中使用的相對量不同。根據(jù)一些實施方案，在第三步將另外的 物質(zhì)加入生長培養(yǎng)基中。
[0188] 根據(jù)一些實施方案，大規(guī)模生物反應(yīng)器包括一個入口，果實細胞（來自第二步）、 培養(yǎng)基、空氣和任何其它物質(zhì)通過其置于生物反應(yīng)器中。根據(jù)進一步的實施方案，大規(guī)模生 物反應(yīng)器包括一個出口，以排出任何希望的物質(zhì)。根據(jù)一些實施方案，出口包括一個氣體出 口，設(shè)計為釋放生物反應(yīng)器中過量的氣體。根據(jù)一些實施方案，氣體出口是人工操作的。根 據(jù)其它的實施方案，氣體出口是自動操作的，其中一旦生物反應(yīng)器中氣壓達到預定壓力，則 氣體從生物反應(yīng)器中釋出。根據(jù)一些實施方案，預定的壓力為直至8PSI。
[0189] 根據(jù)一些舉例的實施方案，果實細胞和培養(yǎng)基在第三步持續(xù)混合。根據(jù)進一步 的實施方案，果實細胞和培養(yǎng)基在第三步間歇混合。根據(jù)一些實施方案，第三步的溫度是 20-30°C。根據(jù)一些實施方案，果實細胞在第三步生長大約2-3周。根據(jù)一些實施方案，果 實細胞在第三步生長大約3-5周。根據(jù)一些實施方案，果實細胞在第三步生長大約12-30 天。
[0190] 第三步果實細胞生長結(jié)束后，通常通過任何適當方式將果實細胞從中等規(guī)模生物 反應(yīng)器接種。對于大規(guī)模生產(chǎn)方法的第四步，將收獲的果實細胞置于更大規(guī)模生物反應(yīng)器 中。根據(jù)一些實施方案，更大規(guī)模生物反應(yīng)器是1000L反應(yīng)器。根據(jù)進一步的實施方案，更 大規(guī)模生物反應(yīng)器是200-500L反應(yīng)器。根據(jù)進一步的實施方案，更大規(guī)模生物反應(yīng)器是 500-1000L反應(yīng)器。根據(jù)進一步的實施方案，更大規(guī)模生物反應(yīng)器是1000-1500L反應(yīng)器。 根據(jù)進一步的實施方案，更大規(guī)模生物反應(yīng)器是500-1100L反應(yīng)器。
[0191] 更大規(guī)模生物反應(yīng)器可以由任何合適材料制成，如玻璃、金屬、塑料和/或任何類 型聚合物。根據(jù)一些實施方案，大規(guī)模生物反應(yīng)器是一次性的。如果大規(guī)模生物反應(yīng)器不 是一次性的，根據(jù)一些實施方案，在兩次使用之間通過任何合適方式清潔和滅菌。
[0192]與小規(guī)模生物反應(yīng)器相似，根據(jù)本發(fā)明的實施方案，在更大規(guī)模生物反應(yīng)器中生 長的果實細胞的次生代謝物的量與其在該方法的先前步驟中的相對量相比不顯著降低。根 據(jù)一些實施方案，上述在任何先前步驟中用于生長培養(yǎng)基中的成分也可用于該方法的第四 步。根據(jù)一些實施方案，在更大規(guī)模生物反應(yīng)器中使用的生長培養(yǎng)基與在任何先前步驟中 使用的培養(yǎng)基相同。根據(jù)一些實施方案，在第四步中生長培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的不同成分的相對 量與先前任何步驟中的量相同。根據(jù)其它的實施方案，在第四步中生長培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的不 同成分的相對量與在任何先前步驟中使用的相對量不同。根據(jù)一些實施方案，在該方法的 第四步將其它物質(zhì)加入生長培養(yǎng)基中。
[0193] 根據(jù)一些實施方案，更大規(guī)模生物反應(yīng)器包括一個入口，果實細胞（來自第三或 第二步）、培養(yǎng)基、空氣和任何其它物質(zhì)通過其置于生物反應(yīng)器中。根據(jù)進一步的實施方案， 更大規(guī)模生物反應(yīng)器包括一個出口，以排出任何希望的物質(zhì)。根據(jù)一些實施方案，出口包括 一個氣體出口，設(shè)計為釋放生物反應(yīng)器中過量的氣體。根據(jù)一些實施方案，氣體出口是人工 操作的。根據(jù)其它的實施方案，氣體出口是自動操作的，其中一旦生物反應(yīng)器中氣壓達到預 定壓力，則氣體從生物反應(yīng)器中釋出。
[0194] 根據(jù)一些實施方案，果實細胞和培養(yǎng)基在第四步持續(xù)混合。根據(jù)進一步的實施方 案，果實細胞和培養(yǎng)基在第四步間歇混合。根據(jù)一些實施方案，第四步的溫度是20-30°C。 根據(jù)一些實施方案，果實細胞在第三步或第四步生長直至達到細胞生物量為10% -70%。
[0195] 根據(jù)一些實施方案，在果實細胞在更大規(guī)模生物反應(yīng)器中生長之后終止該大規(guī)模 生產(chǎn)方法。根據(jù)這種實施方案，果實細胞在更大規(guī)模生物反應(yīng)器中生長直至達到細胞生物 量為10% -70%。細胞生物量達到10% -70 %后，通過任何合適方式從該大規(guī)模生物反應(yīng) 器中收獲果實細胞并進一步加工。根據(jù)一些實施方案，將果實細胞通過干燥、凍干、冷凍干 燥和噴霧干燥等進一步加工。根據(jù)一些實施方案，果實細胞的加工不包括從中提取活性成 分。
[0196] 根據(jù)一些實施方案，大規(guī)模方法可包括將細胞從培養(yǎng)瓶中接種于可以是任何大小 的生物反應(yīng)器并收獲細胞的一個步驟。根據(jù)其它的實施方案，果實細胞可以接種于一系列 生物反應(yīng)器中，其中每個生物反應(yīng)器通常大于前一個使用的生物反應(yīng)器。根據(jù)本發(fā)明大規(guī) 模方法進行任何數(shù)目的額外的步驟。額外的步驟包括可能的中間步驟，其中收獲細胞或接 種及置于更大的生物反應(yīng)器中及生長直至收獲或接種并轉(zhuǎn)移至更大的生物反應(yīng)器。根據(jù)進 一步的實施方案，該方法包括使從大規(guī)模生物反應(yīng)器中收獲的果實細胞生長的額外步驟。
[0197] 本發(fā)明的各個方面在如下實施例中更詳細描述，這些代表本發(fā)明的實施方案，不 限制本發(fā)明的范圍。 實施例
[0198] 實施例1:生產(chǎn)-工業(yè)化水平規(guī)模
[0199] 1 ?材料和方法
[0200]生產(chǎn)方法涵蓋在具有五個階段的逐步方法中增殖葡萄細胞。從在Erlenmeyer搖 瓶中增殖葡萄細胞開始，在小和大規(guī)模生物反應(yīng)器中進一步增殖。關(guān)鍵因素是在不同的生 物反應(yīng)器規(guī)模中的增殖期間維持細胞中次生代謝物白藜蘆醇的高水平。在最后的大規(guī)模增 殖階段結(jié)束時，在要求的生物量，收獲細胞并干燥以產(chǎn)生精細的粉-紫色粉末，產(chǎn)生干燥細 胞（RGC)生物量，用于不同的醫(yī)學應(yīng)用。
[0201]形成葡萄細胞系
[0202] 來自葡萄橫切片的愈傷組織：從田間生長在開花后20-50天的葡萄植物中收 獲4-8cm長的幼葡萄串，在流動的自來水中徹底沖洗。將無種子葡萄Vitis vinifera cv. 〃AVNIR 825〃(Agraman與Gamay red的雜交種）的綠色未成熟衆(zhòng)果在含有1.3%w/ V次氯酸鈉和（0.l%v/v)Tween 20(作為增濕劑）的溶液中滅菌10分鐘，。使用外科 手術(shù)刀將外植體切成2-3mm長度橫切片，在補加過濾滅菌的1.7mM抗壞血酸和0.8mM檸 檬酸、l〇〇mg/l DTT(二硫蘇糖醇）和50mg/l乙酰半胱氨酸的半強度MS(Murashige and Skoog，1962, Physiol Plant 15:473-497)液態(tài)基本培養(yǎng)基中進行。將如下抗氧化劑加入 切割培養(yǎng)基中：PVP(0. 5和lg/l)、L-半胱氨酸（150mg/l)、五倍子酸（1.5mg/l)、DTT(70mg/ 1)、生物喋呤（15mg/l)，抗壞血酸（150mg/l)和檸檬酸（150mg/l)，以抑制細胞壞死 (necrogenesis)及使得可以回收綠色健康衆(zhòng)果片。
[0203] 將衆(zhòng)果片置于100個含有25ml高壓滅菌的用0? 25% Gelrite固化Murashige and Skoog，MS培養(yǎng)基的15mm培養(yǎng)平板中。在102kpa高壓滅菌15分鐘之前將pH調(diào)節(jié)為pH 5.9。將每個均含有25個漿果片的30個平板用Parafilm密封及在26°C避光溫育3天。將 培養(yǎng)物在25°C由冷白光熒光管提供15-30 y molm 2sh輻照度的16小時光照期下溫育。MS 鹽和維生素培養(yǎng)基也補加250mg/l酪蛋白水解物、2%蔗糖和100mg/l肌醇。對于愈傷組織 誘導，還補加0. 2mg/l激動素和0. lmg/1 NAA(a -萘基乙酸），培養(yǎng)基稱作RD1。
[0204] 在培養(yǎng)開始3-4周后，沿著漿果片可見綠色和紅色愈傷組織混合物。該愈傷組織 由易碎的延長的細胞組成，其中一些呈現(xiàn)出花青素深色著色。選擇富集花青素的愈傷組織 部分并單獨傳代培養(yǎng)增殖。綠色愈傷組織部分單獨培養(yǎng)。
[0205] 來自葡萄皮細胞的愈傷組織：從田間生長的葡萄植物在開花20-50天后收 獲4-8cm長的幼葡萄串，在流動的自來水中徹底沖洗。將無種子葡萄Vitisvinifera cv. 〃AVNIR 825〃(Agraman與Gamay red的雜交種）的綠色不成熟衆(zhòng)果在含有1.3%w/v 次氯酸鈉和（〇. l%v/v)Tween 20(作為增濕劑）的溶液中滅菌10分鐘。通過在衆(zhòng)果皮 做3-8mm切口并使用無菌鑷子僅剝皮而分離漿果皮。果皮分離在補加過濾滅菌的1. 7mM 抗壞血酸和〇? 8mM檸檬酸、100mg/l DTT (二硫蘇糖醇）和50mg/l乙酰半胱氨酸的半強度 MS(Murashige and Skoog，1962)液態(tài)基本培養(yǎng)基中進行。
[0206] 將果皮置于RD-1培養(yǎng)基中。在大約10-14天后，在果皮切割表面上開始發(fā)育出細 胞叢。選擇富集花青素的細胞并在新鮮培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)以進一步增殖。
[0207] 來自葡萄種皮的愈傷組織：從田間生長的葡萄植物在開花20-50天后收獲4-8cm 長的幼葡萄串，在流動的自來水中徹底沖洗。將無種子葡萄Vitisvinifera cv."AVNIR 825〃(Agraman與Gamay red的雜交種）的綠色不成熟衆(zhòng)果在含有1. 3% w/v次氯酸鈉和 (0. 1% vAOTween 20(作為增濕劑）的溶液中滅菌10分鐘。將漿果切開以顯露幼綠色發(fā) 育中種子。切下未成熟種皮并置于培養(yǎng)基上。在補加過濾滅菌的1.7mM抗壞血酸和0.8mM 朽1檬酸、l〇〇mg/l DTT(二硫蘇糖醇）和50mg/l乙酰半胱氨酸的半強度MS(Murashige and Skoog，1962)液態(tài)基本培養(yǎng)基中進行分離。
[0208] 將種皮切片置于RD-1培養(yǎng)基中。在大約12-20天后，種皮變成褐色，在種皮外植 體的頂部開始出現(xiàn)愈傷組織。選擇富于紅-褐色著色的細胞并在新鮮培養(yǎng)基中進一步傳代 培養(yǎng)以進一步增殖。
[0209] 液態(tài)培養(yǎng)物的建立：液態(tài)培養(yǎng)物通過在50ml不同培養(yǎng)基（RD1-RD6,見下文）中加 l〇g愈傷組織而建立。在固體培養(yǎng)基上成功建立的所有細胞系在缺少膠凝劑的相同培養(yǎng)基 組合中呈現(xiàn)均勻細胞懸浮液。加入70mg/l DTT或者150mg/l抗壞血酸或檸檬酸改善漿果 來源的懸浮培養(yǎng)物的生長及抑制細胞necrogenesis。所有外植體類型均成功用于建立液態(tài) 培養(yǎng)物。每7-10天將培養(yǎng)物在新鮮生長培養(yǎng)基中常規(guī)傳代培養(yǎng)。
[0210] 導入以建立漿果來源的愈傷組織細胞系的其它葡萄種屬：使用上述方案培養(yǎng)如下 葡萄屬物種：
[0211] 森林葡萄、V. muscadinia、圓葉葡萄、河岸葡萄、夏特沃氏葡萄、V. lubrisca、 V. daviddi、山葡萄、V. romanelli、夏葡萄、辛西安那葡萄、V. cineria、V. palmate、 V. munsoniana、霜葡萄、Hybrid A23-7-71、V. acerifolia、V. treleasei 和樺葉葡萄。
[0212] 歐洲葡萄橫切片、葡萄皮和葡萄種子的愈傷組織產(chǎn)生的效力在下表A中例證。
[0213]表 A
[0214]
[0215] 在這項研究中使用的一些葡萄屬物種的不同愈傷組織"類型"產(chǎn)生的效力在下表 B中概括顯示。
[0216]表 B
[0217]
[0218] (B-漿果片，SC-種皮，S-果皮）
[0219]階段 1:Erlenmeyer，搖瓶
[0220] 將紅葡萄細胞在持續(xù)熒光（lOOOlx)在25±5°C溫度下在定軌搖床上的1L Erlenmeyer瓶中懸浮生長。生長培養(yǎng)基含有Gamborg B5培養(yǎng)基和維生素，及補加250mg/ 1酪蛋白水解物、2-4%蔗糖、100mg/l肌醇、0? 2mg/l激動素和0? lmg/1 NAA(1-萘乙酸）、 25-45mM KN03、l-15mM MgS04或者 5-35mM MgN03及 ImM NaH2P04(pH 5.8)。每 6-11 天將細 胞傳代培養(yǎng)。
[0221 ] 階段2:小規(guī)模生物反應(yīng)器
[0222] 通過將在階段1的Erlenmeyer中生長7-16天的細胞懸浮液在25±5°C接種于 4-8L-次性生物反應(yīng)器中。將細胞在持續(xù)熒光（lOOOlx)下在生長培養(yǎng)基中懸浮生長，所述 生長培養(yǎng)基含有補充的Gamborg B5鹽和維生素培養(yǎng)基，補加250mg/l酪蛋白水解物、2-4 % 蔗糖、100mg/l 肌醇、25-45mM KN03、l-15mM MgS04S 5-35mM MgN03及 ImM NaH2P04、0. 2mg/l 激動素和〇. lmg/1 NAA(1-萘乙酸）（pH 5. 4-5. 8)。每9-16天將細胞傳代培養(yǎng)。
[0223] 階段3:大規(guī)模生物反應(yīng)器
[0224] 將在小規(guī)模生物反應(yīng)器中生長的細胞懸浮液接種于30-50L -次性生物反應(yīng)器 中。將細胞在持續(xù)熒光（lOOOlx)下在25±5°C懸浮生長。生長培養(yǎng)基含有補充的Gamborg 85鹽和維生素培養(yǎng)基，補加25〇1^/1酪蛋白水解物、2-4%蔗糖、10〇11^/1肌醇、25-451111 KN0 3、l-15mM MgS04S 5-35mM MgN03及 ImM NaH2P04、0. 2mg/l 激動素和 0? lmg/1 NAA(1-萘 乙酸）（pH5. 4-5. 8)。每12-30天將細胞傳代培養(yǎng)。
[0225] 階段4:更大規(guī)模生物反應(yīng)器
[0226] 將在小或大規(guī)模生物反應(yīng)器中生長的細胞懸浮液接種于300-1000L -次性生物 反應(yīng)器中。將細胞在持續(xù)熒光（lOOOlx)下在25±5°C懸浮生長。生長培養(yǎng)基含有補充的 6&11113〇找135鹽和維生素培養(yǎng)基，補加25〇11^/1酪蛋白水解物、2-4%鹿糖、10〇11^/1肌醇、 25-45mM KN03、l-15mM MgS04或 5-35mM MgN03及 ImM NaH2P04、0.2mg/l 激動素和 0.1mg/l NAA(1-萘乙酸）（pH 5. 4-5. 8)。
[0227] 階段5:收獲
[0228] 細胞達到10% -70% (w/v)細胞生物量后，收獲細胞。將收獲的細胞干燥以產(chǎn)生 精細的粉色-紫色粉末，具有典型成分、味道和氣味。
[0229] 實施例2 :培養(yǎng)基成分和生物反應(yīng)器設(shè)計對在大規(guī)模生物反應(yīng)器中生長的紅葡萄 細胞中白藜蘆醇水平的影響
[0230] 2. 1培養(yǎng)基成分
[0231] 實驗1:培養(yǎng)基成分對在Erlenmeyer搖瓶中生長的紅葡萄細胞中白藜蘆醇量的影 響
[0232] 將紅葡萄細胞如實施例1階段1所述在Erlenmeyer搖瓶中不同培養(yǎng)基成分中生 長：MS、WP、WP+酪蛋白、Gamborg B5。結(jié)果示于表1，表明在Gamborg B5培養(yǎng)基中生長的細 胞與在MS、WP、WP+酪蛋白培養(yǎng)基中生長的細胞相比產(chǎn)生高大約4-15倍的白藜蘆醇水平。
[0233] 表 1
[0234]
[0235] *數(shù)據(jù)是至少兩個實驗的平均數(shù)。
[0236] 林MS-Murashige and Skoog 培養(yǎng)基（Toshio Murashige and Folke K. Skoog in 1968)
[0237] ***WP - Woody 植物培養(yǎng)基（WP) (Lloyd and McCown, 1981)
[0238] 實驗2 :培養(yǎng)基成分對生長及在大規(guī)模一次性生物反應(yīng)器中生長的紅葡萄細胞中 的白藜蘆醇水平的影響
[0239] 將紅葡萄細胞在大規(guī)模一次性生物反應(yīng)器中如實施例1階段3所述在不同培養(yǎng)基 成分中生長。
[0240] 將紅葡萄細胞在兩種類型培養(yǎng)基中生長：Gamborg B5培養(yǎng)基和補充的Gamborg B5。如下表2所示，補加的具有高水平鎂、磷酸鹽和硝酸鹽或硫酸鹽（KN03、MgS0 4、MgN03、 NaH2P04)的Gamborg B5培養(yǎng)基與在非補充的Gamborg B5培養(yǎng)基中生長相比獲得較高的紅 葡萄細胞生物量。
[0241] 表2 :在Gamborg B5和補充的Gamborg B5培養(yǎng)基中在大規(guī)模生物反應(yīng)器中紅葡 萄細胞的生長
[0242]
[0243] *數(shù)據(jù)是三個實驗的平均數(shù)。
[0244] 此外，檢驗培養(yǎng)基成分對于在大規(guī)模一次性生物反應(yīng)器中生長的紅葡萄細胞中白 藜蘆醇和總多酚水平的影響。將細胞在WP培養(yǎng)基及在含有不同濃度鎂、硝酸鹽和磷酸鹽 (相應(yīng)的是KN03、MgS04、MgN03、謂03和NaH2P04)的GamborgB5培養(yǎng)基中生長。表3表明這 些鹽為生產(chǎn)高水平多酚和白藜蘆醇所需要，特別是當加入補充的GamborgB5培養(yǎng)基中時。 在WP培養(yǎng)基中不同，其總多酚和白藜蘆醇水平非常低。
[0245] 圖4顯示紅葡萄細胞在大規(guī)模一次性生物反應(yīng)器在補充的Gamborg B5培養(yǎng)基中 生長的生長曲線。細胞經(jīng)歷指數(shù)生長，在第20