專利名稱：大豆的突變雄性不育基因的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及含有突變的雄性不育基因的大豆(Glycine max)種子，大豆植物，大豆品種和大豆雜種。本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)雜種大豆種子和植物的方法。
雄性不育是植物的一種狀態(tài)，其中雄性配子體的功能被阻止了，但保留了雌性繁殖的潛力。根據(jù)遺傳方式，有兩種雄性不育的一般類型1)基因的或核雄性不育(gms)和2)細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cms)。雄性不育突變提供了植物育種，遺傳學(xué)，繁殖生物學(xué)和分子生物學(xué)中研究的源物質(zhì)。
雄性不育已經(jīng)用于大豆育種研究(Brim，C.A.等人，在大豆中應(yīng)用遺傳雄性不育再現(xiàn)選擇方案，作物科學(xué)13528-530，1973；Lewers，K.S.，等人，雜種大豆種子生產(chǎn)三個(gè)方法的比較，作物科學(xué)(出版中)，1996)，但至今，雄性不育還沒(méi)有用于雜種種子的商業(yè)生產(chǎn)，因?yàn)槟壳斑€不能生產(chǎn)大量的雜種種子。在過(guò)去二十年間，在大豆中已經(jīng)報(bào)道了6個(gè)基因性雄性不育突變(ms1，ms2，ms3，ms4，ms5和ms6)(Palmer，R.G.等人，在大豆和玉米中的雄性不育發(fā)育比較，細(xì)胞核(Calcutta)351-18，1992)。所有這些均是以單基因隱性性狀遺傳的核突變。在大豆中還沒(méi)有證實(shí)細(xì)胞質(zhì)雄性不育。
已經(jīng)有人在許多作物種類育種程序中推薦了基因性雄性不育突變體(Horner，H.T.，等人，基因性雄性不育的機(jī)制，作物科學(xué)，351527-1535，1995)。雜種種子的控制生產(chǎn)是育種程序和遺傳研究所必需的。最可行的方法應(yīng)該利用雄性不育基因座和幼苗標(biāo)記基因座之間的緊密的基因連鎖。在大豆中，已知利用在雄性不育基因座和幼苗標(biāo)記基因座(W1)之間的緊密的遺傳連鎖(Skorupska，H.，等人，ms6雄性不育大豆的遺傳學(xué)和細(xì)胞學(xué)，J Hered.80403-410，1989)作為生產(chǎn)F1種子的共分離方法(Lewers，K.S.等人，出處同上)。與幼苗標(biāo)記基因座連鎖的其它大豆基因性雄性不育的鑒定將減少單個(gè)基因性雄性不育的大豆生產(chǎn)的遺傳脆弱性。
Marrewijk，G.A.M.V.，矮牽牛中的細(xì)胞質(zhì)雄性不育I.參照特定的環(huán)境影響恢復(fù)可育性，Euphytica 181-20，1969，報(bào)道了將部分雄性不育系統(tǒng)的表型效果進(jìn)行環(huán)境修飾。溫度比任何其它環(huán)境因子具有更大的影響但是，水應(yīng)力，光期，營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，激素應(yīng)用也影響了雄性不育表型(Heslop-Harrison，J.，在開(kāi)花植物中性表達(dá)的實(shí)驗(yàn)修飾，生物綜述，3238-90，1957；Edwardson，J.R.，細(xì)胞質(zhì)雄性不育，BotRev36341-420，1970)。在大豆中，溫度影響了msp突變體(Stelly，D.M.，等人，大豆Glycine max(L.)Merr的部分雄性不育突變系msp表型變化的鑒定，Euphytica 29539-546，1980；和Carlson，D.R.，等人，溫度對(duì)部分雄性不育大豆中雄性不育的表達(dá)的影響，作物科學(xué)，25646-648，1985)。
雄性不育大豆突變體ms2和ms3導(dǎo)致四分體的退化，因?yàn)樽柚沽藦陌℃咦拥挠鷦?chuàng)葡聚糖壁釋放小孢子，這也是在其它非豆科物種中敘述的現(xiàn)象。例如，在cms矮牽牛花藥中愈創(chuàng)葡聚糖沒(méi)有在適當(dāng)時(shí)間開(kāi)裂導(dǎo)致了不育(Frankel，R.等人，在矮牽牛中愈創(chuàng)葡聚糖酶活性和細(xì)胞質(zhì)雄性不育的時(shí)間性，生物化學(xué)遺傳學(xué)3451-455，1969)。愈創(chuàng)葡聚糖的滯留似乎是阻止了發(fā)育代謝過(guò)程(愈創(chuàng)葡聚糖壁強(qiáng)加的物理壓力)和在雄性細(xì)胞和花藥室液體之間以及雄性細(xì)胞和周圍組織之間的細(xì)胞間交流。
已經(jīng)在幾個(gè)雄性不育系統(tǒng)中觀察到愈創(chuàng)葡聚糖酶(callase)的不正常行為。前面的研究表明在絨氈層中合成了愈創(chuàng)葡聚糖酶，然后分泌進(jìn)入花藥室，并且降解圍繞小孢子四分體的愈創(chuàng)葡聚糖壁。所以，絨氈層生產(chǎn)和釋放愈創(chuàng)葡聚糖酶的時(shí)間似乎是正?；ǚ郯l(fā)育的關(guān)鍵(Eschrich，W.，Untersuchungen uber den Ab-und Aufbau der Callose，Z Bot 49153-218，1961；Frankel，R.，等人，Supra；Mepham，R.H.，等人，在Tradescantia bracteata中絨氈層周緣質(zhì)團(tuán)的形成和發(fā)育，原生質(zhì)68446-452，1969；Izhar，S.，等人，在矮牽牛中的雄性不育的機(jī)制pH、花藥中愈創(chuàng)葡聚糖酶的活性和小孢子發(fā)生的停止之間的關(guān)系，理論應(yīng)用遺傳學(xué)44104-108，1971；Stieglitz，H.，等人，在發(fā)育的百合花藥中β-1，3-葡聚糖酶活性的調(diào)節(jié)，發(fā)育生物學(xué)34169-173，1973；Worrall，D.等人，小孢子母細(xì)胞愈創(chuàng)葡聚糖壁的熟前分解引起轉(zhuǎn)基因煙草的雄性不育，植物細(xì)胞，4759-771，1992；和Tsuchiya，T，等人，內(nèi)-1，3-葡聚糖酶基因的特異于絨氈層的表達(dá)引起轉(zhuǎn)基因煙草中的雄性不育，植物細(xì)胞生理學(xué)36487-494，1995)。在雄性不育高粱(Warmke，H.E.等人，高粱中的細(xì)胞質(zhì)雄性不育I.在可育和不育花藥中的愈創(chuàng)葡聚糖行為，J.Hered 63103-108，1972)和在cms矮牽牛(Izhar，S.等人，出處同上)中觀察到愈創(chuàng)葡聚糖的熟前分裂。Worrall，D.等人，出處同上和Tsuchiya，T.等人，出處同上，報(bào)道了愈創(chuàng)葡聚糖的熟前分裂引起轉(zhuǎn)基因煙草中的雄性不育。在ms2(Graybosch，R.A.，等人，大豆(Glycerine max)中的雄性不育I.ms2突變體的表型表達(dá)，Am J Bot 721751-1764，1985)和ms3大豆(Buntman，D.J.等人，正常和雄性不育(ms3)突變大豆(Glycine max)的小孢子發(fā)生，掃描電子顯微鏡學(xué)1983913-922，1983)，在cms胡椒(Homer，H.T.Jr.等人，在amel-不育胡椒(Capsicum annuum L.)中小孢子發(fā)生的光學(xué)和電子顯微鏡研究的比較，Can J Bot 52435-441，1974)，在cms向日葵(Horner，H.T.Jr.，在雄性不育和細(xì)胞質(zhì)雄性不育向日葵(Helianthusannuus L.)，中小孢子發(fā)生的光學(xué)和電子顯微鏡研究的比較，Am JBot64745-759，1977)報(bào)道了愈創(chuàng)葡聚糖的不降解或延遲降解。這些研究表明愈創(chuàng)葡聚糖酶活性的時(shí)間性是小孢子正常發(fā)育的關(guān)鍵。
F1雜種大豆種子生產(chǎn)的主要障礙是大量的授粉需要大量的手工勞動(dòng)。
如果可以，在大豆中利用可靠的雄性不育基因可以增加雌性植物上的結(jié)種數(shù)，并且將導(dǎo)致費(fèi)用效率的增加，和雜種大豆種子的產(chǎn)率。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及大豆種子，大豆植物，大豆品種以及產(chǎn)生大豆植物的方法。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及具有本發(fā)明的突變雄性不育基因的大豆植物。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)將本發(fā)明的雄性不育植物與另一個(gè)大豆植物雜交生產(chǎn)雜種大豆種子和植物的方法。本發(fā)明也涉及將遺傳雄性不育基因轉(zhuǎn)移到其它遺傳背景中。本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明為了對(duì)用于說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)的一些術(shù)語(yǔ)進(jìn)行理解，提供了下面的定義結(jié)種數(shù)一該術(shù)語(yǔ)指在植物成熟時(shí)在一株植物上種子的總數(shù)。
利用本發(fā)明的新雄性不育雌性可育大豆突變體進(jìn)行遺傳和細(xì)胞學(xué)研究。這一突變體是完全的雄性不育，并且作為命名為msMOS的單個(gè)隱性基因遺傳的。在F1或F2代互交授粉之間觀察到在該隱性等位基因中雌性或雄性配子的轉(zhuǎn)移沒(méi)有差別。對(duì)于任何先前鑒定的大豆基因性雄性不育突變體ms1，ms2，ms3，ms4，ms5，或ms6，這一突變體是非等位基因的。在不育和花色(W1)基因座之間，或在不育和柔毛色(T1基因座)之間沒(méi)有檢測(cè)到連鎖。對(duì)可育和不育花藥中的小孢子發(fā)生進(jìn)行了光學(xué)顯微鏡和細(xì)胞學(xué)觀察。雄性不育植物中小孢子母細(xì)胞(MMC)的結(jié)構(gòu)與雄性可育植物中的MMC相同。酶提取分析顯示在雄性不育花藥中沒(méi)有愈創(chuàng)葡聚糖酶活性，這表明正常在后四分體時(shí)期在四分體周圍降解的愈創(chuàng)葡聚糖壁的滯留引起了不育。來(lái)自雄性不育花藥的絨氈層也在四分體時(shí)期和后期顯示了不正常性，表現(xiàn)為不正常地形成小室，以及積累致密染色物質(zhì)。在成熟時(shí)，來(lái)自不育植物的花藥沒(méi)有花粉粒。
已經(jīng)概括了對(duì)大多數(shù)大豆突變體的遺傳和發(fā)育再生生物學(xué)的觀察結(jié)果(Graybosch，R.A.等人，大豆中的雄性不育的總結(jié)，Am J Bot75144-156 1988；Palmer，R.G.，等人，出處同上)。在大豆突變體ms2和ms3中，雄性不育是由于在四分體時(shí)期愈創(chuàng)葡聚糖分解的失敗引起了小孢子的敗育。在本發(fā)明中觀察到了導(dǎo)致如Jin，W.等人，新基因性雄性不育大豆(Glycine max(L.)Merr.)的遺傳學(xué)和細(xì)胞學(xué)，有性植物再生1013-21；1997(引入本文作為參考)中所述的潛在的新雄性不育系中小孢子不育的相同現(xiàn)象。
至今，在大豆中還不知道在雌性親本上產(chǎn)生高結(jié)種數(shù)的雄性不育基因。本發(fā)明的突變等位基因允許在雌性親本上的高結(jié)種數(shù)。這一高結(jié)種率是經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)雜種大豆種子的關(guān)鍵。
遺傳數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的雄性不育大豆(“ms”)是基因性雄性不育(gms)和單個(gè)隱性等位基因單基因控制的。根據(jù)溫室育種實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，這是完全雄性不育系。引起雄性不育的突變發(fā)生在區(qū)別于已經(jīng)鑒定的ms1，ms2，ms3，ms4，ms5和ms6大豆系的基因座上。在利用ms3和ms4的雜交組中觀察到了偏斜比例。這是測(cè)試的小量F2家族的結(jié)果，因?yàn)镕3數(shù)據(jù)證實(shí)了F2數(shù)據(jù)，而不是ms和ms3和ms4之間的配子相互作用。
已經(jīng)利用緊密連鎖的標(biāo)記基因座(W1)和雄性不育基因座(ms6)的共分離生產(chǎn)大量的F1雜種大豆種子(Lewers，K.S.等人，出處同上)。發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的突變系中W1和T1基因座是獨(dú)立于ms基因座的，這排除了在利用本發(fā)明的ms系的任何大豆育種程序中利用這些標(biāo)記。
夏季溫室環(huán)境不影響本發(fā)明的大豆品系的雄性不育基因的表達(dá)。與已知的雄性不育大豆突變體比較，這一新的gms突變體在表型上相似于ms2和ms3，但遺傳學(xué)上是非常不同的，因?yàn)樗鼈冇刹煌幕蚩刂?。所有三個(gè)突變體均導(dǎo)致四分體的退化，因?yàn)閺陌℃咦拥挠鷦?chuàng)葡聚糖壁釋放小孢子被阻止，這也是在其它非豆科種類中描述的現(xiàn)象。與在ms2和ms3中以及在非豆科如cms胡椒和cms向日葵中看到的相似，在本發(fā)明的ms突變系中觀察到愈創(chuàng)葡聚糖不降解或延遲降解。
在許多被子植物的雄性不育突變中，不正常的絨氈層活性或熟前的退化與小孢子的敗育相關(guān)(Laser，K.D.等人，在細(xì)胞質(zhì)雄性不育被子植物中小孢子發(fā)生的解剖學(xué)和細(xì)胞學(xué)，Bot Rev 38425-454，1972；Gottschalk，W.等人，在高等植物中小孢子母細(xì)胞的遺傳控制，核(Calcutta)17133-166，1974；和Koltunow，A.M.等人，在花藥發(fā)育過(guò)程中發(fā)生的不同時(shí)間和空間的基因表達(dá)方式，植物細(xì)胞21201-1224，1990)。本發(fā)明的大豆雄性不育突變系中最明顯的絨氈層細(xì)胞的畸形是細(xì)胞增大，積累未鑒定的致密染色物質(zhì)和熟前退化。根據(jù)染色，懷疑這一累積的物質(zhì)是孢粉素或它的前體。據(jù)認(rèn)為絨氈層是孢粉素前體合成的位點(diǎn)(Echlin，P.，被子植物的小孢子發(fā)生過(guò)程中絨氈層的作用，Heslop-Harrison J編輯的《花粉發(fā)育和生理學(xué)》，Butterworths，倫敦，41-61，1971；Horner，H.T.，Jr等人，在Helianthusannuus(Cornpositae Heliantheae)中花粉壁和孔的發(fā)育，Am J Bot 65293-309，1978；和Nakashima，H.等人，來(lái)自正常和ms3突變大豆(Glycine max(L.)Merr.)的花藥的組織學(xué)特征，作物科學(xué)24735-739，1984)。
不希望受理論的束縛，在這一新的基因性雄性不育系中不育的原因至少有三個(gè)可能性(1)不產(chǎn)生愈創(chuàng)葡聚糖酶，或產(chǎn)生的水平低于消化存在的愈創(chuàng)葡聚糖的臨界水平；(2)愈創(chuàng)葡聚糖酶具有分子缺陷；和(3)在花藥室的液體環(huán)境(例如，由于亞適pH)中愈創(chuàng)葡聚糖酶沒(méi)有活性。第四個(gè)理論可能性，即愈創(chuàng)葡聚糖是分子缺陷的已經(jīng)利用粗花藥酶提取物測(cè)試了，并且不歸結(jié)為這一品系雄性不育的原因。利用來(lái)自雄性不育花藥的粗提取物可以消化突變體ms系的花藥的四分體愈創(chuàng)葡聚糖壁。
本發(fā)明的新的基因性雄性不育系由于高水平的結(jié)種數(shù)對(duì)于部分的育種程序是有價(jià)值的。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“植物”包括植物細(xì)胞，植物原生質(zhì)體，可以再生大豆植物的組織培養(yǎng)的植物細(xì)胞，植物愈傷組織，植物團(tuán)塊，和在植物或植物的部分中是一個(gè)整體的植物細(xì)胞，如花粉，花，種子，莢，葉子，莖和諸如此類。
實(shí)施例提供了下面的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，并且不打算在附加的權(quán)利要求中闡述的限制下再限制本發(fā)明。實(shí)施例1 在ms突變體大豆系中證實(shí)雄性不育從Midwest Oilseeds，Adel，Iowa獲得了雄性不育系msMOS的種子。這一品系在田間具有不尋常的高結(jié)種數(shù)。為了測(cè)試雄性不育的完整性，在1995年夏天，在缺乏昆蟲(chóng)授粉者時(shí)，在Iowa州大學(xué)，Ames的溫室培養(yǎng)已知雜合子的子代300個(gè)植物。在花開(kāi)期，根據(jù)存在或缺乏花粉將植物分類成可育和不育。將可育植物去雜。保存雄性不育植物，并且在植物完全開(kāi)花后一個(gè)月檢測(cè)結(jié)種數(shù)。
在不存在昆蟲(chóng)授粉者的溫室實(shí)驗(yàn)中，在雄性不育植物中沒(méi)有形成莢，表明這是完全的雄性不育系，并且夏季溫室環(huán)境(1995年6月到8月)沒(méi)有影響雄性不育基因的表達(dá)。實(shí)施例2 ms突變體大豆系的遺傳分析為了確定是否突變是細(xì)胞質(zhì)雄性不育突變體，進(jìn)行了遺傳研究。為了確定是在新基因座產(chǎn)生新突變，還是在表1顯示的先前敘述的基因座(ms1，ms2，ms3，ms4，ms5或ms6)的一個(gè)出現(xiàn)了獨(dú)立的突變，進(jìn)行了等位性測(cè)試。利用已知的退化的不育純合體作為雌性親本和來(lái)自Midwest Oilseeds的F1雜種(雜合體)作為雄性親本進(jìn)行雜交。在Iowa州立大學(xué)，Ames，或在Puerto大學(xué)Rico大豆育種繁育場(chǎng)(IsabelaSubstation，Isabela，Puerto Rico)的溫室種植F1種子。在靠近Ames，Iowa的Bruner農(nóng)場(chǎng)將F1植物單一植物脫粒并種植F2種子。對(duì)于一些雜交組合，在Puerto Rico將可育的F2植物單一植物脫粒并種植F3種子。在成熟時(shí)就雄性不育/可育劃分所有的F1，F(xiàn)2和F3植物。表1在大中基因性雄性不育雌性可育突變體的表型表達(dá)。還沒(méi)有細(xì)胞學(xué)地研究突變體ms5 ms5；ms ms ms ms是本發(fā)明的突變體。突變體 性母細(xì)胞 四分體 小孢子 花粉ms1 ms1 --- 不能胞質(zhì)分裂，絨氈層退化 --- ---ms2 ms2 --- 愈創(chuàng)葡聚糖滯留，不形成小孢子壁， --- ---絨氈層退化ms3 ms3 --- 愈創(chuàng)葡聚糖滯留，小孢子壁開(kāi)始形成，--- ---絨氈層退化ms4 ms4--- 不能胞質(zhì)分裂，絨氈層退化 --- ---ms6 ms6--- 絨氈層退化--- ---msp msp在前成熟分裂細(xì)胞和花粉時(shí)期之間發(fā)生了不一致，敗育msmsmsms --- 愈創(chuàng)葡聚糖滯留，小孢子壁開(kāi)始形成 --- ---
從等基因測(cè)試進(jìn)行了F2家族的分類。如果msMOS是在不同于所測(cè)試的基因座上的突變體，F(xiàn)1群體將只含有雄性可育植物，在F2，50％的F1起源的家族將以3個(gè)雄性可育植物比1個(gè)雄性不育植物的比例分離，50％將產(chǎn)生9個(gè)雄性可育植物比7個(gè)雄性不育植物的群體。在任何F1子代中沒(méi)有觀察到雄性不育植物。這表明在本發(fā)明的基因性雄性不育突變體中雄性不育的等位基因是在不同于6個(gè)已知的大豆基因雄性不育基因座的基因座上。在F2子代中，存在具有差不多同等頻率的兩個(gè)家族種類，除了ms3和ms4。這些家族以3∶1或9∶7的比例分離。這些數(shù)據(jù)表明單個(gè)隱性等位基因單基因控制了ms雄性不育，并且所以不同于6個(gè)已知的大豆雄性不育基因座。關(guān)于ms3和ms4，在F2子代中存在兩種分離的方式。對(duì)于ms3，11個(gè)家族以3∶1的比例分離，2個(gè)家族以9∶7的比例分離。從ms3雜交結(jié)合的可育的F2(9∶7)家族遺傳的F3植物的分類證實(shí)了F2(9∶7)的比例。對(duì)于ms4，1個(gè)家族以3∶1比例分離，7個(gè)家族以9∶7的比例分離。同樣，從ms4雜交結(jié)合的單個(gè)F2(3∶1)家族遺傳的F3植物的分類證實(shí)了F2(3∶1)的比例。
利用來(lái)自Midwest Oilseeds的F1雜種作為雄性親本進(jìn)行雄性配子轉(zhuǎn)移測(cè)試。利用5個(gè)植物導(dǎo)入(P1)系(P191167，P1261474，P1427099，P1297544，P1227333)和栽培品種A.K.Harrow作為雌性親本進(jìn)行雜交授粉。
在表2和3中顯示了在雄性配子轉(zhuǎn)移測(cè)試中從雜交授粉獲得的F2植物的分類。表2顯示了非分離和分離家族的比例是1∶1，表明兩個(gè)雄性配子等同轉(zhuǎn)移。在分離的F2家族中觀察到了3個(gè)可育植物比1個(gè)不育植物的比例(表3)，表明利用單個(gè)隱性基因?qū)е铝诵坌圆挥?。所以，命名本發(fā)明的基因性雄性不育突變體為msms，它的可育雜合體為msms msms。表2雄性配子體轉(zhuǎn)移測(cè)試F2數(shù)據(jù)雜交組合 家族數(shù)X2(1∶1) P(df＝1)不分離 分離PI 91167xM2 9 17 2.46 0.12PI 261474xM2 10 8 0.22 0.64PI 427099xM2 7 6 0.08 0.78PI 297544xM2 12 6 2.00 0.16PI 227333xM2 8 9 0.06 0.81A.K.HarrowxM26 5 0.09 0.76總數(shù) 52 51 0.01 0.92表3在分離的F2家族中可育/不育的分離雜交組合 植株數(shù) X2(3∶1) P(df＝1)可育不育PI 91167xM2 978 306 0.93 0.33PI 261474xM2 505 161 0.24 0.62PI 427099xM2 379 136 0.55 0.46PI 297544xM2 479 159 0.00 1.00PI 227333xM2 747 249 0.00 1.00A.K.HarrowxM2 449 129 2.21 0.14總數(shù) 353711400.97 0.32在本發(fā)明的雄性不育突變體和花色基因座(W1)之間，和雄性不育突變體和柔毛色(T1)基因座之間進(jìn)行連鎖測(cè)試。對(duì)于列出為Xx和Yy的基因?qū)?，利用一般的關(guān)系a＝XY，b＝Xy，c＝xY和d＝xy(Skorupska，H.，等人，出處同上)表示連鎖測(cè)定。在開(kāi)花時(shí)將植物分類成具有紫色或白色的花，在成熟時(shí)，將植物分類成具有黃灰色或灰色的柔毛。
在ms和W1(花色)基因座之間測(cè)試連鎖，利用P＝0.45計(jì)算X2＝2.65，并且對(duì)于在msms和T1(柔毛色)基因座之間的獨(dú)立分類，X2＝0.30和P＝0.96。在兩個(gè)測(cè)試中，觀察到的值符合預(yù)期的比例9∶3∶3∶1。在ms和W1基因座或在ms和T1基因座之間沒(méi)有連鎖。實(shí)施例3 在雄性不育大豆中花藥發(fā)育的細(xì)胞學(xué)分析從雄性可育和雄性不育植物收集各種大小的再生芽獲得花藥和花粉發(fā)育細(xì)胞學(xué)觀察。在I2K1的水溶液中壓扁后期的花藥鑒定雄性可育和雄性不育植物(Jensen，W.A.，植物組織化學(xué)，F(xiàn)reeman，舊金山，203頁(yè)，1962)；來(lái)自雄性可育植物的花藥展示了密度染色花粉粒，而來(lái)自雄性不育植物的花藥差不多是空的，只有少數(shù)染色的個(gè)體。分解來(lái)自兩個(gè)系的芽，在4℃，在0.1摩爾/升磷酸緩沖液，pH7.24，3％戊二醛中固定個(gè)別花藥14-16小時(shí)。在三次緩沖液洗滌后，在相同的緩沖液中，在室溫在1％鋨酸中后固定花藥1小時(shí)，利用緩沖液再次洗滌，在分級(jí)的丙酮系列中脫氫，在Spurr樹(shù)脂(硬受體)中包埋，并且在70℃多聚化24小時(shí)。
在Reichert Ultracut S切片機(jī)中切片樣品塊。對(duì)于光學(xué)顯微鏡觀察，利用亞甲天藍(lán)II和堿性品紅染色1微米厚的切片(Humphrey，C.D.，等人，對(duì)于環(huán)氧包埋組織切片的簡(jiǎn)單的亞甲天藍(lán)II堿性品紅染色，染色技術(shù)，499-13，1974)。在Leitz orthoplan顯微鏡上觀察樣品和照片。
對(duì)于熒光顯微鏡，在3∶1的乙醇冰乙酸混合物中固定芽。移取花藥并且在0.15摩爾/升磷酸緩沖液pH8.2中的0.005％苯胺藍(lán)的溶液中壓扁以便檢測(cè)愈創(chuàng)葡聚糖的存在或缺乏(Jensen，W.A.，出處同上)。
來(lái)自本發(fā)明的雄性不育植物的花藥是白色的，而不是可育植物花藥的典型的黃色。同樣，在成熟時(shí)，雄性不育植物的花藥比可育植物的花藥稍微更小。當(dāng)在I2KI溶液中壓扁成熟的花藥時(shí)，雄性不育花藥大多數(shù)含有退化的小孢子，而在可育花藥中觀察到了密度染色花粉粒。苯胺藍(lán)染色表明在雄性不育花藥中退化的小孢子周圍保留了愈創(chuàng)葡聚糖。
在小孢子發(fā)生的最早期的過(guò)程中，在本發(fā)明的雄性不育植物中花藥的發(fā)育似乎是正常的。四個(gè)幼小的子房室都含有表皮，內(nèi)皮和多達(dá)兩個(gè)體壁層圍繞的產(chǎn)孢子大塊細(xì)胞(SMCs)。最內(nèi)層絨氈層將體壁層與SMCs分離開(kāi)。從SMCs分化出小孢子母細(xì)胞(性母細(xì)胞)。
在分裂前期I，小細(xì)胞質(zhì)液泡出現(xiàn)在雄性不育和雄性可育花藥的絨氈層細(xì)胞中。正如進(jìn)行的減數(shù)分裂，在雄性不育和雄性可育花藥中性母細(xì)胞分裂成小孢子的二分體然后四分體。四分體內(nèi)小孢子由愈創(chuàng)葡聚糖分隔開(kāi)。在雄性不育花藥中絨氈層細(xì)胞增大，并且變得染色致密。雄性可育花藥的絨氈層細(xì)胞仍然是細(xì)胞質(zhì)致密。保留了圍繞來(lái)自雄性不育花藥的四分體的愈創(chuàng)葡聚糖的鞘，并且每個(gè)小孢子細(xì)胞質(zhì)變得高度具液泡的。在雄性可育花藥中，愈創(chuàng)葡聚糖降解，釋放了個(gè)別小孢子。在雄性不育花藥中絨氈層的行為是可變化的。在一些子房室中，雄性細(xì)胞退化，而絨氈層保留了它的細(xì)胞質(zhì)，并且似乎是有功能的，或者，絨氈層細(xì)胞變得高度具液泡或擴(kuò)大。在開(kāi)裂以前，在密度染色物質(zhì)中一些絨氈層細(xì)胞積累。在發(fā)育的后期，絨氈層開(kāi)裂成黑色物質(zhì)的團(tuán)塊。
在四分體時(shí)期，本發(fā)明的雄性不育花藥中的小孢子母細(xì)胞的發(fā)生沒(méi)有進(jìn)行。當(dāng)仍然包裹在愈創(chuàng)葡聚糖中時(shí)，許多四分體萎縮和開(kāi)裂。雄性不育和雄性可育花藥的絨氈層壁細(xì)胞仍然完整，但在雄性不育絨氈層細(xì)胞中存在小量的細(xì)胞質(zhì)。當(dāng)花藥成熟時(shí)，在雄性不育花藥的子房室內(nèi)只存在退化的細(xì)胞，而在雄性可育花藥的子房室中吞噬了大量的花粉粒。甚至在或靠近開(kāi)花期，來(lái)自雄性不育植物的小孢子仍然包裹在愈創(chuàng)葡聚糖中。實(shí)施例4 在雄性不育花藥中的愈創(chuàng)葡聚糖酶的活性關(guān)于體外愈創(chuàng)葡聚糖酶活性，選擇了來(lái)自可育和不育植物的已知發(fā)育時(shí)期的花。根據(jù)加以修改的Frankel，R.，等人，出處同上，從四分體時(shí)期的雄性可育和雄性不育花藥提取粗愈創(chuàng)葡聚糖酶。從花芽除去花藥，并且放置于在干冰上冷凍的1.5毫升微管中。研磨花藥，利用含有0.08摩爾/升的乙酸和0.08摩爾/升的NaCl，pH4.8的提取緩沖液處理，然后允許在室溫停留30分鐘，然后在4℃離心15分鐘。上清液含有粗酶提取物。將來(lái)自可育和不育花藥的分離的四分體放置于分開(kāi)的玻璃片上，加上酶提取物，用蓋玻片蓋上制劑。四種組合是(1)可育花藥提取物加可育四分體，(2)可育花藥提取物加不育四分體，(3)不育花藥提取物加可育四分體，和(4)不育花藥提取物加不育四分體。在37℃，在潮濕的室中，溫育獲得的反應(yīng)混合物約18小時(shí)。在溫育后，加入間苯二酚藍(lán)(在純乙醇中的0.1％間苯二酚藍(lán))終止反應(yīng)，并且染色未消化的愈創(chuàng)葡聚糖(Frankel，R.，等人，出處同上)。確定顏色強(qiáng)度和四分體愈創(chuàng)葡聚糖壁的存在，在Leitz orthoplan顯微鏡上照相記錄。
在雄性可育和雄性不育花藥中測(cè)試愈創(chuàng)葡聚糖酶的活性的結(jié)果顯示在利用可育花藥酶提取物處理后，而不是在利用不育花藥酶提取物處理后，消化了圍繞分離的可育和不育四分體的愈創(chuàng)葡聚糖。結(jié)果表明在雄性不育花藥中沒(méi)有愈創(chuàng)葡聚糖酶活性，但在雄性可育花藥中愈創(chuàng)葡聚糖酶是活化的。實(shí)施例5用于鑒定與本發(fā)明的雄性不育基因連鎖的分子標(biāo)記的方法植物材料利用219個(gè)圖譜定位的重組克隆和51個(gè)SSRs篩選四個(gè)栽培品種[Williams82，Harosoy，Noir I(P1290136)和Minsoy(P127890)]和雄性不育突變體(msMOS)用于觀察msMOS和其它栽培品種之間DNA的多形性。這一方法證明了突變體msMOS和Minsoy具有相當(dāng)高水平的多形性(46％)。隨后在1995年夏天進(jìn)行msMOS和Minsoy之間的雜交。在Puerto Rico，Isabela，Isabela Substation，Pureto Rico大學(xué)大豆育種繁殖場(chǎng)種植F1種子。在生長(zhǎng)室中生長(zhǎng)F2植物，在開(kāi)始4星期光期為16小時(shí)，2星期光期為14小時(shí)，13小時(shí)光期直到成熟，白天30℃，夜晚24℃。單一植物脫粒可育的F2植物，在Puerto Rico種植F3種子用于在成熟時(shí)在成功的結(jié)種數(shù)基礎(chǔ)上區(qū)分雄性不育/可育性。
在開(kāi)花時(shí)，在I2KI的水溶液中壓扁后期花藥鑒定雄性可育和雄性不育植物(Jensen，1962)。來(lái)自雄性不育植物的花藥展示了圍繞花粉粒的密度染色，而來(lái)自雄性不育植物的花藥沒(méi)有圍繞花粉粒的密度染色(Jin，等人，1997)。在不同的日子評(píng)估每個(gè)植物2到3個(gè)花。進(jìn)行Chi平方測(cè)試以便確定F2子代的表型符合3∶1的比例和F3子代符合1∶2∶1的比例以便鑒定F2的基因型。RFLP和SSR分析根據(jù)Keim等人(1988)從親本F1和F2植物冷凍干燥的葉組織分離大豆DNA，并且利用5個(gè)限制性內(nèi)切酶(HindIII，EcoRI，EcoRV，Dral和TaqI)消化。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳(10微克/泳道，0.8％瓊脂糖)分離消化的DNA，根據(jù)Sambrook等人(1989)轉(zhuǎn)移到Zeta Probe尼龍膜(BioRad)。利用任意引導(dǎo)的32P-dCTP-標(biāo)記的探針雜交印跡。根據(jù)ZetaProbe建議(Bio Rad)分別在65℃和60℃進(jìn)行雜交和洗滌。親本DNA的初級(jí)篩選鑒定了用于收集來(lái)自F2子代的RFLP數(shù)據(jù)的多形性克隆。利用Chi-平方分析測(cè)試每個(gè)基因座的等位基因的分離以便確定對(duì)預(yù)期比例的符合性。收集了102個(gè)克隆的分離數(shù)據(jù)，包括來(lái)自大豆的90個(gè)(Shoemaker和Olson，1993，Shoemaker，等人，1997)和來(lái)自一般的豆(Vallejoes，等人，1992)或綠豆(Menancio-Hautea，等人，1993)的12個(gè)。
同時(shí)評(píng)估了簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)標(biāo)記(Akkaya，等人，1995)，因此標(biāo)記的數(shù)目達(dá)到133。對(duì)于SSR分析，PCR反應(yīng)混合物含有60納克大豆基因組DNA，1.5毫摩爾/升Mg2+，0.3微摩爾/升有義和反義引物，200微摩爾/升每種核苷酸，和1×PCR緩沖液，總體積為20微升。循環(huán)包括94℃30秒，47℃30秒，68℃30秒，在Perkin-Elmer960熱循環(huán)器上進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。在TBE(0.089摩爾/升Tris-硼酸，0.089摩爾/升硼酸，0.002摩爾/升EDTA)緩沖液中在2.5％-3.5％(根據(jù)兩個(gè)帶的多形性片斷的大小)Metaphor(FMC)瓊脂糖凝膠上電泳PCR產(chǎn)物，凝膠中摻入了溴化乙錠。實(shí)施例6 連鎖分析利用Mapmaker程序(Lander，等人，1987)構(gòu)建連鎖圖譜。將LOD得分3用作接受兩個(gè)標(biāo)記之間的連鎖的低限。利用Kosambi(Kosambi，1944)功能以centiMorgans(cM)將重組頻率轉(zhuǎn)換成圖譜距離。根據(jù)兩點(diǎn)分析，對(duì)于大多數(shù)可能的順序，Mapmaker產(chǎn)生了對(duì)數(shù)狀值。
利用219個(gè)圖譜RFLP探針篩選四個(gè)栽培品種(Williams82，Harosoy，Noir I和Minsoy)。將限制圖譜與利用5個(gè)限制性內(nèi)切酶(HindIII，EcoRI，EcoRV，Dral和TaqI)同樣消化msMOS獲得的比較。msMOS和Minsoy結(jié)合證明了最高水平的多形性(46％，數(shù)據(jù)未顯示)。所以，選擇Minsoy作為雄性親本與msMOS雜交用于構(gòu)建F2群體。在F2子代中ms的分離F1植物是可育的。在F2中可育與不育植物的分離的比例是3∶1。這證明了Jin等人(1997)的觀察，即ms是隱性基因。在子代測(cè)試后，數(shù)據(jù)證明111個(gè)F2個(gè)體的群體顯示了1∶2∶1基因型分離(X2＝0.16)。實(shí)施例7 與ms連鎖的RFLP和SSR標(biāo)記的鑒定通過(guò)從每個(gè)連鎖組選擇幾個(gè)RFLP標(biāo)記進(jìn)行F2群體的最初篩選(Shoemaker，等人，1997)。選擇標(biāo)記以便將每個(gè)連鎖組分成小于20cM的區(qū)段。兩點(diǎn)分析表明在連鎖組D1b上ms基因與SSR標(biāo)記Satt005(LOD4.7)連鎖。對(duì)F2群體篩選來(lái)自連鎖組的其它標(biāo)記(Satt157，Satt296，Satt266，A605，A747，Bng47，Mng137，Satt141，Satt189，Satt290，B194，L161和K411)。根據(jù)從Mapmaker程序產(chǎn)生的LOD得分，我們發(fā)現(xiàn)ms基因座分別與RFLP標(biāo)記B122，Bng047，和SSR標(biāo)記Satt5和Satt157連鎖，LOD得分分別為4.7，5，5和26。利用限制酶內(nèi)切酶HindIII，EcoRI，EcoRV，Dral，TaqI，AccI，AluI，HhaI，HaeIII，SspI和BamHI在基因座A605，A747，Mng137和B194沒(méi)有檢測(cè)到多形性，而利用SSR標(biāo)記Satt296，Satt266，Satt141，Satt189和Satt290也沒(méi)有觀察到多形性。雖然在這一雜交中標(biāo)記K411和L161是多形性的，它們獨(dú)立于ms分離。RFLP和SSR標(biāo)記的分離比例很好地符合了1∶2∶1比例或3∶1的比例。
雖然通過(guò)說(shuō)明和為了澄清和理解的目的的實(shí)施例在一些細(xì)節(jié)上已經(jīng)說(shuō)明了前面的發(fā)明，正如只由附加的權(quán)利要求的范圍限制的，在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以進(jìn)行一些變化和修改。保藏資料在1997年10月8日，以保藏登記號(hào)＿＿，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Rockwille，Md.20852保藏了本發(fā)明的大豆種子。
雖然通過(guò)說(shuō)明和用于澄清和理解的實(shí)施例，在一些細(xì)節(jié)上已經(jīng)說(shuō)明了前面的發(fā)明，顯然正如只由附加的權(quán)利要求的范圍限制的，在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以進(jìn)行一些變化和修改。
權(quán)利要求
1.含有命名為msMOS的雄性不育等位基因的DNA遺傳因子的大豆種子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆種子，其中所述的種子含有雄性不育的隱性等位基因。
3.培養(yǎng)權(quán)利要求1的種子產(chǎn)生的大豆植物。
4.權(quán)利要求3所述的植物的花粉。
5.權(quán)利要求3所述的植物的胚珠。
6.含有權(quán)利要求3所述的植物的可再生細(xì)胞的組織培養(yǎng)物。
7.從權(quán)利要求3所述的植物的組織培養(yǎng)物再生的大豆植物。
8.生產(chǎn)F1雜種大豆種子的方法，包括將第一個(gè)親本大豆植物與第二個(gè)親本大豆植物雜交，并且收獲得到的F1雜種大豆種子，其中所述的第一個(gè)或第二個(gè)親本大豆植物是權(quán)利要求3所述的大豆植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中權(quán)利要求3所述的大豆植物是雌性植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中權(quán)利要求3所述的大豆植物是雄性植物。
11.培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的雜種大豆種子產(chǎn)生的第一代(F1)雜種大豆植物。
12.于1997年10月8日以ATCC保藏號(hào)＿＿保藏的種子長(zhǎng)出的活大豆種子和植物以及連續(xù)的子代，以及在連續(xù)的子代中雄性不育等位基因從所述的保藏種子轉(zhuǎn)移到其中的大豆種子和植物。
13.將來(lái)自大豆的遺傳雄性不育基因轉(zhuǎn)移到另一個(gè)物種的方法，包括步驟a)分離所述的遺傳雄性不育基因；b)將所述的遺傳雄性不育基因與啟動(dòng)子結(jié)合；c)利用轉(zhuǎn)化技術(shù)將遺傳雄性不育基因插入另一個(gè)物種。
14.將大豆的遺傳雄性不育基因轉(zhuǎn)移到另一個(gè)屬的方法，包括步驟a)分離所述的遺傳雄性不育基因；b)將所述的遺傳雄性不育基因與啟動(dòng)子結(jié)合；和c)利用轉(zhuǎn)化技術(shù)將遺傳雄性不育基因插入另一個(gè)屬。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了命名為msMOS的突變的雄性不育大豆系,其顯示出在命名為“msMOS”的新基因座上的基因性雄性不育。雄性不育似乎是由于缺乏功能性愈創(chuàng)葡聚糖酶(callase)而導(dǎo)致的削弱的四分體退化所致。
文檔編號(hào)A01H5/10GK1275048SQ98810003
公開(kāi)日2000年11月29日 申請(qǐng)日期1998年9月10日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月9日
發(fā)明者威廉·H·戴維斯 申請(qǐng)人:中西油料種子公司