用于治療雄性不育癥的抗體、化合物及其衍生物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及選擇性地與RANKL/OPGbp結(jié)合并且調(diào)節(jié)RANKL/OPGbp與RANK/0PG之間 的相互作用的拮抗劑或抑制劑。特別地，本發(fā)明涉及用于治療、預(yù)防或減輕雄性不育癥或雄 性生育力降低(例如，少精子癥或無(wú)精子癥)的、與RANKL/OPGbp肽具有免疫反應(yīng)性的抗體或 抗原結(jié)合域、其片段或衍生物。
【背景技術(shù)】
[0002] NF-κΒ受體活化因子配體（receptor activator of NF-κΒ IigancURANKL)系統(tǒng)被 認(rèn)為對(duì)骨的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)很重要并且包括三個(gè)重要因子。RANKL是與鄰近細(xì)胞上的特異性受體 (NF-κΒ的受體活化因子(RANK))結(jié)合的跨膜配體，該特異性受體隨后活化NFKB并且通過調(diào) 節(jié)細(xì)胞周期（即，增殖、分化和細(xì)胞凋亡)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞活化。OPG是結(jié)合RANKL并且抑制其信號(hào) 傳導(dǎo)的內(nèi)源性分泌蛋白。
[0003] RANK/RANKL觸發(fā)促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的TRAF介導(dǎo)的激酶級(jí)聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)。RANKL在成骨 細(xì)胞上表達(dá)并且其受體，Rank，在前破骨細(xì)胞上表達(dá)。RANKL表達(dá)受到許多因子的刺激，例 如，IL-l、IL-6、IL-ll、IL-17、TNF-α、維生素 D、Ca2+、甲狀旁腺、糖皮質(zhì)激素、前列腺素 E2和免 疫抑制藥物，并且TGF-α下調(diào)RANKL表達(dá)。RANK/RANKL的相互作用誘導(dǎo)多核的成熟破骨細(xì)胞 的分化和形成，從而導(dǎo)致骨重吸收。第三蛋白激動(dòng)劑，骨保護(hù)素(OPG)，也由成骨細(xì)胞產(chǎn)生， 并且已知對(duì)前破骨細(xì)胞的分化過程發(fā)揮抑制作用。OPG通過結(jié)合到RANKL，也稱為骨保護(hù)素 結(jié)合蛋白（OPGbp)，抑制RANK/RANKL相互作用和后續(xù)的破骨細(xì)胞生成。OPG因此是非常有效 的抗吸收劑。它也用作腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)的誘餌受體并且通過阻礙 這種配體的細(xì)胞凋亡作用來(lái)增加細(xì)胞存活率。小鼠中OPG的過表達(dá)導(dǎo)致重度骨硬化病并且 OPG缺失的小鼠患有骨質(zhì)疏松癥的事實(shí)證明了OPG的生理學(xué)重要性。缺失RANK或RANKL誘導(dǎo) 小鼠的骨硬化病。
[0004] 因此，RANK/RANKL系統(tǒng)對(duì)骨再吸收細(xì)胞(破骨細(xì)胞)的活化至關(guān)重要。在骨中，骨合 成細(xì)胞(成骨細(xì)胞)表達(dá)向未成熟的破骨細(xì)胞上的RANK傳導(dǎo)信號(hào)的RANKL。這誘導(dǎo)細(xì)胞的增 殖和活化，并且它們開始增殖并再吸收骨。OPG由骨中的體細(xì)胞產(chǎn)生并且這種產(chǎn)生受到性激 素、TGF-B和各種其他物質(zhì)的調(diào)節(jié)。現(xiàn)在，人們制備了抗RANKL的重組抗體，狄諾塞麥 (denosumab)用于治療骨質(zhì)疏松癥，因?yàn)樗种芌ANKL的信號(hào)傳導(dǎo)并且因此引起人體中的更 少的骨再吸收。RANKL信號(hào)傳導(dǎo)在健康人體中僅具有兩種另外的已知的額外功能，因?yàn)樗?及哺乳細(xì)胞和免疫細(xì)胞。
[0005] 最近，已經(jīng)公開了使用RANK/RANKL拮抗劑治療神經(jīng)肌肉疾病、遺傳性肌病和/或非 遺傳性肌病，和/或用于調(diào)節(jié)骨骼肌和心肌廢用、疾病和老化(W0 2013/067639 Al)。
[0006] 降低的精液質(zhì)量是雄性不育癥的主要因素。精液質(zhì)量是精液完成受精的能力的度 量標(biāo)準(zhǔn)。如今雄性生育潛力的評(píng)價(jià)基本上通過精液分析進(jìn)行。精液分析評(píng)價(jià)雄性精液的某 些特性以及精液中包含的精子。評(píng)價(jià)精子質(zhì)量所測(cè)量的最常見的變量是:精子計(jì)數(shù)、運(yùn)動(dòng)性 和形態(tài)。
[0007] 然而，當(dāng)今無(wú)法治療射精沒有精子的男性或者沒有能夠增加精子數(shù)量的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 在患有生精障礙或具有原位瘤的重度睪丸發(fā)育不全的活組織檢查中，似乎看來(lái)在 管周細(xì)胞中不產(chǎn)生OPG。這表明有可能用RANKL的拮抗劑或抑制劑(例如，拮抗性的抗RANKL 抗體)治療人，這些拮抗劑或抑制劑可以影響生殖細(xì)胞的增殖和細(xì)胞凋亡。因此，拮抗性的 抗RANKL抗體，例如，狄諾塞麥，可以具有新適應(yīng)癥作為沒有精子但是睪丸中存在生殖細(xì)胞 的男性的治療?？商娲兀鄬?duì)物(RANKL)可以用于獲得相反效果的男性生育控制。
[0009] 本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)解釋了 RANKL、RANK和OPG在人和小鼠的睪丸中在RNA和蛋白水 平均表達(dá)。塞爾托利氏細(xì)胞表達(dá)RANKL，而生殖細(xì)胞表達(dá)RANK并且管周細(xì)胞表達(dá)OPG。正常 地，RANKL活化NFKB，并且在雄性性腺中此途徑的活化決定了睪丸細(xì)胞在睪丸中是增殖還是 經(jīng)歷細(xì)胞凋亡。因此，此途徑似乎是生殖細(xì)胞增殖的新的調(diào)節(jié)子。這在實(shí)施例3-5中有進(jìn)一 步記載，實(shí)施例3-5顯示了特異性化合物（以O(shè)PG說(shuō)明）和特異性抗體（以狄諾塞麥說(shuō)明）能夠 正面影響精液質(zhì)量。
[0010] 本發(fā)明的目的是提供詰抗劑或抑制劑，例如，調(diào)節(jié)RANKL和RANK之間的相互作用的 抗體或抗原結(jié)合域，特別是阻礙RANKL和RANK之間的相互作用和/或抑制RANKL的至少一種 活性(其導(dǎo)致雄性不育癥或雄生育力降低)的抗體或抗原結(jié)合域。本發(fā)明的另外的目的是提 供可用于治療、預(yù)防或減輕雄性不育或雄性生育力降低的抗體或抗原結(jié)合域、其片段或衍 生物。本發(fā)明的另外的目的是提供調(diào)節(jié)睪丸中RANKL和RANK的相互作用并且中和RANKL的至 少一種活性的抗體、抗原結(jié)合域或其片段或變體。所述抗體或抗原結(jié)合域、其片段或衍生物 可用于治療、預(yù)防或減輕男性不育或男性生育力降低，例如精子減少癥或無(wú)精子癥。
【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1示出了來(lái)自標(biāo)記為1-23的人樣本的選擇的轉(zhuǎn)錄物的RT-PCR。兩個(gè)不同的引物 集(primerset)檢測(cè)正常的和病態(tài)的睪丸組織中的RANKL的兩種不同的同種型。RANK和OPG 也在正常的和病態(tài)的睪丸樣本中表達(dá)，并且與正常睪丸相比OPG表達(dá)在CIS和精原細(xì)胞瘤中 消失。有趣的是，僅一種RANKL同種型僅在塞爾托利氏細(xì)胞中表達(dá)，并且這種同種型在表示 性別特異性的RANKL同種型的卵巢中不表達(dá)。這種同種型在NTera2細(xì)胞中不表達(dá)，而在 TCAM2細(xì)胞中表達(dá)。RANK在非精原細(xì)胞瘤中不存在或者弱表達(dá)，而NFKB和RELa+b在所有樣本 中均表達(dá)。
[0012]圖2A示出了來(lái)自具有正常維生素 D受體(Vdr wt)或具有突變的和無(wú)活性維生素 D 受體(Vdr K0)的瑞士小鼠的選擇的轉(zhuǎn)錄物的RT-PCR。引物集檢測(cè)正常小鼠中的RANKL，而表 達(dá)在Vdr KO小鼠中很低或不存在。RANK、OPG、RELa在所有動(dòng)物中均表達(dá)，而NFKB看起來(lái)在 Vdr KO小鼠中表達(dá)較低。
[0013]圖2B示出了來(lái)自具有正常Vdr(wt)、一個(gè)無(wú)活性等位基因（+/-)或兩個(gè)失活的等位 基因（-/_)的小鼠的RANKL的定量PCR。雜合和純合突變小鼠中的RANKL的顯著下調(diào)表明主同 種型為RANKLl，因?yàn)樗删S生素 D調(diào)節(jié)，而同種型3并非如此。
[0014]圖3示出了 RANKL和RANK除在正常小鼠的睪丸中表達(dá)之外在從人獲得的正常睪丸 和原位癌小管中的免疫組織化學(xué)表達(dá)。RANK在生殖細(xì)胞中表達(dá)，而RANKL在塞爾托利氏細(xì)胞 和生殖細(xì)胞的后期階段中表達(dá)。
[0015]圖4:在正常培養(yǎng)基中生長(zhǎng)14小時(shí)+4小時(shí)的NT2細(xì)胞在用刃天青染料處理20小時(shí)之 后的存活率/增殖。所有處理的濃度為l〇〇ng/ml。值為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差(η = 8)，其中*表示在 t檢驗(yàn)之后的顯著性差異ρ〈0.05。
[0016] 圖5:在正常培養(yǎng)基中生長(zhǎng)10小時(shí)+6.5小時(shí)的TCam-2細(xì)胞在用刃天青染料處理4小 時(shí)和20小時(shí)之后的存活率/增殖。所有處理的濃度為100ng/ml。值為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差(η = 8)，其中*表不在t檢驗(yàn)之后的顯著性差異ρ〈0.05。
[0017] 圖6示出了在人的離體模型中的生殖細(xì)胞增殖。生殖細(xì)胞增殖在用媒介物(DMSO)、 100ng/ml RANKL或100ng/ml狄諾塞麥對(duì)人的睪丸樣本(Ν=3)進(jìn)行48小時(shí)處理之后通過 BrdU合并進(jìn)行評(píng)估，還與用50ng/ml 0PG、100ng/ml CSF-1和100ng/ml PTHrP處理的一個(gè)睪 丸進(jìn)行比較。數(shù)據(jù)表示為增殖+標(biāo)準(zhǔn)誤差的平均變化，并且數(shù)據(jù)歸一化為載體處理的樣本。
[0018] 圖7示出了在包含管內(nèi)原位癌細(xì)胞的離體人睪丸模型中用RANKL、CSF-1、狄諾塞麥 和對(duì)照處理的增殖(上）和細(xì)胞凋亡（下）的影響。已經(jīng)統(tǒng)計(jì)了表達(dá)BrdU或半胱天冬酶3的生 殖細(xì)胞的平均數(shù)以比較處理之間的效果。
[0019 ]圖8示出了用媒介物、OPG或RANKL處理的小鼠的總睪丸重量。在15只小鼠經(jīng)過14天 處理(5只小鼠隨機(jī)進(jìn)行每項(xiàng)處理:媒介物、RANKL或0PG)之后評(píng)估睪丸重量。數(shù)據(jù)表示為平 均值+標(biāo)準(zhǔn)誤差，并且數(shù)據(jù)歸一化為媒介物處理的樣本。*表示P〈〇. 05并且***表示p〈0.001。
[0020] 圖9示出了用媒介物、OPG或RANKL處理的小鼠的總附睪重量。在15只小鼠經(jīng)過14天 處理(5只小鼠隨機(jī)進(jìn)行每項(xiàng)處理:媒介物、RANKL或0PG)之后評(píng)估睪丸重量。數(shù)據(jù)表示為平 均值+標(biāo)準(zhǔn)誤差，并且數(shù)據(jù)歸一化為媒介物處理的樣本。NS表示p>0.05并且*表示p〈0.05。
[0021] 圖10示出了 10周齡小鼠的睪丸形態(tài)測(cè)量數(shù)據(jù)。來(lái)自10周齡小鼠的睪丸固定在波恩 氏溶液中并且評(píng)估具有生殖細(xì)胞上皮(6-12階段)的生精小管(每個(gè)處理組N=3)。用媒介物 或OPG處理14天的小鼠的小管直徑(上）和生殖細(xì)胞上皮寬度（下）的比較。豎條表示平均值 土標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0022]圖11示出了用媒介物或OPG處理的小鼠的精子計(jì)數(shù)。將附睪尾部剁碎置于Iml的 PBS中，隨后評(píng)估精子計(jì)數(shù)(5只小鼠隨機(jī)用媒介物或OPG處理）。數(shù)據(jù)表示為平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤 差，并且*表示P〈〇. 05。
[0023]現(xiàn)在將在下文中更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 定義
[0025] 在更詳細(xì)地討論本發(fā)明之前，將首先定義以下術(shù)語(yǔ)和約定：
[0026]本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合域選擇性地結(jié)合到RANKL/OPGbp，其以比其他抗原更大 的結(jié)合親和力優(yōu)先結(jié)合到RANKL/OPGbp。該抗體可以選擇性地結(jié)合到人的RANKL/OPGbp，而 且還可檢測(cè)地結(jié)合到非人RANKL，例如，鼠 RANKL?？商娲兀摽贵w可以排他地結(jié)合到人的 RANKL或RANK，而不分別可檢測(cè)地結(jié)合到非人RANKL或RANK。
[0027]術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"指的是從基本上同質(zhì)的抗體群體獲得的抗體，其中每個(gè)單克隆 抗體通常將識(shí)別抗原上的單個(gè)表位。術(shù)語(yǔ)"單克隆"不限于用于制備抗體的任何特定方法。 例如，本發(fā)明的單克隆抗體可以通過如Kohler等人(Nature256,495 (1975))描述的雜交瘤 方法制備，或者可以例如使用如本文所述的技術(shù)從噬菌體文庫(kù)中分離。
[0028] 術(shù)語(yǔ)"抗原結(jié)合域"或"抗原結(jié)合區(qū)"或"其片段或衍生物"指的是包含與抗原相互 作用并且在結(jié)合劑上賦予其針對(duì)抗原的特異性和親和力的氨基酸殘基的選擇結(jié)合劑的部 分(例如抗體分子）。優(yōu)選地，抗原結(jié)合區(qū)將具有人類起源。在其他實(shí)施方式中，抗原結(jié)合區(qū) 可以源自于其他動(dòng)物物種，特別是家畜和嚙齒動(dòng)物，例如，兔子、大鼠或倉(cāng)鼠。
[0029] 術(shù)語(yǔ)"有效量"和"治療有效量"在關(guān)于抗體或抗原結(jié)合區(qū)、其片段或衍生物、與 RANKL肽具有免疫反應(yīng)性使用時(shí)指的是支持在RANKL的一個(gè)或多個(gè)生物活性水平的可觀察 的變化有用或必要的選擇結(jié)合劑的量，其中所述變化可以是RANKL活性水平的增大或減小。
[0030] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"序列同一性"表示兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核酸序 列之間的同源性程度的定量測(cè)量。如果將要比較的兩個(gè)序列不具有相同的長(zhǎng)度，那么它們 必須比對(duì)以得到最佳的可能匹配，從而允許在多肽序列或核苷酸序列的端部插入空位或可 替代地截尾。序列同一性可以計(jì)算為^^其中Ndif是兩個(gè)序列在比對(duì)時(shí)的不同殘基 的總數(shù)，并且其中Nref是一個(gè)序列中的殘基數(shù)量。因此，DNA序列AGTCAGTC與序列AATCAATC 具有75%的序列同一"性(Ndif = 2并且Nref = 8)?？瘴挥?jì)算為具體殘基的不同一"性，即，DNA 序列AGTGTC與DNA序列AGTCAGTC具有75%的序列同一性(Ndif = 2并且Nref = 8)。
[0031] 相對(duì)于涉及氨基酸序列或核苷酸序列的本發(fā)明的所有實(shí)施方式，一個(gè)或多個(gè)序列 之間的序列同一性的百分比也可以基于使用〇1118七311軟件（111^口：/'\^￥.613；[.3(3.111^/ clustalW/index.html)(默認(rèn)設(shè)置）的比對(duì)。對(duì)于核苷酸序列比對(duì)，這些設(shè)置是：比對(duì) (Alignment) = 3Dful 1，空位開放(Gap Open) 10 · 00，空位延伸（Gap Ext · )0 · 20，空位分隔距 離(Gap separation Dist. )4，DNA權(quán)矩陣（DNA weight matrix):同一性（IUB)。對(duì)于氨基酸 序列比對(duì)，這些設(shè)置如下：比對(duì)(Alignment) = 3Dful 1，空位開放(Gap Open) 10.00,空位延 伸（Gap Ext. )0.20,空位分隔距離（Gap separation Dist. )4,蛋白質(zhì)權(quán)矩陣（Protein weight matrix):Gonnet0
[0032] 可替代地，核苷酸序列可以通過使用程序DNASIS Max進(jìn)行分析，并且可以在 http :// www.paralign.org/完成序列比較。這種服務(wù)基于兩種比較算法dlSSmith-Waterman(SW)和ParAlign。第一種算法由Smith和Waterman出版（1981)，并且是尋找兩個(gè)序 列的最佳局部比對(duì)的成熟方法。另一種算法，Par AI i gn，是用于序列比對(duì)的探索法，Ro gn e s (2001)出版了這些方法的細(xì)節(jié)。使用得分矩陣和空位罰分以及E值(E-value)的默認(rèn)設(shè)置。
[0033] 用于醫(yī)療用途的化合物
[0034]在第一方面，本發(fā)明提供了一種化合物，該化合物是與NF-KB(RANK)的受體活化劑 結(jié)合的NF-kB配體(RANKL)的骨保護(hù)素結(jié)合蛋白（OPGbp)/受體活化劑的拮抗劑或抑制劑，用 于刺激睪丸中的（生殖)細(xì)胞增殖，和/或用于治療和/或預(yù)防哺乳動(dòng)物的雄性不育癥，和/或 用于誘導(dǎo)或提高哺乳動(dòng)物的雄性生育力。
[0035] 該化合物特別地可以是能夠與RANKL結(jié)合的試劑。
[0036] 另外，該化合物可以是選擇性結(jié)合到RANKL的蛋白質(zhì)結(jié)合劑。
[0037]因此，根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施方式，如上所述供使用的化合物選自由0PG、包括OPG 的融合蛋白（例如，F(xiàn)c-OPG)和人免疫球蛋白Gl組成的組。在實(shí)施例4和圖6中，提供了表示 OPG對(duì)生殖細(xì)胞增殖的影響的數(shù)據(jù)。在實(shí)施例5和圖8至圖11中，提供了示出在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中 OPG對(duì)小鼠的睪丸參數(shù)的影響的數(shù)據(jù)。
[0038]在本發(fā)明的具體方面，本發(fā)明涉及用于刺激睪丸中的（生殖)細(xì)胞增殖和/或用于 治療和/或預(yù)防哺乳動(dòng)物的雄性不育癥和/或用于誘導(dǎo)或提高哺乳動(dòng)物(例如少精子癥或無(wú) 精子癥）的雄性生育力的OPG、包括OPG的融合蛋白（例如，F(xiàn)c-OPG)和人免疫球蛋白Gl。
[0039] 在SEQ ID NO: 1和3中分別示出了鼠和人RANKL的核苷酸序列和預(yù)測(cè)的氨基酸序 列。此外，在SEQ ID NO 2和4中分別示出了鼠和人RANKL氨基酸序列。
[0040] RANKL序列的計(jì)算機(jī)分析表明RANKL是2型跨膜蛋白。因此，根據(jù)預(yù)測(cè)，鼠 RANKL蛋白 包括47個(gè)氨基酸的胞內(nèi)域、21個(gè)氨基酸的跨膜域以及247個(gè)氨基酸的胞外域。根據(jù)預(yù)測(cè)