本發(fā)明涉及蔬菜育種方法，尤其涉及一種大蔥雙單倍體育種方法，它屬于生物技術(shù)與雙單倍體育種。

背景技術(shù)：

1、大蔥屬于石蒜科（amaryllidaceae）蔥屬（allium）蔥種（fistulosum）的一個(gè)變種，是以葉鞘組成的肥大假莖和嫩葉為產(chǎn)品的二、三年生草本植物，它原產(chǎn)于我國(guó)，栽培歷史悠久，品種豐富，是最早栽培利用的重要蔬菜作物之一，也是非常重要的調(diào)味蔬菜。大蔥是典型的異花授粉作物，雜種優(yōu)勢(shì)十分明顯。作為異花授粉植物，用于配制雜交種的親本需經(jīng)多代自交純化選育自交系，育成一個(gè)穩(wěn)定遺傳的優(yōu)良自交系一般需4-5代自交和選擇，不僅選育周期長(zhǎng)，而且連續(xù)自交會(huì)導(dǎo)致生活力衰退。因此，快速培育優(yōu)良純合自交系，是大蔥雜種優(yōu)勢(shì)利用的技術(shù)關(guān)鍵。

2、單倍體植株必須經(jīng)染色體加倍成雙單倍體才能應(yīng)用于遺傳學(xué)和育種研究。已知在某些植物的未受精子房或胚珠培養(yǎng)中，除了產(chǎn)生單倍體外，還會(huì)獲得一定比例的自發(fā)加倍的雙單倍體，如甜菜、甜瓜、非洲菊。在育種技術(shù)中，雙單倍體指的是純系，簡(jiǎn)稱(chēng)dh系。雙單倍體育種得到的純系后代純合率為100%，自交得到的純系純合率無(wú)論多少代，都達(dá)不到100%。因此，雜交育種要求親本純系越純?cè)胶?。?duì)大蔥來(lái)說(shuō)，尚未見(jiàn)應(yīng)用于雙單倍體育種的報(bào)道。因此研發(fā)一種大蔥雙單倍體育種方法，以提高純合率及育種速度成為本領(lǐng)域技術(shù)人員急需解決的技術(shù)問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的就是為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，而提供了一種大蔥雙單倍體育種方法，它可以縮短育種年限，提高育種效率。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

3、一種大蔥雙單倍體育種方法，其步驟如下：

4、（1）田間種植和取樣：取大蔥種子，在溫室內(nèi)播種育苗，大蔥花苞開(kāi)放，將有四分之一開(kāi)放的大蔥花球取下，放入3-5℃冰箱內(nèi)保存15-24小時(shí)，選取第二天開(kāi)放的花蕾清洗、消毒、滅菌備用；

5、（2）離體雌核培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體：以ms+1.0mg·l-12,4-d+0.04?mg·l-1naa+2.5mg·l-16-ba+10%蔗糖+7g·l-1瓊脂為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基調(diào)節(jié)ph值，然后將誘導(dǎo)培養(yǎng)基放入培養(yǎng)器皿中，滅菌后用滅過(guò)菌的鑷子將步驟（1）消毒處理過(guò)的花蕾接種在分裝有誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿中，每1.3-1.7m?l培養(yǎng)基培育一個(gè)花蕾，接種后置于光照強(qiáng)度2000lux、光照時(shí)長(zhǎng)12?h·d-1、溫度22-25℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)30-35天誘導(dǎo)出胚狀體；

6、（3）胚培養(yǎng)和再生植株的獲得：將誘導(dǎo)出的胚狀體轉(zhuǎn)至ms+3%蔗糖+7%瓊脂的成苗培養(yǎng)基上，置于溫度23-27℃、12?h·d-1光照的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)30-50d胚狀體培養(yǎng)長(zhǎng)成幼苗，幼苗轉(zhuǎn)到?ms+2%蔗糖+7%瓊脂生根培養(yǎng)基上，15-20d后，長(zhǎng)出多條根系，得生根苗，將生根苗煉苗、移栽，用鑷子將蔥苗取出，并清洗蔥根部的培養(yǎng)基，移入基質(zhì)中，放入相對(duì)濕度80~90%、溫度15~24℃的培養(yǎng)環(huán)境營(yíng)養(yǎng)土中進(jìn)行生長(zhǎng)25-30天，最終獲得大蔥再生植株；

7、（4）大蔥種子的培育：取大蔥再生植株，進(jìn)行溫室地栽，常規(guī)大蔥田間栽培管理，下一年開(kāi)花時(shí)，單株隔離套袋，單株授粉，按種子成熟的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行采收，得到雙單倍體大蔥種子。

8、優(yōu)選的，上述步驟（1）所述溫室內(nèi)播種育苗具體為，4月中旬在溫室內(nèi)播種育苗，6月中旬定植，常規(guī)栽培條件管理，10月中下旬收獲大蔥植株，在通風(fēng)良好的條件下貯存，下一年1月中旬將大蔥植株定植于溫室中。

9、優(yōu)選的，上述步驟（1）所述花蕾清洗、消毒具體為用流水沖洗25-35min，在超凈工作臺(tái)上用75%乙醇溶液表面消毒處理?30s。

10、優(yōu)選的，上述步驟（1）所述的滅菌是采用0.1%的升汞滅菌5min，無(wú)菌水沖洗3～5次。

11、優(yōu)選的，上述步驟（2）所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基分裝前用?1%naoh?溶液將ph調(diào)至5.8。

12、優(yōu)選的，上述步驟（2）所述的滅菌是培養(yǎng)器皿及誘導(dǎo)培養(yǎng)基于高壓自動(dòng)滅菌鍋121℃滅菌?20?min。

13、優(yōu)選的，上述步驟（3）所述的生根苗煉苗、移栽具體是先打開(kāi)封口膜，往培養(yǎng)瓶中注入蒸餾水，以不淹沒(méi)小苗為標(biāo)準(zhǔn)，煉苗3~5d，期間缺水時(shí)及時(shí)補(bǔ)水。

14、優(yōu)選的，上述步驟（3）所述的基質(zhì)為草炭與珍珠巖的質(zhì)量比為1:1的基質(zhì)。

15、由于采用上述技術(shù)方案，使得本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果：

16、本發(fā)明育種方法加速了育種進(jìn)程，快速獲得純系，只需1代即可獲得高度純合的dh系，改變了傳統(tǒng)育種方法進(jìn)行純系的選育一般需要連續(xù)自交4-5代，顯著縮短育種年限，提高育種效率。本發(fā)明大蔥雙單倍體育種方法能在選擇的早期階段簡(jiǎn)化育種程序，即與常規(guī)育種相比減少了育種的工作量；dh系可以用于長(zhǎng)期保存異質(zhì)的種質(zhì)資源，而沒(méi)有遺傳漂變和基因頻率的其他變化的風(fēng)險(xiǎn)，也可以用于對(duì)每個(gè)收集的異質(zhì)種質(zhì)育種潛力深度挖掘，在不同環(huán)境重復(fù)試驗(yàn)中對(duì)每個(gè)dh系進(jìn)行評(píng)價(jià)，有助于在育種中對(duì)數(shù)量性狀進(jìn)行有效的選擇；dh品系固定了稀有等位基因，淘汰不利的隱性基因。

技術(shù)特征：

1.一種大蔥雙單倍體育種方法，其特征在于步驟如下：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大蔥雙單倍體育種方法，其特征在于步驟（1）所述溫室內(nèi)播種育苗具體為：4月中旬在溫室內(nèi)播種育苗，6月中旬定植，常規(guī)栽培條件管理，10月中下旬收獲大蔥植株，在通風(fēng)良好的條件下貯存，下一年1月中旬將大蔥植株定植于溫室中。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大蔥雙單倍體育種方法，其特征在于步驟（1）所述花蕾清洗、消毒具體為用流水沖洗25-35min，在超凈工作臺(tái)上用75%乙醇溶液表面消毒處理?30s。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大蔥雙單倍體育種方法，其特征在于步驟（1）所述的滅菌是采用0.1%的升汞滅菌5min，無(wú)菌水沖洗3～5次。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大蔥雙單倍體育種方法，其特征在于步驟（2）所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基分裝前用?1%naoh?溶液將ph調(diào)至5.8。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大蔥雙單倍體育種方法，其特征在于步驟（2）所述的滅菌是培養(yǎng)器皿及誘導(dǎo)培養(yǎng)基于高壓自動(dòng)滅菌鍋121℃滅菌?20?min。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大蔥雙單倍體育種方法，其特征在于步驟（3）所述的生根苗煉苗、移栽具體是先打開(kāi)封口膜，往培養(yǎng)瓶中注入蒸餾水，以不淹沒(méi)小苗為標(biāo)準(zhǔn)，煉苗3~5d，期間缺水時(shí)及時(shí)補(bǔ)水。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大蔥雙單倍體育種方法，其特征在于步驟（3）所述的基質(zhì)為草炭與珍珠巖的質(zhì)量比為1:1的基質(zhì)。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了蔬菜育種方法，尤其涉及一種大蔥雙單倍體育種方法，它屬于生物技術(shù)與雙單倍體育種技術(shù)領(lǐng)域。一種大蔥雙單倍體育種方法，步驟如下：（1）田間種植和取樣；（2）離體雌核培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體，以MS+1.0mg·L?12,4?D+0.04?mg·L?1NAA+2.5mg·L?16?BA+10%蔗糖+7g·L?1瓊脂為誘導(dǎo)培養(yǎng)基；（3）胚培養(yǎng)和再生植株的獲得；（4）大蔥種子的培育。本發(fā)明育種方法加速了育種進(jìn)程，快速獲得純系，只需1代即可獲得高度純合的DH系，改變了傳統(tǒng)育種方法進(jìn)行純系的選育一般需要連續(xù)自交4?5代，顯著縮短育種年限，提高育種效率。

技術(shù)研發(fā)人員：李娜,崔連偉,賈俊香,楊國(guó)棟,蔣欣陶,田云,姜濱濱,李振,吳興壯
受保護(hù)的技術(shù)使用者：遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6