本發(fā)明涉及一種叢生芽誘導(dǎo)方法，尤指一種以文冠果嫩枝為外植體的叢生芽誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù)：
文冠果，無(wú)患子科、文冠果屬，落葉灌木或小喬木，高可達(dá)5米；分布中國(guó)北部和東北部，西至寧夏、甘肅，東北至遼寧，北至內(nèi)蒙古，南至河南。野生于丘陵山坡等處，各地也常栽培。小枝褐紅色粗壯，葉連柄長(zhǎng)可達(dá)30厘米；小葉對(duì)生，兩側(cè)稍不對(duì)稱，頂端漸尖，基部楔形，邊緣有銳利鋸齒，兩性花的花序頂生，雄花序腋生，直立，總花梗短，花瓣白色，基部紫紅色或黃色，花盤的角狀附屬體橙黃色，花絲無(wú)毛；蒴果長(zhǎng)達(dá)6厘米；種子黑色而有光澤。春季開花，秋初結(jié)果。
文冠果耐干旱、貧瘠、抗風(fēng)沙，在石質(zhì)山地、黃土丘陵、石灰性沖積土壤、固定或半固定的沙區(qū)均能成長(zhǎng)，是中國(guó)特有的一種食用油料樹種。
文冠果具有較高的工業(yè)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，油脂成份在種子和種仁中含量極高。研究結(jié)果證明：種仁中含油量達(dá)66.39％，優(yōu)良品種的種仁中含油量達(dá)72％，超過-般的油料植物，其油脂的基本組成如下：硬脂酸、油酸38.9％(-般食用油的主要成份之-)亞油酸40.2％(和豆油、核桃油相近，也是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最高的部分山崳酸7.2％亞麻酸及甘碳烯酸各為0.3％文冠果是我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)木本油料樹種，油黃色而透明，食用味美，油中所含亞油酸是中藥益壽寧的主要成份，具有極好降血壓作用，食用文冠果油可有效預(yù)防高血壓、高血脂、血管硬化等病癥。此外，文冠果種仁除可加工食用油外，還可制作高級(jí)潤(rùn)滑油、高級(jí)油漆、增塑劑、化妝品等工業(yè)原料。由文冠果籽油制備的生物柴油相關(guān)烴脂類成分含量高，內(nèi)含18c的烴類占93.4％，而且無(wú)s、無(wú)n等污染環(huán)境因子，符合理想生物柴油指標(biāo)。文冠果的柴油提取已獲成功，陜西、河南、甘肅、北京等國(guó)內(nèi)地區(qū)已在積極籌建文冠果油大中型加工廠，日本、韓國(guó)、加拿大等國(guó)也紛紛建造文冠果園林基地及加工廠。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明一種以文冠果成熟胚為外植體的不定芽誘導(dǎo)方法的目的是提供一種以文冠果成熟胚為外植體的不定芽誘導(dǎo)方法。
本發(fā)明一種以文冠果成熟胚為外植體的不定芽誘導(dǎo)方法，所采用的技術(shù)手段是：首先在每年5月下旬-7月下旬，于文冠果母株上采集半木質(zhì)化枝條；然后對(duì)采集的半木質(zhì)化枝條進(jìn)行表面滅菌處理；第三步經(jīng)過無(wú)菌操作手續(xù)接種到培養(yǎng)基上，所述的培養(yǎng)基配方為wpm+6-ba1.0mg/l+tdz0.05mg/l+naa0.1mg/l+水解乳蛋白0.25g/l+肌醇0.2g/l；對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行消毒后，在超凈工作臺(tái)上將所述枝條剪成2-3cm的莖段，每個(gè)莖段至少包含1個(gè)腋芽，將莖段放在滅過菌的濾紙上吸干表面水分后接種在事先配制好的腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；最后在培養(yǎng)條件為25±2℃暗培7天后，轉(zhuǎn)至光照下培養(yǎng)，光照時(shí)間為13h，光照強(qiáng)度為2000-3000lux，溫度保持在25±2℃，空氣濕度為30-40％，接種15天后統(tǒng)計(jì)腋芽萌發(fā)率。
文冠果母株上選擇半木質(zhì)化枝條采集，應(yīng)選擇無(wú)病蟲害、腋芽飽滿的材料；要隨采隨處理，如不能及時(shí)處理，要將枝條的下端浸泡在清水中，使之保持水分不散失，但放置時(shí)間不能超過24h；嫩枝的采集時(shí)間正逢雨季，要隨時(shí)觀察天氣的變化，提前做好準(zhǔn)備；雨后應(yīng)于烈日暴曬3天后進(jìn)行采集。
消毒滅菌過程如下：
首先將枝條上的葉片去掉，用中性洗滌劑飽和液浸泡10-15minmin，在飽和液中用軟刷刷洗枝條，用清水沖洗干凈；剪成10cm-15cm的小段，在流水下沖洗1-2h；
然后在超凈臺(tái)上，用70％酒精浸泡10-20s，用無(wú)菌水沖洗3-5遍；
最后用0.1％濃度升汞溶液(hgcl)進(jìn)行消毒，消毒時(shí)間為3-8min，用無(wú)菌水沖洗5-8遍，每次保持1-2min。
與現(xiàn)有技術(shù)的相比，本發(fā)明一種以文冠果成熟胚為外植體的不定芽誘導(dǎo)方法的有益效果是采用首先在每年5月下旬-7月下旬，于文冠果母株上采集半木質(zhì)化枝條；然后對(duì)采集的半木質(zhì)化枝條進(jìn)行表面滅菌處理；第三步經(jīng)過無(wú)菌操作手續(xù)接種到培養(yǎng)基上，所述的培養(yǎng)基配方為wpm+6-ba1.0mg/l+tdz0.05mg/l+naa0.1mg/l+水解乳蛋白0.25g/l+肌醇0.2g/l；對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行消毒后，在超凈工作臺(tái)上將所述枝條剪成2-3cm的莖段，每個(gè)莖段至少包含1個(gè)腋芽，將莖段放在滅過菌的濾紙上吸干表面水分后接種在事先配制好的腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；最后在培養(yǎng)條件為25±2℃暗培7天后，轉(zhuǎn)至光照下培養(yǎng)，光照時(shí)間為13h，光照強(qiáng)度為2000-3000lux，溫度保持在25±2℃，空氣濕度為30-40％，接種15天后統(tǒng)計(jì)腋芽萌發(fā)率，采用以上方法文冠果嫩枝叢生芽的誘導(dǎo)率可達(dá)96.1％。
具體實(shí)施方式
為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1
1、外植體采集、處理與消毒
5月下旬-7月下旬，于文冠果母株上選擇半木質(zhì)化枝條，應(yīng)選擇無(wú)病蟲害、腋芽飽滿的材料。要隨采隨處理，如不能及時(shí)處理，要將枝條的下端浸泡在清水中，使之保持水分不散失，但放置時(shí)間不能超過24h。嫩枝的采集時(shí)間正逢雨季，要隨時(shí)觀察天氣的變化，提前做好準(zhǔn)備。雨后應(yīng)于烈日暴曬3天后進(jìn)行采集。
從外界或室內(nèi)采集的嫩枝都不同程度的帶有各種微生物，一旦被帶入培養(yǎng)基，便會(huì)造成培養(yǎng)基污染，從而影響試驗(yàn)效果。因此，植物材料必須經(jīng)過嚴(yán)格的表面滅菌處理，再經(jīng)無(wú)菌操作手續(xù)接種到培養(yǎng)基上。消毒滅菌過程如下：
(1)將枝條上的葉片去掉，用中性洗滌劑飽和液浸泡10min，在飽和液中用軟刷刷洗枝條，用清水沖洗干凈；剪成10cm-15cm的小段，在流水下沖洗1h；
(2)在超凈臺(tái)上，用70％酒精浸泡10s，用無(wú)菌水沖洗3遍(根據(jù)枝條的木質(zhì)化程度不同，消毒時(shí)間不同，隨著枝條木質(zhì)化程度的提高，消毒時(shí)間隨之加長(zhǎng))；
(3)用0.1％濃度升汞(hgcl)進(jìn)行消毒，消毒時(shí)間為3min(根據(jù)枝條的木質(zhì)化程度不同，消毒時(shí)間不同，隨著枝條木質(zhì)化程度的提高，消毒時(shí)間隨之加長(zhǎng))，用無(wú)菌水沖洗5遍，每次保持1min。
2、培養(yǎng)基配方
wpm+6-ba1.0mg/l+tdz0.05mg/l+naa0.1mg/l+水解乳蛋白0.25g/l+肌醇0.2g/l
3、接種方法
將枝條采集后，按照上述消毒方法進(jìn)行消毒，然后在超凈工作臺(tái)上剪成2cm的莖段，每個(gè)莖段至少包含1個(gè)腋芽，將莖段放在滅過菌的濾紙上吸干表面水分后接種在事先配制好的腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。
4、培養(yǎng)條件
25±2℃暗培7天后，轉(zhuǎn)至光照下培養(yǎng)，光照時(shí)間為13h，光照強(qiáng)度為2000lux，溫度保持在25±2℃，空氣濕度為30-40％，接種15天后統(tǒng)計(jì)腋芽萌發(fā)率。
實(shí)施例2
1、外植體采集、處理與消毒
4月下旬-7月下旬，于文冠果母株上選擇半木質(zhì)化枝條，應(yīng)選擇無(wú)病蟲害、腋芽飽滿、種子飽滿的材料。要隨采隨處理，如不能及時(shí)處理，要將枝條的下端浸泡在清水中，使之保持水分不散失，但放置時(shí)間不能超過24h。嫩枝的采集時(shí)間正逢雨季，要隨時(shí)觀察天氣的變化，提前做好準(zhǔn)備。雨后應(yīng)于烈日暴曬3天后進(jìn)行采集。
從外界或室內(nèi)采集的嫩枝都不同程度的帶有各種微生物，一旦被帶入培養(yǎng)基，便會(huì)造成培養(yǎng)基污染，從而影響試驗(yàn)效果。因此，植物材料必須經(jīng)過嚴(yán)格的表面滅菌處理，再經(jīng)無(wú)菌操作手續(xù)接種到培養(yǎng)基上。消毒滅菌過程如下：
(1)將枝條上的葉片去掉，用中性洗滌劑飽和液浸泡10min，在飽和液中用軟刷刷洗枝條，用清水沖洗干凈；剪成10cm左右的小段，在流水下沖洗1.5h；
(2)在超凈臺(tái)上，用70％酒精浸泡15s，用無(wú)菌水沖洗4遍(根據(jù)枝條的木質(zhì)化程度不同，消毒時(shí)間不同，隨著枝條木質(zhì)化程度的提高，消毒時(shí)間隨之加長(zhǎng))；
(3)用0.1％濃度升汞(hgcl)進(jìn)行消毒，消毒時(shí)間為5min(根據(jù)枝條的木質(zhì)化程度不同，消毒時(shí)間不同，隨著枝條木質(zhì)化程度的提高，消毒時(shí)間隨之加長(zhǎng))，用無(wú)菌水沖洗6遍，每次保持1min。
2、培養(yǎng)基配方
wpm+6-ba1.0mg/l+tdz0.05mg/l+naa0.1mg/l+水解乳蛋白0.25g/l+肌醇0.2g/l
3、接種方法
將枝條采集后，按照上述消毒方法進(jìn)行消毒，然后在超凈工作臺(tái)上剪成2-3cm的莖段，每個(gè)莖段至少包含1個(gè)腋芽，將莖段放在滅過菌的濾紙上吸干表面水分后接種在事先配制好的腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。
4、培養(yǎng)條件
25±2℃暗培7天后，轉(zhuǎn)至光照下培養(yǎng)，光照時(shí)間為13h，光照強(qiáng)度為2500lux，溫度保持在25±2℃，空氣濕度為30-40％，接種15天后統(tǒng)計(jì)腋芽萌發(fā)率。
實(shí)施例3
1、外植體采集、處理與消毒
4月下旬-7月下旬，于文冠果母株上選擇半木質(zhì)化枝條，應(yīng)選擇無(wú)病蟲害、腋芽飽滿、種子飽滿的材料。要隨采隨處理，如不能及時(shí)處理，要將枝條的下端浸泡在清水中，使之保持水分不散失，但放置時(shí)間不能超過24h。嫩枝的采集時(shí)間正逢雨季，要隨時(shí)觀察天氣的變化，提前做好準(zhǔn)備。雨后應(yīng)于烈日暴曬3天后進(jìn)行采集。
從外界或室內(nèi)采集的嫩枝都不同程度的帶有各種微生物，一旦被帶入培養(yǎng)基，便會(huì)造成培養(yǎng)基污染，從而影響試驗(yàn)效果。因此，植物材料必須經(jīng)過嚴(yán)格的表面滅菌處理，再經(jīng)無(wú)菌操作手續(xù)接種到培養(yǎng)基上。消毒滅菌過程如下：
(1)將枝條上的葉片去掉，用中性洗滌劑飽和液浸泡10min，在飽和液中用軟刷刷洗枝條，用清水沖洗干凈；剪成10cm左右的小段，在流水下沖洗2h；
(2)在超凈臺(tái)上，用70％酒精浸泡20s，用無(wú)菌水沖洗5遍(根據(jù)枝條的木質(zhì)化程度不同，消毒時(shí)間不同，隨著枝條木質(zhì)化程度的提高，消毒時(shí)間隨之加長(zhǎng))；
(3)用0.1％濃度升汞(hgcl)進(jìn)行消毒，消毒時(shí)間為8min(根據(jù)枝條的木質(zhì)化程度不同，消毒時(shí)間不同，隨著枝條木質(zhì)化程度的提高，消毒時(shí)間隨之加長(zhǎng))，用無(wú)菌水沖洗8遍，每次保持1min。
2、培養(yǎng)基配方
wpm+6-ba1.0mg/l+tdz0.05mg/l+naa0.1mg/l+水解乳蛋白0.25g/l+肌醇0.2g/l
3、接種方法
將枝條采集后，按照上述消毒方法進(jìn)行消毒，然后在超凈工作臺(tái)上剪成3cm的莖段，每個(gè)莖段至少包含1個(gè)腋芽，將莖段放在滅過菌的濾紙上吸干表面水分后接種在事先配制好的腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。
4、培養(yǎng)條件
25±2℃暗培7天后，轉(zhuǎn)至光照下培養(yǎng)，光照時(shí)間為13h，光照強(qiáng)度為3000lux，溫度保持在25±2℃，空氣濕度為30-40％，接種15天后統(tǒng)計(jì)腋芽萌發(fā)率。
采用以上方法文冠果嫩枝叢生芽的誘導(dǎo)率可達(dá)96.1％。