本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種抑制青花菜組培苗內(nèi)生菌污染的方法。

背景技術(shù)：

青花菜( Brassia oleracea L. var. varitalica Planch) 又名西蘭花、綠菜花、嫩莖青花菜，為十字花科蕓薹屬甘藍類蔬菜，富含多種維生素、礦物質(zhì)和天然防癌抗癌物質(zhì)，是營養(yǎng)價值很高的蔬菜。青花菜起源于地中海沿岸，國內(nèi)種質(zhì)資源匱乏，種子價格昂貴，國外優(yōu)良種質(zhì)又難以獲得，這些因素制約著國內(nèi)青花菜多類型優(yōu)良品種選育工作的開展。優(yōu)質(zhì)、抗逆、抗病品種的培育一直是育種家關(guān)注的熱點問題之一。而培育優(yōu)良品種的首要關(guān)鍵是選育具備目標特性的青花菜種質(zhì)資源。

關(guān)于青花菜的組織培養(yǎng)、快繁的研究最早見于國外的Anderson（1977）和Johnson（1978）。而在國內(nèi)，李曙軒等（1983）利用葉片、中肋等外植體的組培，在基本培養(yǎng)基MS內(nèi)附加一定量的激素配比的條件下已取得了不錯的效果；張麗麗等（2008）以青花菜帶柄子葉為外植體，研究其高頻離體再生體系，獲得了較高的再生頻率均高于80%。

在植物組織培養(yǎng)中，由于材料內(nèi)部（細胞內(nèi)或胞間)的內(nèi)生細菌不能被一般的表面消毒方法所清除，隨著材料帶入培養(yǎng)過程，引起的污染稱為內(nèi)生細菌污染或內(nèi)源細菌污染。這些內(nèi)生細菌就會生長出來并引起程度不一的污染，產(chǎn)生程度不一的危害。很多科研人員采用外植體預處理、培養(yǎng)基中添加抗生素等技術(shù)手段，以達到抑制內(nèi)生菌污染的目的。但是使用抗生素可能對哺乳類動物有害；若是使用生長期較長的植物，微生物亦有抗藥性產(chǎn)生；而且容易錯誤使用，比如沒有針對微生物而使用各種不同的抗生素。針對青花菜和結(jié)球甘藍的組織培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)基中的細胞分裂素6-BA也會促使組培苗中的內(nèi)生菌釋放到培養(yǎng)基中，形成污染。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種抑制青花菜組培苗內(nèi)生菌污染的方法，實現(xiàn)對青花菜材料的保存和擴繁，以滿足育種和生產(chǎn)上的需要。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:

一種抑制青花菜組培苗內(nèi)生菌污染的方法，包括以下步驟：取種子或腋芽作外植體，在自來水下沖洗30～60分鐘，后用吸水紙吸干外植體表面水分，置于無菌培養(yǎng)瓶中用濃度為75%的乙醇針對滅菌30～60秒，再用滅菌劑消毒13～20分鐘，后用無菌水沖洗3～5次，然后將無菌外植體接種到增殖培養(yǎng)基上，置于25±2℃培養(yǎng)室中培養(yǎng)；培養(yǎng)20～25天時，分離新幼芽無菌轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；將出現(xiàn)內(nèi)生菌污染的再生苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，后再轉(zhuǎn)接至同類生根培養(yǎng)基培養(yǎng)直至生根；所述的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1～0.15 mg/L IBA+0.1～0.2 mg/L NAA，含20～30%蔗糖，0.8～1.0%瓊脂，0.1-0.2‰易培隆，pH值為5.8～6.0。

本方法采用連續(xù)多次把內(nèi)生菌污染組培苗轉(zhuǎn)接到添加易培隆的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)的方法，以達到保持組培苗健康生長、生根的目的。

作為優(yōu)選，所述的外植體沖洗方法為：在自來水下沖洗30～60分鐘，后用吸水紙吸干外植體表面水分后滅菌。

作為優(yōu)選，所述的滅菌方法為：將外植體置于無菌培養(yǎng)瓶中用濃度為75%的乙醇針對滅菌30～60秒，再用滅菌劑消毒13～20分鐘，后用無菌水沖洗3～5次。

作為優(yōu)選，所述種子外植體顆粒飽滿、無病蟲害，腋芽外植體為新長出的帶柄幼嫩花球，包含至少一個芽點。

作為優(yōu)選，所述滅菌劑是體積分數(shù)為0.1%氯化汞或5～10%次氯酸鈉溶液。

作為優(yōu)選，所述用滅菌劑對外植體進行滅菌時，不斷反復震蕩使得外植體充分接觸滅菌劑。本發(fā)明不斷反復震蕩青花菜外植體，使其充分接觸滅菌劑，可以提高滅菌效果。

作為優(yōu)選，所述增殖培養(yǎng)基為MS+2～3mg/L 6-BA+0.05～0.1mg/L NAA，含20～30%蔗糖，0.8～1.0%瓊脂，pH值為5.8～6.0，其中NAA為萘乙酸，6-BA為6-芐基腺嘌呤。本發(fā)明的增殖培養(yǎng)基中的NAA可以促使組培苗生根，封閉內(nèi)生菌釋放到培養(yǎng)基的通道。

作為優(yōu)選，所述MS培養(yǎng)基，以1L計，組成為：NH₄HO₃ 1650 mg，KNO₃ 1900 mg，CaCl₂·2H₂O 440 mg，KH₂PO₄ 170 mg，MgSO₄·7H₂O 370 mg，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8 mg，Na₂EDTA 37.3 mg，H₃BO₃ 6.2 mg，MnSO₄·H₂O 16.9 mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg，CuSO₄·5H₂O 0.025 mg，CoCl₂·6H₂O 0.025 mg，KI 0.83 mg，肌醇100 mg，甘氨酸2 mg，煙酸0.5 mg，維生素B1 0.1 mg，維生素B6 0.5 mg和余量的無菌水。

作為優(yōu)選，所述內(nèi)生菌污染表現(xiàn)為新生組培苗根部總是出現(xiàn)細菌污染。

作為優(yōu)選，所述發(fā)現(xiàn)組培苗根部出現(xiàn)細菌污染時，立即去掉受污染根部，接入到上述生根培養(yǎng)基培養(yǎng)7～10天，連續(xù)轉(zhuǎn)接3～5次直至生根。

有益效果：

1）本發(fā)明的易培隆有利于抑制內(nèi)生菌生長和擴散，把受到內(nèi)生菌污染的組培苗多次轉(zhuǎn)接到加有易培隆的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)生根，可以很好的抑制內(nèi)生菌污染，獲得數(shù)量較多的組培苗。

2）本方法具有操作簡便、繁殖效率高等優(yōu)點。

3）本方法可以降低組培苗內(nèi)生菌污染率50%以上。組培苗再生植株與種子實生苗在田間表現(xiàn)相比，沒有明顯差異。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述，但不局限于此。

實施例1

增殖培養(yǎng)基為：MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.05mg/L，含20%蔗糖，0.8%瓊脂，0.1‰ 易培隆，pH值為5.8；生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1mg/L IBA+0.15 mg/L NAA，含20%蔗糖，0.8%瓊脂，0.1‰ 易培隆，pH值為6.0。

所述的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1mg/L IBA+0.1 mg/L NAA，含20%蔗糖，0.8%瓊脂，0.1‰易培隆，pH值為6.0。

所述MS培養(yǎng)基，以1L計，組成為：NH₄HO₃ 1650 mg，KNO₃ 1900 mg，CaCl₂·2H₂O 440 mg，KH₂PO₄ 170 mg，MgSO₄·7H₂O 370 mg，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8 mg，Na₂EDTA 37.3 mg，H₃BO₃ 6.2 mg，MnSO₄·H₂O 16.9 mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg，CuSO₄·5H₂O 0.025 mg，CoCl₂·6H₂O 0.025 mg，KI 0.83 mg，肌醇100 mg，甘氨酸2 mg，煙酸0.5 mg，維生素B1 0.1 mg，維生素B6 0.5 mg和余量的無菌水。

從田間取回正在生長的青花菜幼嫩帶柄花球（包含至少一個芽點），在實驗室超凈工作臺上用解剖刀切成3cm的小塊，用濃度為75%的乙醇在其表面滅菌30秒，再用體積分數(shù)為5%的次氯酸鈉溶液消毒18分鐘，用無菌水沖洗5次，然后將無菌外植體接種到增殖培養(yǎng)基上，置于23℃培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)20天時形成新芽；轉(zhuǎn)接內(nèi)生菌污染新芽到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)7天后再次轉(zhuǎn)接到新是生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天，后再次轉(zhuǎn)接到此生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，組培苗最后形成了健康根系，內(nèi)生菌污染得到了有效抑制。

結(jié)果：本方法降低了組培苗內(nèi)生菌污染率55%。

實施例2

增殖培養(yǎng)基為：MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.05mg/L，含20%蔗糖，0.9%瓊脂，0.15‰ 易培隆，pH值為5.8；生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1mg/L IBA+0.15 mg/L NAA，含20%蔗糖，0.9%瓊脂，0.15‰ 易培隆，pH值為5.9。

所述的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.15 mg/L IBA+0.2 mg/L NAA，含30%蔗糖，1.0%瓊脂，0.2‰易培隆，pH值為5.9。

所述MS培養(yǎng)基，以1L計，組成為：NH₄HO₃ 1650 mg，KNO₃ 1900 mg，CaCl₂·2H₂O 440 mg，KH₂PO₄ 170 mg，MgSO₄·7H₂O 370 mg，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8 mg，Na₂EDTA 37.3 mg，H₃BO₃ 6.2 mg，MnSO₄·H₂O 16.9 mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg，CuSO₄·5H₂O 0.025 mg，CoCl₂·6H₂O 0.025 mg，KI 0.83 mg，肌醇100 mg，甘氨酸2 mg，煙酸0.5 mg，維生素B1 0.1 mg，維生素B6 0.5 mg和余量的無菌水。

以青花菜種子作外植體（外植體顆粒飽滿、無病蟲害），用濃度為75%的乙醇在其表面滅菌45秒，再用體積分數(shù)為0.1%的氯化汞溶液消毒13分鐘，用無菌水沖洗5次，然后將無菌外植體接種到增殖培養(yǎng)基上，置于25℃培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)25天時形成新芽；轉(zhuǎn)接內(nèi)生菌污染新芽到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)10天后再次轉(zhuǎn)接到新是生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天，后再次轉(zhuǎn)接到此生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，組培苗最后形成了健康根系，內(nèi)生菌污染得到了有效抑制。

結(jié)果：本方法降低了組培苗內(nèi)生菌污染率65%。

實施例3

增殖培養(yǎng)基為：MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.05mg/L，含20%蔗糖，0.9%瓊脂，0.2‰ 易培隆，pH值為6.0；生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1mg/L IBA+0.15 mg/L NAA，含20%蔗糖，0.9%瓊脂，0.2‰ 易培隆，pH值為6.0。

所述的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.13 mg/L IBA+0.15mg/L NAA，含25%蔗糖，0.9%瓊脂，0.15‰易培隆，pH值為5.8。

所述MS培養(yǎng)基，以1L計，組成為：NH₄HO₃ 1650 mg，KNO₃ 1900 mg，CaCl₂·2H₂O 440 mg，KH₂PO₄ 170 mg，MgSO₄·7H₂O 370 mg，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8 mg，Na₂EDTA 37.3 mg，H₃BO₃ 6.2 mg，MnSO₄·H₂O 16.9 mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg，CuSO₄·5H₂O 0.025 mg，CoCl₂·6H₂O 0.025 mg，KI 0.83 mg，肌醇100 mg，甘氨酸2 mg，煙酸0.5 mg，維生素B1 0.1 mg，維生素B6 0.5 mg和余量的無菌水。

從田間取回正在生長的青花菜幼嫩帶柄花球（包含至少一個芽點），在實驗室超凈工作臺上用解剖刀切成3cm的小塊，用濃度為75%的乙醇在其表面滅菌30秒，再用體積分數(shù)為10%的次氯酸鈉溶液消毒18分鐘，用無菌水沖洗5次，然后將無菌外植體接種到增殖培養(yǎng)基上，置于23℃培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)20天時形成新芽；轉(zhuǎn)接內(nèi)生菌污染新芽到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)10天后再次轉(zhuǎn)接到新是生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)15天，后再次轉(zhuǎn)接到此生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，組培苗最后形成了健康根系，內(nèi)生菌污染得到了有效抑制。

結(jié)果：本方法降低了組培苗內(nèi)生菌污染率55%。

實施例4

生根培養(yǎng)基：1/2 MS+0.14 mg/L IBA+0.1mg/L NAA，含22%蔗糖，0.8%瓊脂，0.2‰易培隆，pH值為6.0。

增殖培養(yǎng)基：MS+2.5mg/L 6-BA+0.08mg/L NAA，含25%蔗糖，1.0%瓊脂，pH值為6.0，其中NAA為萘乙酸，6-BA為6-芐基腺嘌呤。

所述MS培養(yǎng)基，以1L計，組成為：NH₄HO₃ 1650 mg，KNO₃ 1900 mg，CaCl₂·2H₂O 440 mg，KH₂PO₄ 170 mg，MgSO₄·7H₂O 370 mg，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8 mg，Na₂EDTA 37.3 mg，H₃BO₃ 6.2 mg，MnSO₄·H₂O 16.9 mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg，CuSO₄·5H₂O 0.025 mg，CoCl₂·6H₂O 0.025 mg，KI 0.83 mg，肌醇100 mg，甘氨酸2 mg，煙酸0.5 mg，維生素B1 0.1 mg，維生素B6 0.5 mg和余量的無菌水。

一種抑制青花菜組培苗內(nèi)生菌污染的方法，包括以下步驟：從田間取回正在生長的青花菜幼嫩帶柄花球（包含至少一個芽點），在自來水下沖洗30分鐘，后用吸水紙吸干外植體表面水分，置于無菌培養(yǎng)瓶中用濃度為75%的乙醇針對滅菌60秒，再用體積分數(shù)為8%次氯酸鈉溶液反復震蕩消毒20分鐘，后用無菌水沖洗3次，然后將無菌外植體接種到增殖培養(yǎng)基上，置于27℃培養(yǎng)室中培養(yǎng)；培養(yǎng)23天時，分離新幼芽無菌轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；當組培苗根部出現(xiàn)細菌污染（表現(xiàn)為新生組培苗根部總是出現(xiàn)細菌污染）時，立即去掉受污染根部，接入到上述生根培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次直至生根。

實施例5

生根培養(yǎng)基：1/2 MS+0.15 mg/L IBA+0.2 mg/L NAA，含20%蔗糖，1.0%瓊脂，0.15‰易培隆，pH值為5.9。

增殖培養(yǎng)基：MS+3mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，含30%蔗糖，0.9%瓊脂，pH值為6.0，其中NAA為萘乙酸，6-BA為6-芐基腺嘌呤。

所述MS培養(yǎng)基，以1L計，組成為：NH₄HO₃ 1650 mg，KNO₃ 1900 mg，CaCl₂·2H₂O 440 mg，KH₂PO₄ 170 mg，MgSO₄·7H₂O 370 mg，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8 mg，Na₂EDTA 37.3 mg，H₃BO₃ 6.2 mg，MnSO₄·H₂O 16.9 mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg，CuSO₄·5H₂O 0.025 mg，CoCl₂·6H₂O 0.025 mg，KI 0.83 mg，肌醇100 mg，甘氨酸2 mg，煙酸0.5 mg，維生素B1 0.1 mg，維生素B6 0.5 mg和余量的無菌水。

一種抑制青花菜組培苗內(nèi)生菌污染的方法，包括以下步驟：取青花菜種子（顆粒飽滿、無病蟲害），在自來水下沖洗60分鐘，后用吸水紙吸干外植體表面水分，置于無菌培養(yǎng)瓶中用濃度為75%的乙醇針對滅菌30秒，再用體積分數(shù)為0.1%氯化汞反復震蕩消毒15分鐘，后用無菌水沖洗4次，然后將無菌外植體接種到增殖培養(yǎng)基上，置于25℃培養(yǎng)室中培養(yǎng)；培養(yǎng)20天時，分離新幼芽無菌轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；當組培苗根部出現(xiàn)細菌污染（表現(xiàn)為新生組培苗根部總是出現(xiàn)細菌污染）時，立即去掉受污染根部，接入到上述生根培養(yǎng)基培養(yǎng)10天，連續(xù)轉(zhuǎn)接5次直至生根。