本發(fā)明涉及用于改善干細(xì)胞儲存穩(wěn)定性的組合物，且更具體地，涉及用于改善干細(xì)胞的冷凍儲存穩(wěn)定性的組合物，所述組合物包含血清或血漿。

背景技術(shù)：

干細(xì)胞是指能夠分化成為至少兩種細(xì)胞同時具有自我復(fù)制能力的細(xì)胞，且可分為全能(totipotent)干細(xì)胞、多潛能(pluripotent)干細(xì)胞和多能(multipotent)干細(xì)胞。

全能干細(xì)胞是具有全能性質(zhì)的能夠發(fā)育成為一個完美個體的細(xì)胞，且通過卵細(xì)胞和精子受精后這些性質(zhì)由具有至多8-細(xì)胞階段的細(xì)胞所擁有。當(dāng)分離這些細(xì)胞并移植入子宮時，這些細(xì)胞可發(fā)育成一個完整個體。全能干細(xì)胞(能夠發(fā)育成為源自外胚層、中胚層和內(nèi)胚層的多種細(xì)胞和組織)源自內(nèi)細(xì)胞團，所述內(nèi)細(xì)胞團位于受精后4-5天生成的囊胚內(nèi)。這些細(xì)胞稱為"胚胎干細(xì)胞"且可分化成為多種其他組織細(xì)胞，但不形成新的有生命的生物體。多能干細(xì)胞是能夠分化成僅對包含這些細(xì)胞的組織和器官具有特異性細(xì)胞的干細(xì)胞。

多能干細(xì)胞首先從成人骨髓分離(y.jiang等人，nature,418:41,2002)，且此后，其在數(shù)種其他成人組織中得以確認(rèn)(c.m.verfaillie等人，trendscellbiol.12:502,2002)。然而，成人組織諸如骨髓中的干細(xì)胞存在很少，且在無分化誘導(dǎo)下難以培養(yǎng)這些細(xì)胞，且因此，在無特異性篩選的培養(yǎng)基下難以培養(yǎng)這些細(xì)胞。換言之，其缺點在于難以在體外分離干細(xì)胞并保存該細(xì)胞。

近來，發(fā)現(xiàn)了脂肪組織是多能干細(xì)胞的新的來源(b.cousin等人，bbrc,301:1016,2003；a.miranville等人，circulation,110:349,2004；s.gronthos等人，j.cellphysiol.189:54,2001；m.j.seo等人，bbrc,328:258,2005)，且已報導(dǎo)未分化的細(xì)胞群體包含在通過脂肪提取(吸脂)獲得的人脂肪組織中，且在體外具有分化成脂肪細(xì)胞、骨形成細(xì)胞、成肌細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的潛力(p.a.zuk等人，tissueeng.7:211,2001；a.m.rodriguez等人，bbrc,315:255,2004)。此外，通過動物模型實驗已知，源自脂肪組織的細(xì)胞具有肌肉再生能力和促進神經(jīng)血管分化的能力。脂肪組織具有能夠大量提取的優(yōu)勢，且因此，其已作為補充現(xiàn)有不足的干細(xì)胞的新來源受到關(guān)注。

能夠大量獲得的干細(xì)胞已作為用于將干細(xì)胞本身進行注射的細(xì)胞治療劑更多地使用，以實現(xiàn)醫(yī)藥領(lǐng)域的主要目的，包括治療不能治愈的疾病、美容、化妝品等。

培養(yǎng)干細(xì)胞后，當(dāng)將醫(yī)療步驟直接用于患者時，用于細(xì)胞治療劑目的的干細(xì)胞沒有問題。然而，取決于患者病況，當(dāng)需要控制用于干細(xì)胞醫(yī)療步驟的時間時，培養(yǎng)干細(xì)胞后需要長期儲存。此外，當(dāng)需要長期運輸至用于實踐經(jīng)培養(yǎng)的干細(xì)胞的地點時，提供穩(wěn)定的干細(xì)胞至關(guān)重要。為此，需要持續(xù)約5-10天的長時間段維持干細(xì)胞的高存活率。然而，目前，當(dāng)長時間段保存干細(xì)胞而無冷凍時，存在的問題是細(xì)胞存活率十分低。同時，細(xì)胞冷凍方法在融化時引起細(xì)胞存活率顯著惡化，且從生物學(xué)的角度在干細(xì)胞功能性等方面存在問題。此外，在冷凍(freezing)狀態(tài)運輸相比在冷藏(refrigeration)狀態(tài)中運輸更加困難。

盡管目前常規(guī)用于保存干細(xì)胞的技術(shù)在冷藏狀態(tài)中，存在將人脂肪組織衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞在冷藏條件下懸浮并保存在鹽水中的技術(shù)，但在該情況中，當(dāng)將細(xì)胞保存48小時或更久時，難以具有70％或更高的存活率。確認(rèn)了當(dāng)添加蔗糖或白蛋白以克服困難時，直至48小時至72小時，存活率為70％或更高，并改善了儲存穩(wěn)定性(韓國特許第10-2008-0103637號)。然而，72小時后，由于存活率快速降低，需要開發(fā)用于在冷藏條件下(4℃)改善儲存穩(wěn)定性的組合物，進而包括在細(xì)胞治療劑中的干細(xì)胞可長時間穩(wěn)定維持高存活率。

因此，本發(fā)明的發(fā)明人在長時間冷凍儲存中維持干細(xì)胞的高存活率方面做出了努力，且結(jié)果是，發(fā)現(xiàn)了當(dāng)包含血清或血漿時，維持冷藏狀態(tài)的干細(xì)胞的高存活率至少9天，并完成了本發(fā)明。已存在其中人血清用作細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合物的情況(韓國特許第10-0394430號)，然而，并未公開包含人血清或人血漿的用于改善干細(xì)胞儲存穩(wěn)定性的組合物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供用于改善干細(xì)胞冷凍儲存穩(wěn)定性的組合物，其包含具有5-80％(v/v)含量的血清或血漿。

本發(fā)明的另一目的是提供包含如上文所述的組合物的細(xì)胞治療注射產(chǎn)品。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供用于改善干細(xì)胞冷凍儲存穩(wěn)定性的組合物，其包含具有5-80％(v/v)含量的血清或血漿。

本發(fā)明還提供包含上述組合物的細(xì)胞治療注射產(chǎn)品。

附圖簡述

圖1說明了用不同濃度(10、20和30％)的自體血清和包含0.3％白蛋白的防腐劑冷凍儲存干細(xì)胞后，基于0-144小時的保留時間，0.5x10⁷個干細(xì)胞的存活率的比較。對照組使用包含0.3％白蛋白的防腐劑。

圖2說明了用不同濃度(10、20和30％)的自體血清和包含0.3％白蛋白的防腐劑冷凍儲存干細(xì)胞后，基于0-144小時的保留時間，1x10⁷個干細(xì)胞的存活率的比較。對照組使用包含0.3％白蛋白的防腐劑。

圖3說明了用不同濃度(10、20和30％)的同種異體血清和包含0.3％白蛋白的防腐劑冷凍儲存干細(xì)胞后，基于0-144小時的保留時間，0.5x10⁷個干細(xì)胞的存活率的比較。對照組使用包含0.3％白蛋白的防腐劑。

圖4說明了用不同濃度(10、20和30％)的同種異體血清和包含0.3％白蛋白的防腐劑冷凍儲存干細(xì)胞后，基于0-144小時的保留時間，1x10⁷個干細(xì)胞的存活率的比較。對照組使用包含0.3％白蛋白的防腐劑。

圖5說明了干細(xì)胞#1的對照組(鹽水/0.3％白蛋白)和對應(yīng)于各自具有不同情況的實驗組(1-6)的用于改善儲存穩(wěn)定性的組合物中，細(xì)胞數(shù)、存活率和細(xì)胞大小的變化的比較結(jié)果。

圖6說明了干細(xì)胞#2的對照組(鹽水/0.3％白蛋白)和對應(yīng)于各自具有不同情況的實驗組(1-6)的用于改善儲存穩(wěn)定性的組合物中，細(xì)胞數(shù)、存活率和細(xì)胞大小的變化的比較結(jié)果。

圖7說明了防腐劑的ph對細(xì)胞存活率的影響。

圖8說明了血清和血漿對細(xì)胞活力效果的比較結(jié)果。

圖9說明了白蛋白對細(xì)胞活力的影響。

圖10說明了血清濃度對細(xì)胞活力效果的比較結(jié)果。

最佳模式

除非另外定義，本文使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的相同的含義。一般而言，本文使用的命名法為本領(lǐng)域公知和通用。

本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)了在冷藏狀態(tài)中干細(xì)胞95％或更高的存活率通過包含血清或血漿的干細(xì)胞防腐劑維持，由此干細(xì)胞的儲存穩(wěn)定性得以改善。根據(jù)本發(fā)明的包含血清或血漿的干細(xì)胞防腐劑能夠維持干細(xì)胞在冷藏狀態(tài)的高存活率至少9天，其可用于穩(wěn)定提供用于細(xì)胞療法的干細(xì)胞。

本文使用的術(shù)語“細(xì)胞治療注射產(chǎn)品"或“細(xì)胞治療劑”意為能夠包含干細(xì)胞以治療組織缺陷或在缺陷位點或其附近部分注射用于腸胃外施用(即作為注射形式)由此糾正缺陷的藥物組合物。

本文使用的術(shù)語“賦形劑”指除了具有藥理特性的有效組分的藥物組合物之外，以預(yù)先確定的體積和重量添加用于促進處理或添加以維持液體形式的材料，等。用于維持液體形式的賦形劑的實例一般包括鹽水、hartman-d溶液、pbs(磷酸鹽緩沖鹽水)等，但可包含其他含有多種組分的材料。

本文使用的術(shù)語"脂肪組織衍生的干細(xì)胞"是從脂肪組織分離的未分化的干細(xì)胞，且其分離方法如下。脂肪組織衍生的干細(xì)胞可通過下述方法分離：培養(yǎng)包含通過吸脂獲得懸浮于鹽水中的脂肪的懸浮液，用胰蛋白酶處理附著至培養(yǎng)容器的干細(xì)胞層以回收處理的干細(xì)胞或通過使用刮刀刮取來回收干細(xì)胞。

本發(fā)明的干細(xì)胞能夠通過下述方法獲得。

首先，分離通過吸脂從腹部脂肪獲得的人脂肪組織并用pbs洗滌。隨后，將分離的組織切細(xì)，通過使用添加了膠原酶的dmem培養(yǎng)基分解，并用pbs洗滌，隨后離心。去除上清并用pbs洗滌沉淀，隨后離心。使用100μm網(wǎng)孔去除漂浮的材料，并用pbs洗滌獲得的細(xì)胞。獲得的細(xì)胞在dmem(10％fbs，2mmnac，0.2mm抗壞血酸)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，且一晚后，未粘附至培養(yǎng)容器的細(xì)胞用pbs洗滌。隨后，傳代培養(yǎng)殘留的細(xì)胞同時每兩天用角質(zhì)形成細(xì)胞-sfm培養(yǎng)基(fbs、nac、抗壞血酸、鈣、regf、胰島素、bfgf和氫化可的松)替換培養(yǎng)基，由此可分離脂肪組織衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞。除上述方法之外，干細(xì)胞可通過本領(lǐng)域之前已知的方法獲得。

在本發(fā)明例示性的實施方案中，人脂肪組織衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞懸浮于包含10～50％(v/v)自體或同種異體人血清和0.3％白蛋白的組合物中或懸浮于包含人血漿和0.3％白蛋白的組合物中，且隨后，細(xì)胞的大小和性質(zhì)、細(xì)胞數(shù)目及其存活率依賴于在冷藏狀態(tài)(4℃)中的時間進行分析。

因此，根據(jù)本發(fā)明的目的，提供了用于改善干細(xì)胞的冷凍儲存穩(wěn)定性的組合物，其包含具有5-80％(v/v)含量的血清或血漿。

在本發(fā)明中，血清的含量優(yōu)選為10-50％(v/v)，且血漿的含量優(yōu)選為5-50％(v/v)，但其每種含量不限于此。

本發(fā)明的血清特征在于，其為源自哺乳動物(包括人)的血清或血漿。此外，其優(yōu)選為源自同種的血清或血漿，且可為自體血清或同種異體血清或血漿，而無限制。

在本發(fā)明中，冷凍儲存優(yōu)選具有0.1-10℃的溫度范圍，但冷凍儲存的溫度范圍不限于此。

在本發(fā)明中，用于改善干細(xì)胞冷凍儲存穩(wěn)定性的組合物可進一步包含白蛋白和賦形劑，其中白蛋白的含量優(yōu)選為0.1-1％(v/v)，更優(yōu)選0.2-0.5％(v/v)，但白蛋白的含量不限于此。此外，賦形劑優(yōu)選為選自下組的至少任一種：鹽水、hartmann-d溶液和pbs，但不限于此。

"v/v"意為其中通過添加1-80％的血清和0.1-1％的白蛋白至懸浮于鹽水中的干細(xì)胞體積(體積百分比)使總體積(體積百分比)為100％。

在本發(fā)明中，干細(xì)胞的濃度優(yōu)選為1.0x10⁵-1.0x10⁹個細(xì)胞/ml，且更優(yōu)選地1.0x10⁶-1.0x10⁸個細(xì)胞/ml，但干細(xì)胞的濃度不限于此。

在本發(fā)明中，干細(xì)胞優(yōu)選選自下組：脂肪、臍帶血、骨髓、肌肉、胎盤和皮膚，且在這些中，干細(xì)胞最優(yōu)選為脂肪組織衍生的干細(xì)胞，但本發(fā)明不限于此。此外，干細(xì)胞的特征在于其為源自哺乳動物(包括人)的干細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明的另一目的，提供了包含用于改善干細(xì)胞冷凍保存穩(wěn)定性的組合物的細(xì)胞治療注射產(chǎn)品，，所述組合物包含血清或血漿。

根據(jù)本發(fā)明的注射產(chǎn)品可以本領(lǐng)域一般已知的含量填充的注射形式制備，所述含量取決于患者缺陷的構(gòu)成和種類而不同。

根據(jù)本發(fā)明的注射產(chǎn)品可在待治療缺陷的附近區(qū)域或缺陷區(qū)域注射，且能夠由該注射糾正的缺陷可為皺紋、妊娠紋、疤痕、皮膚凹陷、嘴唇形成功能障礙、牙周缺陷、軟組織缺陷、骨缺陷、燒傷、皮膚潰瘍等。然而，缺陷的種類不限于此。

本發(fā)明中，如果需要，細(xì)胞治療注射產(chǎn)品可進一步包括懸浮劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、防腐劑、吸附抑制劑、表面活性劑、稀釋劑、ph調(diào)節(jié)劑、無痛化劑(soothingagents)、緩沖劑、含硫還原劑、抗氧化劑等。

實施例

此后，本發(fā)明將參照下列實施例進行更詳細(xì)地說明。這些實施例僅用于闡釋本發(fā)明，且對本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是本發(fā)明的保護范圍不應(yīng)理解為受這些實施例的限制。

實施例1：人脂肪衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

通過吸脂從腹部脂肪分離獲得人脂肪組織并用pbs洗滌。切細(xì)分離的組織并通過使用添加了1型膠原酶(1mg/ml)的dmem培養(yǎng)基在37℃分解2小時。使用pbs洗滌用膠原酶處理的組織并在1000rpm離心5分鐘。取出上清并用pbs洗滌沉淀，隨后在1000rpm離心5分鐘。通過使用100μm網(wǎng)孔過濾去除漂浮的材料，且獲得的細(xì)胞用pbs洗滌，并在dmem(10％fbs，2mmnac(n-乙酰基-l-半胱氨酸)和0.2mm抗壞血酸)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。一晚后，用pbs洗滌未附著至培養(yǎng)容器的細(xì)胞，且隨后，傳代培養(yǎng)細(xì)胞同時每兩天用角質(zhì)形成細(xì)胞-sfm培養(yǎng)基(5％fbs，2mmnac，0.2mm抗壞血酸，0.09mm鈣，5ng/mlregf，5μg/ml胰島素，10ng/mlbfgf和74ng/ml氫化可的松)替換培養(yǎng)基，由此分離脂肪組織衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞。

實施例2：實驗組的構(gòu)成和每種賦形劑的ph測量

2-1：實驗組的構(gòu)成

在4℃冷藏儲存通過實施例1的方法分離的四種不同的脂肪細(xì)胞干細(xì)胞，并分析用于冷藏制劑細(xì)胞治療注射產(chǎn)品的干細(xì)胞的存活率。

表1

將四種分離的脂肪細(xì)胞干細(xì)胞用于構(gòu)成如表1所示的實驗組。構(gòu)成了包含0.3％白蛋白的干細(xì)胞對照組、包含0.3％白蛋白+10％自體血清的實驗組、包含0.3％白蛋白+10％同種異體血清的實驗組、包含0.3％白蛋白+20％自體血清的實驗組、包含0.3％白蛋白+20％同種異體血清的實驗組、包含0.3％白蛋白+30％自體血清的實驗組和包含0.3％白蛋白+30％同種異體血清的實驗組，并分析了其存活率。

2-2：每種賦形劑的ph值

在本實施例中分析了用于改善干細(xì)胞儲存穩(wěn)定性的組合物的每種賦形劑的ph。

ph是氫離子濃度的數(shù)值，且一般鹽水的ph具有約5.5-8.0的寬范圍。當(dāng)將白蛋白和人血清添加至鹽水時，與pbs比較了ph變化。正常健康狀態(tài)中的ph意為其中細(xì)胞、血液、體液等保持在弱堿性的情況。

對于ph分析，通過orionstara111(thermoscientificinc.)分析了包含在用于改善干細(xì)胞儲存穩(wěn)定性的組合物中的白蛋白和人血清的ph變化。此外，由于ph受溫度影響，在20℃-24℃范圍的室溫測量了ph。

表2

ph測量(sa:鹽水+0.3％白蛋白)

結(jié)果是，可從表2確認(rèn)當(dāng)僅添加白蛋白時，ph僅略微增加，但當(dāng)添加人血清時，維持在弱堿性ph。

此后，對此，在實施例3中分析了懸浮于包含0.3％白蛋白的鹽水中的干細(xì)胞對照組、懸浮于分別包含10、20和30％自體人血清和0.3％白蛋白的鹽水的干細(xì)胞實驗組和懸浮于分別包含10、20和30％同種異體人血清和0.3％白蛋白的鹽水的干細(xì)胞實驗組的活力。

實施例3：依賴于時間的干細(xì)胞的大小和性質(zhì)分析

用pbs洗滌通過實施例1的方法分離的脂肪細(xì)胞干細(xì)胞，并懸浮于包含0.3％白蛋白的鹽水中。隨后，分別向其中添加10％、20％和30％自體人血清和同種異體人血清，由此獲得的細(xì)胞構(gòu)成實施例2的對照組和實驗組。

將具有1.0x10⁷個細(xì)胞/ml濃度的每實驗組的干細(xì)胞填充在3cc注射器中并在4℃冷凍儲存。0、24、48、72、96、120和144小時后，分析了在冷藏制劑細(xì)胞治療注射產(chǎn)品中使用的干細(xì)胞的大小和性質(zhì)。

3-1：自體血清實驗組

對于細(xì)胞1，制備了其中0.5x10⁷個干細(xì)胞懸浮于包含0.3％白蛋白鹽水中的對照組，和其中0.5x10⁷個干細(xì)胞懸浮于分別包含10、20和30％自體血清/0.3％白蛋白的三個干細(xì)胞實驗組。

對于細(xì)胞2，制備了其中1.0x10⁷個干細(xì)胞懸浮于包含0.3％白蛋白鹽水中的對照組，和其中1.0x10⁷個干細(xì)胞懸浮于分別包含10、20和30％自體血清/0.3％白蛋白的三個干細(xì)胞實驗組。

將細(xì)胞1的對照組和三個實驗組的全部的干細(xì)胞和細(xì)胞2的對照組和三個實驗組的全部的干細(xì)胞填充在3cc注射器中，并在4℃冷凍儲存。0、24、48、72、96、120和144小時后，分析了細(xì)胞的大小和性質(zhì)及總細(xì)胞數(shù)。通過使用countess^tmautomatedcellcounter(invitrogen)分析干細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)和大小，并用裸眼分析其性質(zhì)。

表3

表4

表5

表6

其結(jié)果示于表3(細(xì)胞1的細(xì)胞數(shù))、表4(細(xì)胞1的大小)、表5(細(xì)胞2的細(xì)胞數(shù))和表6(細(xì)胞2的大小)。

如表3-6所示，對照組的細(xì)胞大小減少約15-25％；同時，包含自體人血清的實驗組的細(xì)胞大小減少約3-10％，由此在包含自體人血清的實驗組中細(xì)胞大小的變化并不顯著。同時，未觀察到對照組和實驗組的細(xì)胞性質(zhì)的變化，且在對照組和實驗組間總細(xì)胞數(shù)不存在差異。

3-2：同種異體血清實驗組

對于細(xì)胞3，分別制備了其中0.5x10⁷個干細(xì)胞懸浮于包含0.3％白蛋白的鹽水中的對照組和其中0.5x10⁷個干細(xì)胞懸浮于包含10、20和30％同種異體血清/0.3％白蛋白的鹽水中的三個干細(xì)胞實驗組。

對于細(xì)胞4，分別制備了其中1x10⁷個干細(xì)胞懸浮于包含0.3％白蛋白的鹽水中的對照組和其中1x10⁷個干細(xì)胞懸浮于包含10、20和30％同種異體血清/0.3％白蛋白的鹽水中的三個干細(xì)胞實驗組。

將細(xì)胞3的對照組和三個實驗組的全部的干細(xì)胞和細(xì)胞4的對照組和三個實驗組的全部的干細(xì)胞填充在3cc注射器中，并在4℃冷凍儲存。0、24、48、72、96、120和144小時后，分析了細(xì)胞的大小和性質(zhì)及總細(xì)胞數(shù)。通過使用countess^tmautomatedcellcounter(invitrogen)分析干細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)和大小，并用裸眼分析其性質(zhì)。

表7

表8

表9

表10

其結(jié)果示于表7(細(xì)胞3的細(xì)胞數(shù))、表8(細(xì)胞3的大小)、表9(細(xì)胞4的細(xì)胞數(shù))和表10(細(xì)胞4的大小)。

如表7-10所示，對照組的細(xì)胞大小減少約20％；同時，包含同種異體人血清的實驗組的細(xì)胞大小減少約3-10％，由此在包含同種異體人血清的實驗組中細(xì)胞大小的變化并不顯著。同時，未觀察到對照組和實驗組的細(xì)胞性質(zhì)的變化，且在對照組和實驗組間總細(xì)胞數(shù)不存在差異。

實施例4：干細(xì)胞依賴于時間的存活率分析

通過與實施例3相同的條件分析了依賴于時間的干細(xì)胞的存活率。

用pbs洗滌分離的脂肪細(xì)胞干細(xì)胞，并懸浮于包含0.3％白蛋白的鹽水中。隨后，向其中分別添加10％、20％和30％自體人血清和同種異體人血清，由此獲得的細(xì)胞分別構(gòu)成對照組和實驗組。將具有1.0x10⁷個細(xì)胞/ml濃度的每個實驗組的干細(xì)胞填充在3cc注射器中并在4℃冷凍儲存。0、24、48、72、96、120和144小時后，分析了在冷藏制劑細(xì)胞治療注射產(chǎn)品中使用的干細(xì)胞的存活率。通過以1:1的比率混合細(xì)胞和臺盼藍(lán)溶液測量干細(xì)胞的存活率并通過countess^tmautomatedcellcounter(invitrogen)分析。

結(jié)果是，在包含人血清的組合物中，確認(rèn)了存活率高且細(xì)胞數(shù)并不顯著變化，隨血清濃度的增加，存活率也增加，且相比僅包含0.3％白蛋白的對照組，細(xì)胞穩(wěn)定性的保留期也變得更長。(圖1、2、3和4)。

具體而言，確認(rèn)了作為包含30％血清的干細(xì)胞的實驗組3維持在98％或更多的顯著高的存活率直至144小時，且即使是包含10-20％血清的實驗組，也展現(xiàn)90％或更多的顯著高的存活率直至72小時。此外，在自體血清實驗組(圖1和2)和同種異體血清實驗組(圖3和4)間依賴于細(xì)胞的保留時間的存活率效果不存在差異。

因此，確認(rèn)了通過人血清用于改善干細(xì)胞的儲存穩(wěn)定性的組合物可維持144小時或更長的長期存活率，且在自體血清和同種異體血清間效果不存在差異。

實施例5：新實驗組的構(gòu)成

確認(rèn)實施例中自體血清和同種異體血清間效果不存在差異后，構(gòu)成實驗組以檢查依賴于每種血清濃度和血漿的細(xì)胞穩(wěn)定性。

對照組(sa:鹽水+0.3％白蛋白)和六個包括不同血清濃度(10-50％)或血漿(prp)的實驗組示于表11，并測量其細(xì)胞冷凍儲存穩(wěn)定性直至第9天。

表11

5-1：干細(xì)胞

通過實施例1的方法分離的兩種不同的脂肪細(xì)胞干細(xì)胞在4℃冷凍儲存，并分析了用于冷藏制劑細(xì)胞治療注射產(chǎn)品的干細(xì)胞的存活率。

將對應(yīng)的干細(xì)胞制備成4.9x10⁸個細(xì)胞的含量(具體地，1.0x10⁷個細(xì)胞/ml的數(shù)目為49)。融化兩次傳代培養(yǎng)的細(xì)胞(在5t175燒瓶中融化的6.0x10⁶個細(xì)胞)，并培養(yǎng)(將3次傳代培養(yǎng)的4.9x10⁷個細(xì)胞在49t175燒瓶中培養(yǎng))，并在第四次傳代培養(yǎng)時回收細(xì)胞(4.9x10⁸個細(xì)胞)，并填充和實驗。

將在第四次傳代培養(yǎng)回收的細(xì)胞分成7管，每管具有7.0x10⁷個細(xì)胞，并與示于表11的7種防腐劑(7ml)混合。隨后，對于每個實驗組(防腐劑)，在第0、1、2、3、5、7和9天，將細(xì)胞填充在7個注射器(3cc)中，每個注射器具有1ml細(xì)胞。對于第0天的樣品，直接測量細(xì)胞數(shù)、存活率和細(xì)胞大小，且對于剩余樣品，在冷凍儲存1、2、3、5、7和9天后測量細(xì)胞數(shù)、存活率和細(xì)胞大小cedex。

5-2：血清和血漿

為分離血清，通過使用不包含抗凝血劑的血液收集管收集血液(10ml)并直立放置于冷藏狀態(tài)10分鐘。在1000rcf關(guān)閉制動實施離心15分鐘以去除纖維蛋白，且隨后，回收血清(為分離的上清)。回收的血清置于1700rpm關(guān)閉制動離心5分鐘，收集上清并通過使用0.2μm注射器過濾器滅菌制備。

為分離血漿，將抗凝血劑(2cc)注射入注射器(20cc)，并收集血液。隨后，通過dr.prp試劑盒首先分離血漿和紅細(xì)胞，隨后在3200rpm離心6分鐘，以凝結(jié)血小板，并二次分離剩余的材料。二次分離后，用10cc注射器以其中prp(包含血小板的血漿)和ppp(不包含血小板的血漿)得以分離的狀態(tài)緩慢去除上述ppp(4ml)，并充分混合剩余的prp(4ml)待用。

5-3：賦形劑的ph

如實施例2-2中實踐，對于每個實驗組，分析了用于改善干細(xì)胞儲存穩(wěn)定性的組合物的賦形劑的ph。

對于ph分析，通過orionstara111(thermoscientificinc.)分析包含在用于改善干細(xì)胞儲存穩(wěn)定性的組合物中的白蛋白和人血清的ph的變化。

表12

ph測量(sa:鹽水+0.3％白蛋白)

結(jié)果是，包含向其中添加血清的干細(xì)胞儲存穩(wěn)定劑的平均ph值測量為8.2，且通過使用8.4％碳酸氫鈉(nahco3)作為ph緩沖劑的鹽水(ph＝7.3)的ph確定為8.2。在血漿的情況中，由于量顯著小，不可能測量ph。

實施例6：干細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)、存活率和大小依賴于時間的變化

用pbs洗滌通過實施例1的方法分離的脂肪細(xì)胞干細(xì)胞，并通過與實施例5-1相同的方法制備。如表11所示按對照組和六個實驗組構(gòu)成兩種脂肪細(xì)胞干細(xì)胞，并檢查其細(xì)胞數(shù)、存活率和細(xì)胞大小直至第9天。

結(jié)果是，確認(rèn)了不包含血清或血漿的對照組(sa:鹽水+0.3％白蛋白)維持約80％存活率直至第3天。然而，包含10％血漿或10％血清的實驗組相比于對照組展現(xiàn)增加至多50％或更多的存活率(圖5和6)。

確認(rèn)了當(dāng)血清濃度為50％時，細(xì)胞存活率最高，但在包含30％血清的實驗組中，展現(xiàn)90％或更高的細(xì)胞存活率直至第9天(圖5和6)。

因此，確認(rèn)了當(dāng)通過使用包含血清或血漿的防腐劑冷凍儲存干細(xì)胞時，干細(xì)胞的儲存穩(wěn)定性得以改善，由此可長期儲存干細(xì)胞而不改變細(xì)胞數(shù)、存活率和細(xì)胞大小。

實施例7：干細(xì)胞儲存穩(wěn)定劑的比較

如在實施例6中的干細(xì)胞#1(圖5)和干細(xì)胞#2(圖6)的存活率分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞1和細(xì)胞2間很少顯示差異，且因此，在實施例7中分析了每種穩(wěn)定劑對于細(xì)胞1的效果。

ph為對干細(xì)胞的儲存穩(wěn)定劑具有影響的因素之一，為檢查其影響，將碳酸氫鈉(nahco3)用作ph緩沖劑，且穩(wěn)定劑的ph確定為8.2。結(jié)果是，對照組(sa:鹽水+0.3％白蛋白)的細(xì)胞存活時間最多為1天(圖7)。因此，發(fā)現(xiàn)確定ph為8.2的穩(wěn)定劑對細(xì)胞穩(wěn)定性的促進無效果。

接下來，相互比較了血清和血漿的效果。應(yīng)當(dāng)理解的是，相比于對照組，在包含10％血清或10％血漿的穩(wěn)定劑中，存活率增加至多50％或更多，且確認(rèn)了血清和血漿間無顯著差異，但展現(xiàn)了穩(wěn)定性的相似趨勢(圖8)。

為理解包含在穩(wěn)定劑中的白蛋白的效果，檢查了使用30％血清/鹽水和30％血清/sa(鹽水+0.3％白蛋白)的干細(xì)胞的儲存穩(wěn)定性。結(jié)果是，確認(rèn)了當(dāng)包括0.3％白蛋白時，細(xì)胞穩(wěn)定性略微更高(圖9)。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是兩個實驗組間的差異直至第9天無顯著差異，由此混合血清和白蛋白對穩(wěn)定劑的效果無顯著影響。

因此，通過增加血清濃度作為用于改善儲存穩(wěn)定劑的效果的方法比較了干細(xì)胞的儲存穩(wěn)定性。通過測量將血清/sa(鹽水+0.3％白蛋白)實驗組中的血清濃度增加至10、30和50％后獲得的結(jié)果是，包含50％血清的穩(wěn)定劑展現(xiàn)最高的存活率。此外，確認(rèn)了即使在包含10％血清的穩(wěn)定劑中，80％或更高的存活率維持了7天，且即使在包含30％血清的穩(wěn)定劑中，90％或更高的非常高的存活率展現(xiàn)了9天(圖10)。該確認(rèn)表明血清對于維持冷藏狀態(tài)的細(xì)胞的存活率具有顯著功能。

工業(yè)實用性

根據(jù)本發(fā)明的用于促進干細(xì)胞的冷凍儲存穩(wěn)定性的組合物能夠維持超過90％的存活率持續(xù)至少9天而不改變干細(xì)胞的數(shù)目和干細(xì)胞的性質(zhì)和大小，其可用于供細(xì)胞療法使用的干細(xì)胞的長期運輸和具有良好效果的細(xì)胞治療注射產(chǎn)品的制備。

本發(fā)明的具體實施方案如上文詳細(xì)說明。然而，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是具體的描述僅為理想的示例性實施方案且不應(yīng)理解為是對本發(fā)明保護范圍的限制。因此，本發(fā)明實質(zhì)性的保護范圍通過附加的權(quán)利要求及其等同進行限定。