本發(fā)明屬于植物雜交育種技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種相思樹(shù)花粉離體培養(yǎng)活力檢測(cè)的技術(shù)。

背景技術(shù)：

相思樹(shù)（Acacia confusa）屬含羞草科(Mimosaceae)金合歡屬(Acacia)植物，自然分布于澳大利亞昆士蘭、巴布亞新幾內(nèi)亞及印度尼西亞等濕潤(rùn)熱帶地區(qū)。相思樹(shù)具有生長(zhǎng)迅速、樹(shù)冠濃密、落葉量多、根瘤固氮及耐干燥瘠薄的特性，材質(zhì)優(yōu)良，可用作紙漿材、建筑材、家具用材等。我國(guó)自上世紀(jì)60、70年代引種相思樹(shù)以來(lái)，相思樹(shù)樹(shù)種的良種選育與栽培研究一直受到重視，不僅成功篩選出各地適生種源，選育出一批優(yōu)良家系和無(wú)性系，也系統(tǒng)掌握了采種、育苗、造林、撫育管理等一套成熟的栽培技術(shù)，取得了豐碩成果。并在海南、廣東、廣西等地營(yíng)建了多個(gè)相思樹(shù)種子園，旨在為相思樹(shù)推廣提供高質(zhì)量的種子。然而，現(xiàn)存的一些問(wèn)題制約了種子園的產(chǎn)量和質(zhì)量。例如極端氣候異常導(dǎo)致的寒害、人工授粉很難開(kāi)展、結(jié)莢率低下等原因，使種子園不能夠有效地發(fā)揮其應(yīng)有的功能，極大地限制了相思樹(shù)長(zhǎng)期可持續(xù)發(fā)展及研究利用。因此，開(kāi)展相思樹(shù)植物的生殖生物學(xué)領(lǐng)域的研究顯得尤為緊迫。

花粉生活力是花粉具有存活、生長(zhǎng)、萌發(fā)或發(fā)育的能力。在農(nóng)業(yè)和林業(yè)的常規(guī)育種中,為了進(jìn)行人工輔助授粉或雜交授粉，需要早期采集和貯存花粉。在使用采集和貯存花粉之前,通常要做花粉生活力的鑒定。因此，掌握花粉生活力檢測(cè)的方法對(duì)于提高植物育種效率具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

花粉萌發(fā)率是鑒定花粉生活力的一項(xiàng)重要指標(biāo)。提取花粉在培養(yǎng)基上萌發(fā)，在光學(xué)顯微鏡下用常規(guī)方法觀察花粉的萌發(fā)率，以此作為花粉生活力的標(biāo)準(zhǔn)。不同植物花粉萌發(fā)所需要的培養(yǎng)基成分、濃度和培養(yǎng)的環(huán)境條件不同。離體萌發(fā)測(cè)定法可以直觀區(qū)分死亡或缺乏活力的花粉，數(shù)據(jù)科學(xué)可靠，并可完全定量，對(duì)于許多植物都與結(jié)實(shí)和種子形成有相關(guān)性，故仍為目前雜交育種中花粉生活力測(cè)定的首選方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)相思樹(shù)雜交育種花粉活力檢測(cè)的需要，提供一種相思樹(shù)花粉離體培養(yǎng)活力檢測(cè)的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

本發(fā)明是利用植物花粉在適宜的培養(yǎng)基中，活力強(qiáng)的花粉可發(fā)芽，活力小的花粉不發(fā)芽或發(fā)芽率低這一原理，通過(guò)采集發(fā)育良好的相思樹(shù)花序，將花粉播于配制好的液體培養(yǎng)基中，在一定的條件下讓其發(fā)芽，一定時(shí)間后在光學(xué)顯微鏡下用常規(guī)方法觀察花粉的發(fā)芽率，從而檢測(cè)出相思樹(shù)花粉的活力。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種相思樹(shù)花粉離體培養(yǎng)活力檢測(cè)方法，包括液體培養(yǎng)基的配制、花枝采摘、花粉播種、培養(yǎng)、光學(xué)顯微鏡觀察計(jì)數(shù)發(fā)芽花粉等工序；在相思樹(shù)花開(kāi)時(shí)節(jié)，采集含有多穗新鮮花序的花枝，從花枝上摘取當(dāng)日開(kāi)放的新鮮花序分切成多段，以水沉法播種，在一定的溫度、濕度、富氧環(huán)境條件下培養(yǎng)使其發(fā)芽，具體操作步驟如下：

(1)液體培養(yǎng)基的配制：用蔗糖、硼酸、硝酸鈣、去離子水按一定的濃度混合均勻；

(2)花枝采摘：剪取有多穗已全面開(kāi)放花序的新鮮花枝，下端插入裝有清水的小桶，拿回試驗(yàn)室備用；

(3)花粉播種：取凹玻片平放于桌面，用滴管取配制好的培養(yǎng)基2～3滴滴于凹玻片的凹槽內(nèi)，用鑷子摘取花序以水沉法播種，播種后不蓋蓋玻片；

(4)花粉培養(yǎng)：取干凈大號(hào)培養(yǎng)皿，底部墊上濾紙，滴入去離子水將濾紙浸濕，將凹玻片平放入培養(yǎng)皿中，置于一定環(huán)境條件下培養(yǎng)；

(5)光學(xué)顯微鏡觀察：培養(yǎng)一定時(shí)間后將凹玻片置于光學(xué)顯微鏡下用常規(guī)方法觀察花粉發(fā)芽狀況。

以上所述的液體培養(yǎng)基的組分和體積質(zhì)量濃度是：蔗糖15%～20%，硼酸100mg/L～150 mg/L，硝酸鈣0.25 mmol/L～0.5mmol/ L，其余為水。

以上所述花序是指長(zhǎng)在花枝上的一穗花，一個(gè)花序通常含有近百朵小花。

以上所述新鮮花枝是于早上7點(diǎn)鐘前采集，花枝上有多穗花序于當(dāng)日凌晨全面開(kāi)放且未被訪花昆蟲(chóng)采訪的花枝。

以上所述的水沉法播種是指從花枝上摘下當(dāng)日開(kāi)放的新鮮花序，分切成多段，用鑷子斷取約有6～9朵小花的花序段，在液體培養(yǎng)基中涮1圈，花粉粒自然沉入液體培養(yǎng)基中。

以上所述的環(huán)境條件是讓培養(yǎng)基中的花粉與空氣直接接觸而富氧，并控制溫度26℃～30℃，濕度85%～90%。

以上所述光學(xué)顯微鏡下用常規(guī)方法觀察是在花粉培養(yǎng)8小時(shí)后進(jìn)行檢測(cè)。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有的技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明相思樹(shù)花粉離休培養(yǎng)活力檢測(cè)方法，播種時(shí)用鑷子取花序的一段或多段在液體培養(yǎng)基上涮一圈，花粉粒直接沉落于液體培養(yǎng)基中，解決了相思樹(shù)花粉離體培養(yǎng)時(shí)花粉細(xì)小、不易收集、播種不均勻這一難題。

2、本方法采用的液體培養(yǎng)基中含有15%～20%蔗糖、100mg/L～150mg/L的硼酸和0.25 mmol/L～0.5mmol/L硝酸鈣配制而成，液體穩(wěn)定可靠，特別適合相思樹(shù)花粉離休培養(yǎng)。

3、花粉播種后，不蓋蓋玻片，保證微環(huán)境內(nèi)有充足的氧氣供應(yīng)，相思樹(shù)花粉能夠正常發(fā)芽，而常規(guī)操作播種后蓋上蓋玻片對(duì)于相思樹(shù)花粉而言不能發(fā)芽。這一操作要點(diǎn)解決了相思樹(shù)花粉離體培養(yǎng)發(fā)芽關(guān)鍵技術(shù)。

4、本方法對(duì)相思樹(shù)花粉離休培養(yǎng)和活力檢測(cè)，具有播種花粉多而且均勻、檢測(cè)結(jié)果、方法簡(jiǎn)單、可操作性強(qiáng)特特點(diǎn)，數(shù)據(jù)科學(xué)可靠，并可完全定量，對(duì)于提高相思樹(shù)育種效率具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，可有效解決現(xiàn)有相思樹(shù)種子園自然結(jié)莢率低的問(wèn)題，提高種子園的產(chǎn)量和質(zhì)量，使種子園能夠有效地發(fā)揮其應(yīng)有的功能，極大地發(fā)揮相思樹(shù)樹(shù)種的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和生態(tài)效益。

附圖說(shuō)明

圖1：馬占相思花粉培養(yǎng)1.5小時(shí)圖片；

圖2：馬占相思花粉培養(yǎng)4小時(shí)圖片；

圖3：馬占相思花粉培養(yǎng)6小時(shí)圖片；

圖4：馬占相思花粉培養(yǎng)8小時(shí)圖片。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例, 對(duì)本發(fā)明的相思樹(shù)花粉離體培養(yǎng)活力檢測(cè)的方法進(jìn)一步描述。

實(shí)施例1

在9月下旬馬占相思樹(shù)花開(kāi)時(shí)節(jié)，于7點(diǎn)前采集含有多穗當(dāng)日開(kāi)放花序的未被昆蟲(chóng)采訪的新鮮花枝，置于放有清水的小桶，帶回試驗(yàn)室備用；以20%蔗糖+150mg/L硼酸+0.25mmol/L硝酸鈣濃度配成液體培養(yǎng)基，滴3滴于凹玻片凹槽，取采集好分切成多段的2段花序，用鑷子夾好在培養(yǎng)基中涮1圈，不用蓋上蓋玻片，然后將凹玻片平放入墊有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，保持培養(yǎng)濕度為26℃，濕度為85%。培養(yǎng)1.5、4.0、6.0、8小時(shí)后，置于光學(xué)顯微鏡下用常規(guī)方法觀察花粉的發(fā)芽數(shù)量，光學(xué)顯微鏡圖片依次分別是圖1、圖2、圖3、圖4。

實(shí)施例2

在5月中旬紅豆相思樹(shù)花開(kāi)時(shí)節(jié)，于7點(diǎn)前采集含有多穗當(dāng)日開(kāi)放花序的未被昆蟲(chóng)采訪的新鮮花枝，置于放有清水的小桶，帶回試驗(yàn)室備用；采用15%蔗糖+100mg/L硼酸+0.5mmol/L硝酸鈣配成液體培養(yǎng)基，滴2滴于凹玻片凹槽，摘取新鮮花序分切成多段，用鑷子夾取3段在培養(yǎng)基中涮1圈，不用蓋上蓋玻片，然后將凹玻片平放入墊有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，保持培養(yǎng)濕度為28℃，濕度為88%，培養(yǎng)8小時(shí)后，置于光學(xué)顯微鏡下用常規(guī)方法觀察花粉的發(fā)芽數(shù)量。

實(shí)施例3

在10月上旬大葉直桿相思樹(shù)花開(kāi)時(shí)節(jié)，于7點(diǎn)前采集含有多穗當(dāng)日開(kāi)放花序的未被昆蟲(chóng)采訪的新鮮花枝，置于放有清水的小桶，帶回試驗(yàn)室備用；取18%蔗糖+130mg/L硼酸+0.35mmol/L硝酸鈣濃度配成液體培養(yǎng)基，滴2滴于凹玻片凹槽，取采集好分切成多段的3段花序，用鑷子夾好在培養(yǎng)基中涮1圈，不用蓋上蓋玻片，然后將凹玻片平放入墊有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，保持培養(yǎng)濕度為27℃，濕度為90%，培養(yǎng)8小時(shí)后，置于光學(xué)顯微鏡下用常規(guī)方法觀察花粉的發(fā)芽數(shù)量。

實(shí)施例4

在10月上旬厚莢相思樹(shù)花開(kāi)時(shí)節(jié)，于7點(diǎn)前采集含有多穗當(dāng)日開(kāi)放花序的未被昆蟲(chóng)采訪的新鮮花枝，置于放有清水的小桶，帶回試驗(yàn)室備用；取20%蔗糖+150mg/L硼酸+0. 5mmol/L硝酸鈣濃度配成液體培養(yǎng)基，滴2滴于凹玻片凹槽，取采集好分切成多段的3段花序，用鑷子夾好在培養(yǎng)基中涮1圈，不用蓋上蓋玻片，然后將凹玻片平放入墊有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，保持培養(yǎng)濕度為30℃，濕度為90%，培養(yǎng)8小時(shí)后，置于光學(xué)顯微鏡下用常規(guī)方法觀察花粉的發(fā)芽數(shù)量。