一種調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長的csrp3基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別提供了一種可以調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長的CSRP3基因cDNA序列及其克隆方法，該基因的cDNA序列如SEQIDNO.1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；應(yīng)用該基因可以通過對該基因的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行操作，為實(shí)現(xiàn)培育生長速度快、肌肉品質(zhì)好的綿羊品種奠定基礎(chǔ)，對養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)具有較高的指導(dǎo)意義。
【專利說明】-種調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長的CSRP3基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種可以調(diào)控小尾寒羊骨骼 肌生長的CSRP3基因及其在綿羊育種中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 羊肉肉質(zhì)細(xì)嫩，脂肪和膽固醇含量低，逐漸受到人們的青睞。隨著羊肉價(jià)格的逐漸 盤升，提高羊只生長速度、改善羊肉品質(zhì)對提高動(dòng)物生產(chǎn)者的經(jīng)濟(jì)效益、滿足廣大消費(fèi)者對 優(yōu)質(zhì)羊肉的需求具有重大意義。
[0003] CRP家族是UM結(jié)構(gòu)域蛋白中一類蛋白家族，有四個(gè)成員分別是CRPI、CRP2、CRP3、 TLP(Weiskirchen et al·，1995 ;Kirchner et al·，2001)，其中 CRP3 蛋白的編碼基因 CSRP3 (Cysteine and glycine-rich protein 3)特異性表達(dá)于心肌和骨豁肌中。CSRP3 基 因在肌肉生長發(fā)育過程中起重要作用，研究表明CSRP3基因（富含半胱氨酸蛋白3基因）又 叫肌肉特異性LIM蛋白（muscle LIM protein，MLP)是一個(gè)肌肉分化的正調(diào)節(jié)因子（Arber et al.，1994)。研究還發(fā)現(xiàn)該基因在骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中作用時(shí)期為快肌纖維的早期階段表 達(dá)調(diào)控，并且發(fā)現(xiàn)在增殖速度較慢的成肌細(xì)胞中高表達(dá)，因而認(rèn)為該基因可能具有影響成 肌細(xì)胞增殖而促進(jìn)肌細(xì)胞的分化的功能。另外，CRP3蛋白可以通過某種物理方式與肌肉組 織的螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH)轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生作用，這種作用具有高度的特異性，即CRP3蛋白 不與非肌肉組織的bHLH蛋白或其他成肌因子發(fā)生作用（Kong et al.，1997)，表明該基因具 有表達(dá)特異性。
[0004] 但到目前為止，尚未見到有關(guān)小尾寒羊CSRP3基因克隆和功能的研究報(bào)道，而其 對于肌肉生長和發(fā)育的調(diào)控作用更是未知。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于上述的原因，本發(fā)明提供了一種可以調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長的CSRP3基 因，其cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，全長899bp ;該序列中的開放閱讀框編碼氨基酸序列 如SEQ ID NO. 2所示，共編碼194個(gè)氨基酸；該基因具有調(diào)控骨骼肌生長的功能，應(yīng)用該基 因可以通過對該基因的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行操作，為實(shí)現(xiàn)培育生長速度快、肌肉品質(zhì)好的綿羊品 種奠定基礎(chǔ)，對養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)有較高的現(xiàn)實(shí)意義。
[0006] 本發(fā)明所提供的調(diào)控骨骼肌生長的CSRP3基因，CDNA序列如SEQ ID NO. 1所示， 其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，CSRP3的cDNA序列長899bp，該序列中的開放閱 讀框編碼194個(gè)氨基酸。
[0007] 上述的CSRP3基因是通過如下方法獲得的：
[0008] (1)小尾寒羊肌肉總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄：
[0009] 采用TRIzol法提取小尾寒羊肌肉組織總RNA，提取的總RNA用核酸蛋白分析儀進(jìn) 行檢測，要求總RNA吸光度0D260/280在1. 8至2. 0之間，并根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)采用TaKaRa公 司的RrimeScript? RT reagent Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈；
[0010] (2) CSRP3基因 cDNA序列保守區(qū)的擴(kuò)增：
[0011] 比對已有物種CSRP3基因的cDNA序列，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)上下游引物，以步驟（1) 中的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆測序得到保守區(qū)序列；
[0012] (3)應(yīng)用降落巢式PCR法對CSRP3基因 CDNA序列的3'端進(jìn)行擴(kuò)增：
[0013] 根據(jù)步驟（2)所得保守區(qū)序列設(shè)計(jì)CSRP3基因的3'特異性內(nèi)側(cè)和外側(cè)引物；
[0014] 以步驟⑴中提取的總RNA為模板，以O(shè)ligodT-AP為引物，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一 鏈模板；
[0015] 以3'特異性外側(cè)引物和3'通用外側(cè)引物采用降落PCR法以步驟⑶中cDNA第 一鏈為模板進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；
[0016] 以3'特異性內(nèi)側(cè)引物和3'通用內(nèi)側(cè)引物采用同樣降落PCR法，以第一輪PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；
[0017] 對第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆測序得到CSRP3基因 cDNA序列的：V端序列；
[0018] (4)應(yīng)用RACE法對CSRP3基因 cDNA序列的5'端進(jìn)行擴(kuò)增：
[0019] 以步驟（1)中提取的總RNA為模板依次進(jìn)行去磷酸化處理、"去帽子"反應(yīng)、接頭序 列連接反應(yīng)并以TaKaRa公司的5' -Full RACE Kit With TAP試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的 第一鏈；
[0020] 根據(jù)步驟（2)所得保守區(qū)序列設(shè)計(jì)CSRP3基因的5'特異性內(nèi)側(cè)和外側(cè)引物；
[0021] 以5'特異性外側(cè)和5'通用外側(cè)引物，以步驟⑷中得到的cDNA第一鏈為模板 進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；
[0022] 以5'特異性內(nèi)側(cè)和5'通用內(nèi)側(cè)引物，以第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二 輪PCR擴(kuò)增；
[0023] 對第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆測序得到CSRP3基因 cDNA序列的Y端序列；
[0024] (5)全長序列拼接及克隆測序驗(yàn)證：
[0025] 根據(jù)重疊區(qū)域?qū)ι鲜霾襟E獲得的cDNA的保守區(qū)、5'和3'所得序列進(jìn)行拼接， 獲得CSRP3基因的全長cDNA序列；設(shè)計(jì)兩端序列為上下游引物，PCR擴(kuò)增并克隆測序得到 CSRP3基因的全長cDNA序列，獲得了 CSRP3的cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，其編碼的氨 基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0026] 之后發(fā)明人利用qRT-PCR法測定CSRP3基因 cDNA序列在小尾寒羊心、肝、肌肉等 組織間的表達(dá)量，并最終發(fā)現(xiàn)CSRP3在心肌和背最長肌中的表達(dá)量均極顯著高于其他組織 (p〈0. 01)，表明該基因具有調(diào)控骨骼肌生長的功能。
[0027] 綜上所述，本發(fā)明提供了一種可以調(diào)控骨骼肌生長的CSRP3基因，該基因具有調(diào) 控骨骼肌生長的功能，應(yīng)用該基因可以通過對該基因的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行操作，為實(shí)現(xiàn)培育生 長速度快、肌肉品質(zhì)好的綿羊品種奠定基礎(chǔ)，具有較高的現(xiàn)實(shí)意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1為本發(fā)明中小尾寒羊CSRP3基因 cDNA保守區(qū)擴(kuò)增圖，
[0029] 圖中M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為CSRP3基因 cDNA保守區(qū)序列；
[0030] 圖2為本發(fā)明中小尾寒羊CSRP3基因:V端擴(kuò)增圖，
[0031] 圖中M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為CSRP3基因:V端序列；
[0032] 圖3為本發(fā)明中小尾寒羊CSRP3基因 Y RACE擴(kuò)增圖，
[0033] 圖中M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為CSRP3基因 Y端序列；
[0034] 圖4為本發(fā)明中小尾寒羊CSRP3基因 cDNA全長序列擴(kuò)增圖，
[0035] 圖中M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為CSRP3的全長cDNA序列；
[0036] 圖5為本發(fā)明中CSRP3基因 mRNA在小尾寒羊不同組織中表達(dá)水平柱狀圖，
[0037] 圖中a、b、c表示小尾寒羊各組織間的差異極顯著性（p〈0. 01);由圖可見CSRP3主 要在心肌和背最長肌中表達(dá)。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的上述
【發(fā)明內(nèi)容】
作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。應(yīng)理解，這些實(shí)施 例僅為了說明本發(fā)明而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0039] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照制造廠商所建議的實(shí)驗(yàn)條 件或常規(guī)方法，如Sambrook等編著的分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件。
[0040] 實(shí)施例I :背最長肌總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
[0041] 取小尾寒羊背最長肌2g，使用TIANGEN公司的RNAsimple Total RNA Kit總RNA 提取試劑盒（Cat. #DP419)提取肌肉組織的總RNA，具體操作參照試劑盒說明進(jìn)行；將提取 的 RNA 米用 TaKaRa 公司的 RrimeScript? RT reagent Kit (Cat. #RR037A)反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第一鏈，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0042] 實(shí)施例2 :cDNA保守區(qū)序列的克隆與測序
[0043] (1)引物的設(shè)計(jì)：從NCBI上下載人、豬、牛、鼠等各物種CSRP3基因的cDNA序列， 以DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行比對獲得保守區(qū)序列，設(shè)計(jì)該基因 cDNA的保守區(qū)引物為：上游引物 Fl :AATACGGAGCCTGCGAGAA，如 SEQ ID NO. 3 所示，和下游引物 Rl :
[0044] CCCCAAACCCAATACCTGTC，如 SEQ ID NO. 4 所示。
[0045] (2)PCR擴(kuò)增：以實(shí)施例1獲得的cDNA第一鏈為模板，應(yīng)用TIANGEN的PCR Master Mix (KT201)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體如下：

【權(quán)利要求】
1. 一種調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長的CSRP3基因，其特征在于：其cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CSRP3基因，其特征在于：其來源于綿羊的富含半胱氨酸蛋 白3基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的調(diào)控骨骼肌生長的CSRP3基因，在綿羊育種中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：通過調(diào)控CSRP3基因的表達(dá)，為培育生長 速度快、肌肉品質(zhì)好的綿羊品種提供科學(xué)依據(jù)。
【文檔編號】A01K67/027GK104212812SQ201410473378
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】王建民, 劉冠卿, 張賽賽, 晁天樂, 王桂芝, 紀(jì)志賓, 劉昭華, 侯磊 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)