一種甘薯脫毒苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種甘薯脫毒苗的制備方法，將薯塊曬種后與成熟的香蕉放在一起3-5天，然后將薯塊栽種在沙土中在培養(yǎng)箱中催芽，設(shè)置較高溫度。取芽苗頂端1-2cm長(zhǎng)，剪去肉眼可見的葉片，進(jìn)行表面消毒并用無(wú)菌水漂洗。剝?nèi)в衛(wèi)-2個(gè)葉原基的莖尖，接種到相應(yīng)培養(yǎng)基上，分別誘導(dǎo)不定芽的分化和體細(xì)胞胚胎發(fā)生。對(duì)再生植株進(jìn)行病毒檢測(cè)，無(wú)病毒苗經(jīng)繼代培養(yǎng)、煉苗、直接栽植塑料大棚后，大水漫灌。移栽最初2個(gè)周中午防止太陽(yáng)直曬，移栽3周后撒施尿素隨即澆水即獲得脫毒苗。本發(fā)明將脫毒試管苗經(jīng)馴化后直接栽植塑料大棚可明顯提高成活率，減少了操作程序，不需要經(jīng)過(guò)馴化室馴化的過(guò)程，節(jié)省人力物力財(cái)力。
【專利說(shuō)明】一種甘薯脫毒苗的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于甘薯苗培育【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種甘薯脫毒苗的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]甘薯是我國(guó)4大糧食作物之一，甘薯為無(wú)性繁殖作物，在栽培過(guò)程中易受病毒侵染，一旦感染就很難去除。病毒的積累可造成品種種性退化，品質(zhì)和產(chǎn)量降低，甚至失去商品價(jià)值，對(duì)甘薯生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。國(guó)內(nèi)外迄今尚無(wú)育出高抗病毒病的實(shí)用甘薯品種，也無(wú)防治病毒病的高效農(nóng)藥。病毒在植物體內(nèi)的分布是不均勻的，離根尖和莖尖越近，病毒的密度越低；反之，越高。
[0003]而分生組織一般無(wú)病毒侵染。莖尖(和根尖)分生組織之所以不帶病毒有如下原因，第一，病毒在植物體內(nèi)的傳播途徑一是通過(guò)維管系統(tǒng)，而分生組織中尚未形成維管系統(tǒng)；二是通過(guò)胞間連絲，但這條途徑病毒移動(dòng)速度非常緩慢，難以追趕上活躍生長(zhǎng)的分生組織。第二，在旺盛分裂的分生組織中，代謝活動(dòng)很高，使病毒無(wú)法進(jìn)行復(fù)制。第三，在莖尖中存在高水平內(nèi)源激素，可以抑制病毒的增殖。第四，在植物體內(nèi)存在有一種“病毒鈍化系統(tǒng)”，它在分生組織中的活性應(yīng)最高，因而使分生組織不受侵染。因此可以利用莖尖分生組織培養(yǎng)生產(chǎn)脫毒苗。但如果只取分生組織培養(yǎng)，往往不易成活。
[0004]利用甘薯莖尖培養(yǎng)生產(chǎn)脫毒苗已有研究和報(bào)道，但以往多用大田或溫室栽培的莖蔓上取材料剝?nèi)∏o尖；也有取無(wú)菌試管苗植株的莖尖作脫毒培養(yǎng)材料；還有用薯塊催芽取材料剝?nèi)∏o尖培養(yǎng)的， 但也是正常溫度條件下催芽。選用上述這些方法，在常規(guī)條件下生長(zhǎng)和培養(yǎng)，因供脫毒的材料生長(zhǎng)較慢，代謝不強(qiáng)，剝?nèi)∏o尖培養(yǎng)脫毒效果差，莖尖不好剝?nèi)?因葉原基節(jié)間短，葉原基擠在一起)，并且再生率低。
[0005]此外，脫毒試管苗馴化移栽非常重要，一般選用草炭土、蛭石、珍珠巖等作為移栽基質(zhì)，在馴化室中進(jìn)行馴化培養(yǎng)3周左右才能移栽塑料大棚或溫室。試管苗馴化培養(yǎng)耗費(fèi)大量人力物力財(cái)力，并且生長(zhǎng)緩慢、易染菌造成成活率降低。并且需經(jīng)過(guò)2次移栽，操作繁瑣。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種甘薯脫毒苗的制備方法，可以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的脫毒效果差，莖尖不好剝?nèi)。偕实?，脫毒苗馴化移栽操作繁瑣、成活率低、生長(zhǎng)慢的問(wèn)題。
[0007]為達(dá)到解決上述技術(shù)問(wèn)題的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
一種甘薯脫毒苗的制備方法，它包括以下步驟:
(1)選取無(wú)蟲蛀無(wú)損傷的甘薯薯塊，太陽(yáng)底下暴曬2飛天；
(2)將暴曬后的薯塊和成熟香蕉放在一起3-5天；
(3)將薯塊用清水洗凈，薯塊上覆蓋沙子，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽，溫度35~37°C;出芽前黑暗培養(yǎng)I周，出芽后，每日13小時(shí)光照，1000-20001x ；
(4)當(dāng)芽苗長(zhǎng)至10cm以上，取頂端1-2 cm長(zhǎng)，剪去肉眼可見的葉片，先用清水沖洗，然后進(jìn)行表面消毒，最后用無(wú)菌水漂洗3-5遍；
(5)在體視解剖鏡下剝?nèi)в?-2個(gè)葉原基的莖尖，接種到添加0.1-0.2mg/L NAA和1.0-2.0mg/L BAP的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為25_27°C，每日13小時(shí)光照，2000_30001x，培養(yǎng)3-4周，誘導(dǎo)不定芽的分化；
或?qū)⑺銮o尖接種到添加0.2-2.0mg/L 2,4-D的培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25-27°C，誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生；
(6)在添加0.1-0.2mg/L NAA和1.0-2.0mg/L BAP的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，當(dāng)再生小苗長(zhǎng)至2cm以上時(shí)，從基部切下，轉(zhuǎn)移至不添加激素的培養(yǎng)基中得完整脫毒苗；
或在添加0.2-2.0mg/L 2，4_D的培養(yǎng)基上培養(yǎng)4_5周后，外植體先后開始形成胚性愈傷組織和體胚，將形成體胚的外植體轉(zhuǎn)移到不添加激素的培養(yǎng)基中，促使體胚萌發(fā)形成脫毒苗；
(7)采用莖蔓切段方法快速繁殖獲得脫毒試管苗；
(8)脫毒試管苗的馴化:將試管苗繼代培養(yǎng)I個(gè)月，打開瓶口進(jìn)行馴化；
(9)脫毒試管苗的移栽:將試管苗洗凈培養(yǎng)基，分單株直接栽植于塑料大棚的土壤中，塑料大棚兩頭加防蟲網(wǎng)；
(10)脫毒試管苗栽植于大棚的土壤中后，先潑水，然后大水漫灌；
(11)脫毒試管苗移栽最初的2個(gè)周中午搭遮蔭網(wǎng)，防止太陽(yáng)直曬，2周后撤掉遮蔭網(wǎng)，中午放風(fēng)；
(12)移栽3周后，撒施尿素，隨即澆水，促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)；
(13)塑料大棚中脫毒苗的繁殖:當(dāng)莖蔓長(zhǎng)至30cm以上，剪切莖蔓栽植于塑料大棚中，進(jìn)行脫毒苗的再繁殖，每次剪蔓后，撒施尿素，隨即澆水，即獲得甘薯脫毒苗。
[0008]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
1、本發(fā)明將薯塊與成熟的香蕉放在一起處理3-5天，利用成熟香蕉釋放乙烯，促使薯塊早發(fā)芽，因?yàn)閯偸斋@的薯塊發(fā)芽慢，并且由于發(fā)芽慢而導(dǎo)致易爛薯。
2、本發(fā)明利用高溫催芽和莖尖培養(yǎng)相結(jié)合生產(chǎn)甘薯脫毒苗，催芽設(shè)置較高溫度(35-37°C)，依據(jù)病毒對(duì)高溫敏感，甘薯耐高溫(因?yàn)楦适硎菬釒鹪粗仓?，利用這一差異選擇適當(dāng)?shù)臏囟龋墒垢适眢w內(nèi)病毒濃度降低，傳遞速度減慢或失去活性，而甘薯分生組織細(xì)胞分裂加快，薯芽生長(zhǎng)加快。因此剝?nèi)〉那o尖脫毒效果好，并且由于葉原基節(jié)間拉長(zhǎng)，莖尖容易剝?nèi)?因葉原基節(jié)間拉長(zhǎng)，解剖鏡下容易看到分生組織，莖尖易剝?nèi)?，再生率高(因?yàn)檩^高溫度生長(zhǎng)代謝旺盛)。經(jīng)試驗(yàn)表明，在培養(yǎng)箱中催芽8-10天后薯塊開始出芽，11-13天后便可取材料剝?nèi)∏o尖。在解剖鏡下剝?nèi)∏o尖時(shí)，由于葉原基節(jié)間長(zhǎng)，很容易剝。通過(guò)器官發(fā)生途徑，莖尖再生植株的頻率達(dá)90%以上。
[0009]3、本發(fā)明秋天甘薯收獲后馬上進(jìn)行薯塊催芽、剝?nèi)∏o尖和培養(yǎng)，可以早早得到脫毒苗。經(jīng)試管快繁，第二年經(jīng)馴化后塑料大棚再繁殖直接栽種大田，減少了在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的時(shí)間，從而可避免因培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而造成的培養(yǎng)變異。因?yàn)槿绻@得再生的脫毒苗較晚時(shí)，第二年脫毒苗來(lái)不及種植大田，要等第三年才能種植大田，這樣在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的時(shí)間拉長(zhǎng)，容易產(chǎn)生基因突變。
[0010]4、將脫毒試管苗經(jīng)馴化后直接栽植塑料大棚可明顯提高成活率。以往都是先將小苗移栽于營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中置于馴化室，當(dāng)成活后再移栽塑料大棚或玻璃溫室。這個(gè)過(guò)程大約需要3周時(shí)間。而本發(fā)明是將小苗直接移栽于塑料大棚的土壤中，可避免移栽于基質(zhì)中容易染菌，成活率低的困難。因?yàn)橥寥乐械奈⑸锾幱谄胶鉅顟B(tài)，有益菌能抑制有害菌的繁衍。而在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中，由于試管苗較弱很易染菌，從而降低成活率。本發(fā)明成活率可達(dá)95%以上。
[0011]5、將脫毒試管苗直接移栽大棚，減少了操作程序，不需要經(jīng)過(guò)馴化室馴化的過(guò)程，節(jié)省人力物力財(cái)力。并且由于減少程序，直接在土壤中生長(zhǎng)，減少了移栽對(duì)小苗的影響。由于小苗直接種植土壤，根系伸展空間大，根深葉茂，根系發(fā)達(dá)，促使地上部分生長(zhǎng)快而健壯。移栽9天后小苗葉片已伸展，并已長(zhǎng)出新的葉片，3周后，主蔓已開始伸長(zhǎng)，并長(zhǎng)出側(cè)蔓，5飛周后莖蔓可長(zhǎng)到3(T40cm以上，可剪切莖蔓扦插進(jìn)行再繁殖。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1是本發(fā)明中由甘薯莖尖培養(yǎng)形成的愈傷組織上長(zhǎng)出的不定芽，左:商薯19 ；右:徐薯22。
[0013]圖2是本發(fā)明中由腋芽長(zhǎng)成的完整植株圖。
[0014]圖3是本發(fā)明中洗掉培養(yǎng)基后的脫毒試管苗。
[0015]圖4是本發(fā)明中脫毒苗移栽過(guò)程。
[0016]圖5是本發(fā)明中剛移栽于塑料大棚土壤中的脫毒苗。
[0017]圖6是本發(fā)明中塑料大棚上搭遮蔭網(wǎng)。
[0018]圖7是本發(fā)明中移栽9天后的脫毒苗。
[0019]圖8是本發(fā)明中移栽3周的脫毒苗。
[0020]圖9是本發(fā)明中移栽6周的脫毒苗。
[0021]圖10是本發(fā)明中由甘薯莖尖培養(yǎng)形成的胚性愈傷組織。
[0022]圖11是本發(fā)明中由胚性愈傷組織上形成的體細(xì)胞胚。
[0023]圖12是本發(fā)明中萌發(fā)的體細(xì)胞胚。
[0024]圖13是本發(fā)明中由體細(xì)胞胚萌發(fā)后長(zhǎng)成的脫毒試管苗。
[0025]圖14是本發(fā)明中高系14號(hào)脫毒苗結(jié)的薯塊。

【具體實(shí)施方式】
[0026]以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0027]實(shí)施例1
本發(fā)明所述甘薯脫毒苗的制備方法具體包括如下步驟:
1.甘薯薯塊催芽前的處理:
(I)秋天收獲后，選取當(dāng)前主要推廣甘薯品種徐薯22號(hào)、煙薯25、商薯19(市售品種)無(wú)蟲蛀、無(wú)損傷的薯塊，在太陽(yáng)底下暴曬2-3天(第一具有殺菌作用；第二能促進(jìn)薯塊萌芽)。
[0028](2)準(zhǔn)備成熟的香蕉，將暴曬后的薯塊和成熟香蕉放在一起放于塑料收藏箱中，蓋好蓋子，在實(shí)驗(yàn)室放置3-5天(室溫不低于13°C)(利用成熟香蕉釋放乙烯，促進(jìn)薯塊萌芽。因?yàn)閯偸斋@的薯塊發(fā)芽較慢，導(dǎo)致易爛薯)。
[0029]2.催芽:
將上述薯塊用清水洗凈，放入沙子中，薯塊上覆蓋厚度為l_2cm的沙子，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽。溫度設(shè)置35~37°C。(依據(jù)病毒對(duì)高溫敏感，因?yàn)楦适硎菬釒鹪粗仓辏愿适硎悄透邷刂参?，利用這一差異，本發(fā)明經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)選擇適當(dāng)?shù)母邷?，可使甘薯體內(nèi)病毒濃度降低，傳遞速度減慢，而甘薯分生組織細(xì)胞分裂加快，薯芽生長(zhǎng)加快。因此剝?nèi)〉那o尖脫毒效果好，并且由于葉原基節(jié)間拉長(zhǎng)，莖尖容易剝?nèi)。偕矢?。出芽前黑暗培養(yǎng)I周，出芽后，每日13小時(shí)光照，1000-20001X。根據(jù)沙子的濕度適量噴水，沙子中含水量不宜過(guò)大，否則易爛種。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8-10天后薯塊開始出芽，11~13天后有的芽苗長(zhǎng)已達(dá)到10cm。
[0030]3.莖尖剝?nèi)∨c培養(yǎng)
(I)材料的消毒:當(dāng)芽苗長(zhǎng)至10 Cm以上時(shí)，取頂端l-2cm長(zhǎng)，剪去肉眼可見的葉片，先用清水沖洗，然后在超靜工作臺(tái)內(nèi)用70%酒精浸泡10-20秒，再用質(zhì)量百分比為2%的次氯酸鈉溶液浸泡5分-7分鐘進(jìn)行表面消毒，最后用無(wú)菌水漂洗3-5遍。
[0031](2)莖尖剝?nèi)∨c培養(yǎng):在體視解剖鏡下剝?nèi)в?-2個(gè)葉原基的莖尖，接種到添加0.2mg/L NAA和2.0mg/L BAP的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)I周后莖尖開始形成愈傷組織，3-4周后開始從愈傷組織傷上形成不定芽，如圖1所示。不定芽形成頻率列于表1。3個(gè)供試品種莖尖形成不定芽的頻率均高于90%。
[0032]表1甘薯不同品種莖尖培養(yǎng)植株再生率

【權(quán)利要求】
1.一種甘薯脫毒苗的制備方法，其特征在于，它包括以下步驟: (1)選取無(wú)蟲蛀無(wú)損傷的甘薯薯塊，太陽(yáng)底下暴曬2飛天； (2)將暴曬后的薯塊和成熟香蕉放在一起3-5天； (3)將薯塊用清水洗凈，薯塊上覆蓋沙子，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽，溫度35~37°C;出芽前黑暗培養(yǎng)I周，出芽后，每日13小時(shí)光照，1000-20001x ； (4)當(dāng)芽苗長(zhǎng)至10cm以上，取頂端1-2 cm長(zhǎng)，剪去肉眼可見的葉片，先用清水沖洗，然后進(jìn)行表面消毒，最后用無(wú)菌水漂洗3-5遍； (5)在體視解剖鏡下剝?nèi)в?-2個(gè)葉原基的莖尖，接種到添加0.1-0.2mg/L NAA和1.0-2.0mg/L BAP的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為25_27°C，每日13小時(shí)光照，2000_30001x，培養(yǎng)3-4周，誘導(dǎo)不定芽的分化； 或?qū)⑺銮o尖接種到添加0.2-2.0mg/L 2,4-D的培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25-27°C，誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生； (6)在添加0.1-0.2mg/L NAA和1.0-2.0mg/L BAP的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，當(dāng)再生小苗長(zhǎng)至2cm以上時(shí)，從基部切下，轉(zhuǎn)移至不添加激素的培養(yǎng)基中得完整脫毒苗； 或在添加0.2-2.0mg/L 2，4_D的培養(yǎng)基上培養(yǎng)4_5周后，外植體先后開始形成胚性愈傷組織和體胚，將形成 體胚的外植體轉(zhuǎn)移到不添加激素的培養(yǎng)基中，促使體胚萌發(fā)形成脫毒苗； (7)采用莖蔓切段方法快速繁殖獲得脫毒試管苗； (8)脫毒試管苗的馴化:將試管苗繼代培養(yǎng)I個(gè)月，打開瓶口進(jìn)行馴化； (9)脫毒試管苗的移栽:將試管苗洗凈培養(yǎng)基，分單株直接栽植于塑料大棚的土壤中，塑料大棚兩頭加防蟲網(wǎng)； (10)脫毒試管苗栽植于大棚的土壤中后，先潑水，然后大水漫灌； (11)脫毒試管苗移栽最初的2個(gè)周中午搭遮蔭網(wǎng)，防止太陽(yáng)直曬，2周后撤掉遮蔭網(wǎng)，中午放風(fēng)； (12)移栽3周后，撒施尿素，隨即澆水，促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)； (13)塑料大棚中脫毒苗的繁殖:當(dāng)莖蔓長(zhǎng)至30cm以上，剪切莖蔓栽植于塑料大棚中，進(jìn)行脫毒苗的再繁殖，每次剪蔓后，撒施尿素，隨即澆水，即獲得甘薯脫毒苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘薯脫毒苗的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中暴曬后的薯塊和成熟香蕉放置的溫度不低于13°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘薯脫毒苗的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中覆蓋沙子的厚度為l_2cm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘薯脫毒苗的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中用70%酒精浸泡10-20秒，2%的次氯酸鈉溶液浸泡5分鐘-7分鐘進(jìn)行表面消毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘薯脫毒苗的制備方法，其特征在于:所述步驟(6)和(7)中培養(yǎng)條件均為溫度25-27°C，每日13小時(shí)光照，2000-30001x。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘薯脫毒苗的制備方法，其特征在于:所述步驟(8)中馴化的方法為:逐漸打開瓶口煉苗2-3天后，直至最終瓶口打開一半。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘薯脫毒苗的制備方法，其特征在于:所述步驟(9)和(13)中栽植的株間距為2(T25cm。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘薯脫毒苗的制備方法，其特征在于:所述步驟(12)和(13)中撒施尿素的施肥量為每 畝8~10斤。
【文檔編號(hào)】A01G1/00GK104067821SQ201410291953
【公開日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月26日
【發(fā)明者】王晶珊, 王鵬, 紀(jì)瑞瑞, 隋炯明, 喬利仙, 郭寶太, 孫世孟 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)