一株漸狹蠟蚧菌及其在防治作物線蟲和粉虱中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種漸狹蠟蚧菌及其在防治大豆胞囊線蟲上的應(yīng)用。該漸狹蠟蚧菌菌株為漸狹蠟蚧菌(Lecanicillium?attenuatum)HNLA1306，其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC?No.9220。該漸狹蠟蚧菌菌株發(fā)酵液對(duì)大豆孢囊卵孵化抑制明顯，對(duì)J2幼蟲具有強(qiáng)致死作用，其分生孢子對(duì)煙粉虱二齡幼蟲寄生效果好，可用于農(nóng)作物線蟲和煙粉虱的生物防治。
【專利說明】一株漸狹蠟蚧菌及其在防治作物線蟲和粉虱中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬微生物農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株用于防治作物線蟲和粉虱的漸狹蠟 蚧菌。

【背景技術(shù)】
[0002] 大豆孢囊線蟲?。℉eterodera glycines Ichinohe)是制約大豆生產(chǎn)的重要病 害之一，被稱為大豆的"癌癥"，其所造成的損失比任何一種單一病害所造成的損失都大 (ffrather J A,Anderson T R,Arsyad D M,Tan Y,Ploper L D,Porta-Puglia A,Ram Η H, Yorinori J T.Soybean disease loss estimates for the top ten soybean-producing countries inl998. Canadian Journal of Plant Pathology,2001,23(2) :115-121.)由 于迄今為止沒有發(fā)現(xiàn)對(duì)其具有明顯抗病性的種質(zhì)資源，大豆孢囊線蟲病仍然是農(nóng)業(yè)生產(chǎn) 中的世界性難題。大豆孢囊線蟲的防治主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，如二溴氯丙烷、二溴乙烷、呋 喃丹等，這些防治線蟲的化學(xué)農(nóng)藥多是高毒農(nóng)藥，長期大量使用造成了嚴(yán)重的農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥 殘留超標(biāo)和整個(gè)生態(tài)環(huán)境的污染。隨著生活水平的不斷提高，人們對(duì)食品安全和環(huán)境污 染問題越來越關(guān)注，大豆胞囊線蟲生物防治的理念漸漸被接受。大豆胞囊線蟲病的生物 天敵包括捕食線蟲的真菌、寄生性真菌和細(xì)菌等。其中，淡紫擬青霉的研究最多，且已形 成專利。煙粉風(fēng)（Bemisia tabaci)廣泛分布于除南極洲外各大洲90多個(gè)國家和地區(qū)， 已成為全球性的嚴(yán)重問題。煙粉虱的治理主要依賴化學(xué)藥劑，然而抗藥性發(fā)展迅速，其對(duì) 常用的大多數(shù)化學(xué)農(nóng)藥已產(chǎn)生高水平的抗性和交互抗性（Palumbo J C，Horowitz A R， Prabhaker N. Insecticidal control and resistance management for Bemisia tabaci. Crop Protection，2001，20 :739-765.)。鑒于此，尋求有效的防治煙粉虱的生物防治方法是 未來研究與發(fā)展的主要方向。蠟蚧菌是重要的蟲生真菌，對(duì)害蟲、病原真菌和線蟲都具有好 的寄生效果（Goettel M S，Koike M，Kim J J，Aiuchi D，Shinya R，Brodeur J. Potential of Lecanicillium spp. for management of insects, nematodes and plant diseases. Journal of Invertebrate Pathology，2008,98 :256-261.),該菌在西歐、蘇、美、中等許多 國家和地區(qū)已有廣泛研究和應(yīng)用。錯(cuò)階菌最早由Nivter于1861年在斯里蘭卡首次發(fā)現(xiàn)； Zi_ermann 于 1898 年最先將其定名為錯(cuò)階頭抱菌（Cephalosporium lecanii) ;Viegas 于1939年將其并入輪枝菌屬，并命名為錯(cuò)階輪枝菌（Verticillium lecanii) ;Gams和 Zare于2001年將錯(cuò)階菌從輪枝菌屬中析出，建立錯(cuò)階菌屬（Lecanillium)，現(xiàn)有約15個(gè) 種（Zare R, Gams ff. A revision of Verticillium section Prostrata. IV. The genera Lecanicillium andSimpliciIlium gen. nov. Nova Hedwigia, 2001,73 :1-50.) 〇 漸狹錯(cuò)階 茵（L.attenuatum)是Lecanillium屬中可寄生線蟲和粉風(fēng)的一種錯(cuò)階菌，其可有效寄生植 物線蟲的卵和雌蟲，以及粉虱的卵和若蟲。本發(fā)明針對(duì)這一農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要需求而研發(fā)，發(fā) 現(xiàn)一種毒殺大豆孢囊線蟲并可寄生粉虱的生防真菌，研究了該菌株的生物學(xué)特性和應(yīng)用技 術(shù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種漸狹蠟蚧菌，該菌株對(duì)大豆孢囊線蟲具有優(yōu)良生防效 果。
[0004] 為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種漸狹蠟蚧菌菌株，分類命名 Lecanicillium attenuatum，于2014年5月8日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì) 普通微生物中心CGMCC，單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研 究，所保藏編號(hào)：CGMCC No. 9220。
[0005] 本發(fā)明的基本技術(shù)方案為：將分離自中國海南文昌椰林土壤的蠟蚧菌，置培養(yǎng)皿 上培養(yǎng)，待長出菌絲后，經(jīng)菌落形狀形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)鑒定、ITS序列比對(duì)、系統(tǒng)發(fā)育 分析，確定該菌為漸狹蠟蚧菌。大量的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的漸狹蠟蚧菌菌株對(duì)大豆孢 囊線蟲控制效果超過85%，對(duì)煙粉虱若蟲的寄生率超過95%。具體包括下列步驟：
[0006] 1、漸峽蠟蚧菌的分離：將采自海南文昌椰子林土壤的蠟蚧菌置于備好的培養(yǎng)基 上，然后將培養(yǎng)皿置于27°C的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，定期觀察，將長出的菌絲挑至PDA培養(yǎng)基 上，囷絲長?兩后4 C保存以待鑒定；
[0007] 2、漸狹蠟蚧菌的菌落性狀和形態(tài)學(xué)鑒定：將菌株接種于PDA培養(yǎng)基平板上，27°C 培養(yǎng)，連續(xù)觀測(cè)菌株培養(yǎng)性狀和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，直至菌落長滿2/3平板，參照《昆蟲真菌學(xué)》的 檢索表進(jìn)行菌株的形態(tài)鑒定（蒲蟄龍，李增智.昆蟲真菌學(xué).合肥：安徽科學(xué)技術(shù)出版社， 1996.)；
[0008] 3、漸狹蠟蚧菌的分子生物學(xué)鑒定、ITS序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析：采用CTAB法提 取菌株總DNA，選用通用引物ITS1-F/ITS4-R，對(duì)ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，將測(cè)得的 ITS-rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，下載相關(guān)的ITS序列，生成系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化 樹；
[0009] 4、漸狹蠟蚧菌對(duì)碳氮源和溫度的需求特性：
[0010] 碳/氮源試驗(yàn)：用接種針蘸取適量菌株的孢子懸浮液，接種到碳/氮源培養(yǎng)基上 (分別以蔗糖或硝酸鈉作對(duì)照），將平板置于25°C的恒溫條件下培養(yǎng)，采用十字交叉法測(cè)量 菌落生長直徑；將整個(gè)菌落移入含玻璃珠的吐溫水中，渦旋震蕩獲得分生孢子懸浮液，血球 計(jì)數(shù)板測(cè)定菌株在不同碳/氮源培養(yǎng)基上的分生孢子產(chǎn)量。溫度試驗(yàn)：用接種針蘸取適量 孢子懸浮液，接種到PDA平板上，分別置19°C、23°C、27°C和29°C恒溫培養(yǎng)，菌絲生長和產(chǎn)孢 測(cè)定方法如上。
[0011] 5、漸狹蠟蚧菌對(duì)大豆孢囊線蟲卵孵化的抑制和幼蟲的毒殺作用：將漸狹蠟蚧茵的 發(fā)酵濾液原液和大豆孢囊線蟲卵或J2幼蟲懸浮液加入到24孔板中，以無菌水為對(duì)照，重復(fù) 3次，27°C培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)發(fā)酵濾液對(duì)卵孵化的抑制率和對(duì)幼蟲的毒殺率。
[0012] 6、漸狹蠟蚧菌對(duì)煙粉虱幼蟲的寄生效果：用小型噴霧器將孢子懸液噴在帶有煙粉 虱的黃瓜葉片上，對(duì)照為無菌水，每處理為3片葉，3次重復(fù)，光照培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)，鏡檢并 記錄被真菌感染死亡的蟲數(shù)，計(jì)算侵染率。
[0013] 本發(fā)明的有益效果和優(yōu)點(diǎn)是：本發(fā)明的漸狹蠟蚧菌菌株在多種碳氮源上均可正常 生長和產(chǎn)孢；菌株發(fā)酵濾液可有效抑制大豆孢囊線蟲卵的孵化，對(duì)幼蟲也具有很高的毒殺 效果；菌株分生孢子對(duì)煙粉虱二齡幼蟲寄生效果好；本發(fā)明的漸狹蠟蚧菌菌株在作物線蟲 和粉虱的生物防治上具有很大的應(yīng)用潛力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1 :是本發(fā)明的漸狹蠟蚧菌菌株的孢子梗及孢子的形態(tài)；
[0015] 圖2 :是基于rDNA-ITS序的菌株類群系統(tǒng)發(fā)育樹及相關(guān)類群系統(tǒng)發(fā)育樹；
[0016] 圖3 :是漸狹蠟蚧菌HNLA1306菌株發(fā)酵濾液對(duì)大豆孢囊線蟲卵孵化的影響；
[0017] 圖4 :是漸狹蠟蚧菌HNLA1306菌株發(fā)酵濾液對(duì)大豆孢囊線蟲二齡幼蟲的影響；
[0018] 圖5 :是漸狹蠟蚧菌HNLA1306菌株對(duì)煙粉虱二齡幼蟲的寄生效果。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 實(shí)施例1 :本發(fā)明的漸狹蠟蚧菌菌株的分離
[0020] 將采自古巴的感染蠟蚧菌的蚜蟲，經(jīng)3% NaCIO表面消毒后，將僵蟲置于備好的培 養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，即馬鈴薯200g (去皮，切塊煮沸30min，紗布過濾），葡萄 糖20g，瓊脂20g，加蒸餾水定容1000mL，121°C高溫滅菌30min。每個(gè)培養(yǎng)皿放置僵蟲3頭， 然后將培養(yǎng)皿置于27°C的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，定期觀察，將長出的菌絲挑至PDA培養(yǎng)基上， 囷絲長?兩后4 C保存以待鑒定。
[0021] 實(shí)施例2 :本發(fā)明的漸狹蠟蚧菌菌株的菌落性狀培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)鑒定
[0022] 將菌株接種于PDA培養(yǎng)基平板上，27°C培養(yǎng)，連續(xù)觀測(cè)菌株菌落形態(tài)、顏色和菌落 生長情況，直至菌落長滿2/3平板。該菌株在PDA培養(yǎng)基上10d后菌落白色，薄絮狀，背面 無色。采用玻片培養(yǎng)法，PDA培養(yǎng)基制成2cmX2cm的小薄片，將已活化的該菌菌絲挑于培養(yǎng) 基上，置于27°C恒溫培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)，在Olympus CX21BM-SET6顯微鏡系統(tǒng)連續(xù)觀察該菌 的分生孢子、瓶梗等的形成情況，測(cè)量并照相。該菌株分生孢子梗不發(fā)達(dá)，似營養(yǎng)菌絲，其上 有單生、對(duì)生或3-4個(gè)輪生的瓶梗（見圖1，A)，瓶梗纖細(xì)大小在8. 5-40X0. 8-2. 2 μ an之 間。分生孢子為圓柱形，兩端圓，單生，在瓶梗頂部聚成頭狀，大小2. 3-10 X 1. 0-2. 6 μ m (見 圖 1，B)。
[0023] 實(shí)施例3 :本發(fā)明的漸狹蠟蚧菌菌株的分子生物學(xué)鑒定、ITS序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育 分析米用 CTAB法提取菌株總DNA (Kim D H，Martyn R D，Magill C W. Restriction fragment length polymorphism groups and physical map of mitochondrial DNA from Fusarium oxysporum f.sp.niveum. Molecular Plant Pathology，1992,82:346-353·)。選用通用引 物 ITS1-F 和 ITS4-R(White T J，Bruns T，Lee S. Taylor JW. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In ：Innis M. eds. A PCR protocols ：a guide to methods and applications. New York,USA ：Academic Press, 1990,315-322.)，對(duì)ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序。PCR反應(yīng)體系（20uL):模板DNAluL、 PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific)、引物各 1 μ L，補(bǔ)充去離子水至 20 μ L。反應(yīng) 條件：94DC 4min ;94DC lmin，55DC 30s，72DC 90s，35 個(gè)循環(huán)；72DC 10min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1% 凝膠電泳檢測(cè)后送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。從菌株基因組中擴(kuò)增出 1條長551bp的ITS序列，將此序列與GenBank中已有核酸序列Blast比對(duì)，結(jié)果顯示， 該菌株的rDNA-ITS序列和L. attenuatum的相應(yīng)序列同源度為100 %。選擇GenBank中 Lecanicillium屬已公布的具代表性的6個(gè)菌株的DNA序列，用ClustalX匹配排列，以確定 該菌株與同屬其它種的親緣關(guān)系。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，該菌株與L attenuatum屬同一種（見 圖2)。Bootstrap值大于70 %就相當(dāng)于統(tǒng)計(jì)學(xué)概率的95%，一般75%以上認(rèn)為是可信的 (曹君正，武俠，林森.刀孢蠟蚧菌的鑒定及其對(duì)南方根結(jié)線蟲不同生活階段的定殖.中國 農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012,45:2404-2411·)。
[0024] 實(shí)施例4 :漸狹蠟蚧菌菌株對(duì)碳氮源和溫度的需求特性
[0025] 將蠟蚧菌的PDA平板置25°C恒溫培養(yǎng)7d，配制IX 106的孢子懸浮液。碳/氮源 試驗(yàn)：用接種針蘸取適量孢子懸浮液，接種到碳/氮源培養(yǎng)基上（分別以蔗糖或硝酸鈉作對(duì) 照），每種碳/氮源重復(fù)5個(gè)平板，置于25°C的恒溫條件下培養(yǎng)，連續(xù)觀察菌落的生長情況， 培養(yǎng)至第5d開始采用十字交叉法測(cè)量菌落生長直徑，每隔2d -直觀測(cè)到第13d。用刀片將 培養(yǎng)13d的菌落移入滅菌的含有玻璃珠的50mL吐溫水中，渦旋震蕩lmin，獲得分生孢子懸 浮液，每個(gè)平板為1次重復(fù)，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定菌株在不同碳/氮源培養(yǎng)基上的分生孢子產(chǎn) 量。溫度試驗(yàn)：用接種針蘸取適量孢子懸浮液，接種到PDA平板上，分別置19°C、23°C、27°C 和29°C恒溫培養(yǎng)，每個(gè)溫度重復(fù)5個(gè)平板，蠟蚧菌菌絲生長和產(chǎn)孢測(cè)定方法同上述的碳/氮 源試驗(yàn)。
[0026] 1、碳源
[0027] 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（氯化鉀0. 50g，七水硫酸亞鐵0. Olg，磷酸氫二鉀1. 0g，七水硫酸鎂 〇. 50g，硝酸鈉2g，蔗糖30g，瓊脂15g，水1000ml，pH自然）的基礎(chǔ)上，用等當(dāng)量的不同的碳 源取代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源。漸狹蠟蚧菌（L.attenuatum)HNLA1306菌株在麥芽糖上的菌 絲生長最好，其次是可溶性淀粉和蔗糖，葡萄糖、乳糖和甘油上的菌絲生長最差（見表1)。 方差分析結(jié)果顯示，HNLA1306菌株在麥芽糖上的菌絲生長顯著優(yōu)于其他供試碳源。菌落形 態(tài)觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，HNLA1306菌株在以乳糖為碳源的培養(yǎng)基中菌落質(zhì)地極其稀疏，邊緣不整齊，而 以麥芽糖為碳源培養(yǎng)基中菌落質(zhì)地較厚，菌絲較多。HNLA1306菌株在麥芽糖上的產(chǎn)孢量最 多，其次是蔗糖和葡萄糖，可溶性淀粉、甘油和乳糖上的產(chǎn)孢量最少（見表2)。方差分析結(jié) 果顯示，漸狹蠟蚧菌HNLA1306菌株在麥芽糖上的產(chǎn)孢量顯著高于其他供試碳源。
[0028] 表1不同碳源上漸狹蠟蚧菌（L. attenuatum)HNLA1306菌株的菌落生長特征
[0029]

【權(quán)利要求】
1. 一種漸狹錯(cuò)階菌，其特征為漸狹錯(cuò)階菌（Lecanicillium attenuatum)HALA1306, 其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC No.9220。
2. 權(quán)利要求1所述的一種漸狹蠟蚧菌菌株，其特征在于：所述漸狹蠟蚧菌菌株隸屬絲 孢目、蠟蚧菌屬；在PDA平板上菌落呈白色，薄絮狀，背面無色；分生孢子梗不發(fā)達(dá)，似營養(yǎng) 菌絲，其上有單生、對(duì)生或3-4個(gè)輪生的瓶梗，瓶梗纖細(xì)大小在8. 5-40X0. 8-2. 2 μ m之間； 分生孢子為圓柱形，兩端圓，單生，在瓶梗頂部聚成頭狀，大小2. 3-10X1. 0-2. 6 μ m。
3. 權(quán)利要求1所述的一種漸狹蠟蚧菌，其生物學(xué)特性在于：所述漸狹蠟蚧菌菌株在麥 芽糖上的菌絲生長最好，其次是可溶性淀粉和蔗糖，葡萄糖、乳糖和甘油上的菌絲生長最 差；在麥芽糖上的產(chǎn)孢量最多，其次是蔗糖和葡萄糖，可溶性淀粉、甘油和乳糖上的產(chǎn)孢量 最少；該菌株在有機(jī)氮源蛋白胨和酵母浸粉上的菌落生長相當(dāng)，顯著優(yōu)于無機(jī)氮源硝酸鉀、 硝酸鈉和硫酸銨；在有機(jī)氮源蛋白胨和酵母浸粉上的產(chǎn)孢量最高，其次是硫酸銨、硝酸鈉和 硝酸鉀，脲的產(chǎn)孢量最低；該菌株在19?29°C下均可生長，但是在23?27°C下的菌絲生長 顯著優(yōu)于低溫19°C和高溫29°C ;在27°C下的產(chǎn)孢量最多，其次是23°C和29°C，19°C最少。
4. 權(quán)利要求1所述的一種漸狹蠟蚧菌，其對(duì)大豆孢囊線蟲的效果在于：所述漸狹蠟蚧 菌菌株發(fā)酵原液和50倍稀釋液顯著抑制了大豆胞囊線蟲卵的孵化，孵化率分別為4. 8%和 6. 5%，顯著低于4mmol · I^Znc^溶液和無菌水處理；對(duì)大豆胞囊線蟲J2的致死率均顯著 高于無菌水對(duì)照，其中發(fā)酵原液和50倍稀釋液對(duì)J2在24h就表現(xiàn)出明顯的抑制作用，致死 率分別達(dá)86. 0%和45. 0%，遠(yuǎn)高于無菌水對(duì)照致死率6. 0%，至48h時(shí)后發(fā)酵原液和50倍 稀釋液對(duì)J2致死率分別超過95. 0%和50. 0%。
5. 權(quán)利要求1所述的一種漸狹蠟蚧菌，其對(duì)煙粉虱幼蟲的效果在于：所述漸狹蠟蚧菌 菌株的孢子懸液對(duì)煙粉虱2齡若蟲的累計(jì)致死率在接種6d內(nèi)快速增加，第8d和10d時(shí) 1. 0X107個(gè)?ml/1的孢子懸液對(duì)煙粉虱2齡若蟲的累計(jì)致死率分別達(dá)85. 0%和95. 0% ; 1. 0X106個(gè)?ml/1的孢子懸液對(duì)煙粉虱2齡若蟲的累計(jì)致死率分別達(dá)75.0%和85.0% ; 1. OX 105個(gè)· ml/1的孢子懸液對(duì)煙粉虱2齡若蟲的累計(jì)致死率分別達(dá)60. 0%和70. 0%。
【文檔編號(hào)】A01P5/00GK104195050SQ201410255857
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月11日
【發(fā)明者】張艷軍, 謝明, 尉文斌 申請(qǐng)人:張艷軍, 謝明